Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

Este método describe los pasos generales para el cultivo de pulgones y los pasos para el análisis genético de los pulgones. Estos métodos se pueden aplicar para responder preguntas clave en la evolución y ecología de los pulgones y los mecanismos moleculares que subyacen a la biología de los pulgones. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar generalmente a la mayoría de las especies de pulgones y se realiza a un costo relativamente bajo.

Comience llenando una bandeja de plántulas estándar con tierra de mezcla para germinación, teniendo cuidado de que la tierra llegue a la parte superior de los pozos. Cuando todos los pozos se hayan llenado, haga un hoyo de tres centímetros de profundidad en el suelo de cada pozo y coloque una semilla en cada hoyo. Riegue las celdas hasta que la tierra que cubre las semillas esté saturada y coloque la bandeja en un invernadero con riego diario o cada dos días, para mantener un nivel moderado de humedad del suelo.

Cuando las plántulas hayan crecido su primer conjunto de hojas completas, llene macetas redondas de cuatro pulgadas con tierra para macetas, hasta unos cinco centímetros por debajo de sus bordes. Cree un agujero en la tierra lo suficientemente profundo como para llegar al fondo de la maceta y recoja suavemente las plántulas maduras con la mano para colocarlas profundamente dentro de los agujeros de las nuevas macetas. Luego, cubra las plántulas con tierra y riegue las plántulas diariamente o cada dos días para mantener un nivel moderado de humedad en el suelo.

Cuando las plantas hayan crecido al menos tres o cuatro conjuntos de hojas completas y midan al menos diez centímetros de altura, inspeccione manualmente las plantas en busca de plagas no deseadas y use una pipeta bucal para transferir cuidadosamente un solo pulgón adulto recolectado en el campo de reproducción a la hoja de la primera planta para crear una línea isoclonal. Cuando todos los pulgones hayan sido transferidos, cubra firmemente las plantas con una jaula de taza hecha a medida y coloque las plantas infestadas de pulgones en una cámara de ambiente controlado. Para mantener las poblaciones de población, use una pipeta bucal para transferir de manera segura de una a tres ninfas de segundo o tercer estadio, y un pulgón adulto de edad, a una nueva planta semanalmente.

Y cubra cada planta con una nueva jaula de copa para el cultivo como se demuestra. Para la extracción de ADN de un solo pulgón adulto, coloque el pulgón cerca del fondo de un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros que contenga nitrógeno líquido y muela el pulgón con un mortero. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón de lisis al tubo de microcentrífuga y continúe moliendo el pulgón triturado hasta que la muestra se desintegre visiblemente.

Lave el mortero con 100 microlitros adicionales de tampón de lisis e incube el pulgón molido a 65 grados centígrados durante 30 minutos. Al final de la incubación añadir 14 microlitros de acetato potásico emulador al tubo e invertir para mezclar. Después de 30 minutos en hielo, recoja los restos celulares por centrifugación y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros sin alterar el pellet.

Agregue 200 microlitros de etanol frío 100 por ciento de grado molecular al sobrenadante e invierta el tubo para mezclar. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, recoja el ADN precipitado por centrifugación y elimine el etanol con una pipeta. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de etanol frío de grado molecular al 70 por ciento con un segundo lavado por centrifugación.

Y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de etanol fresco, frío y 100 por ciento de grado molecular. Después de la tercera centrifugación, coloque el tubo horizontalmente sobre un trozo de papel de seda para que se seque al aire durante cinco a diez minutos. Y resuspender el pellet de ADN en 80 microlitros de tris edta bajo.

Luego, cuantifique el ADN resuspendido en un espectrofotómetro y almacene la muestra restante a cuatro grados Celsius. Después de triturar hasta cinco pulgones adultos en nitrógeno líquido, como se ha demostrado, transfiera la muestra a una campana extractora y agregue 800 microlitros de reactivo de extracción de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio al tubo de muestra. Homogeneizar la muestra con un mortero e incubar el homogeneizado durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 160 microlitros de cloroformo a la muestra, seguido de 15 segundos de agitación vigorosa con la mano. Luego, incube la muestra durante dos o tres minutos a temperatura ambiente y centrifuga para recolectar el ARN extraído. Para precipitar el ARN, transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga libre de ARN sin perturbar la fase intermedia y agregue 400 microlitros de isopropanol al ARN.

Después de una incubación de diez minutos a 20 grados centígrados negativos, recoja el ARN precipitado por centrifugación. Luego, lave la muestra dos veces con un mililitro de etanol al 75 por ciento en agua tratada con pirocarbonato de dietilo, hasta la muestra con vórtice lento y centrifugación para eliminar cualquier contaminante de fenol. Después del segundo lavado, seque el pellet al aire durante cinco a diez minutos en un banco estéril y disuelva el pellet de ARN en 30 microlitros de agua ultrapura con un pipeteo suave antes de una incubación de diez a 15 minutos a 55 a 60 grados Celsius.

Las semillas tardarán aproximadamente de dos a cuatro semanas, dependiendo de la temporada, en crecer lo suficiente como para ser trasplantadas. Las plántulas trasplantadas tardarán otras dos a cuatro semanas en crecer hasta alcanzar un tamaño óptimo para el cultivo de pulgones. Los adultos se distinguen por una cauda oscurecida, y pueden ser alados o sin alas.

Las almohadillas alares en desarrollo se hacen visibles cuando las ninfas alcanzan el tercer estadio. Un solo adulto cerca de un ojo producirá aproximadamente de 100 a 200 nanogramos por microlitro de ADN y de 150 a 300 nanogramos por microlitro de ARN. A continuación, se puede calcular la expresión relativa de un gen candidato en diferentes condiciones de tratamiento.

Al intentar este procedimiento, es importante no contaminar sus existencias isoclonales. Además, recuerde que la calidad de sus pulgones depende en gran medida de la calidad de sus plantas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras extracciones y técnicas de secuenciación para responder a preguntas sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la biología de los pulgones.