Name: Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a mantener cultivos de Aphis nerii y medir la expresión génica en este áfido no modelo. Estos protocolos de bajo costo permiten estudiar interacciones planta-insecto y mecanismos moleculares.

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Nos gustaría agradecer a Michelle Moon (Vanderbilt University) por asistencia con la fotografía. Proporcionado la Universidad de Vanderbilt a PA y SSLB se admiten por DGE-1445197.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Durante mucho tiempo se ha reconocido que la catalogada a. nerii puede proporcionar penetraciones en los patrones y mecanismos de resistencia a las defensas de la planta y secuestro particularmente química18,37. Recientemente ha surgido una serie de recursos genómicos de a. nerii10, ofreciendo nuevas oportunidades para estudios de genómica funcionales y ecológicos que usan a. nerii como modelo. Describiremos los ...

Los áfidos son insectos hemimetabolous, pequeño que colonizan en familias de diversas plantas en todo el mundo. Son distintivos para varias características, más en particular sus ciclos de vida complejos con partenogénesis cíclica y polyphenisms discreta y sus simbiosis nutricionales obligados con endosimbionte bacteriano o de levadura que suministrar nutrientes en el la dieta de savia de planta1. Mientras más áfidos son especialistas de planta huésped, algunas especies generalistas son importantes plagas, causando un daño económico considerable en los cultivos ya sea directamente o a través de los agentes patógenos y virus vector2. La publicación del primer genoma del pulgón en el 2010, el áfido de la arveja Acyrthosiphon pisum3, marcó un hito importante en el estudio de la biología de los áfidos porque proporcionó los recursos genomic para abordar preguntas acerca de los insectos adaptaciones al estilo de vida herbívora, los que podrían conducir a un mejor control estrategias4incluidos. Desde entonces, han acumulado más recursos genomic con la publicación de un genoma anotado para la soja pulgón glycines Aphis5y recursos disponibles al público todo el genoma de otra especie de pulgón tres (Myzus Cerasi (cereza negra pulgón), Myzus persicae (pulgón de patatas y melocotón), Rhopalosiphum padi (pulgón de la avena de la cereza de pájaro)6. Valiosa de novo transcriptómicos recursos está disponible, así como para un número de otras especies de áfidos (e.g.,Aphis gossypii (pulgón del algodón)7, Sitobion avenae (áfido grano)8, Cinara pinitabulaeformis (pulgón del pino)9, Aphis nerii (pulgón de la adelfa de algodoncillo)10).
Áfidos también han hecho contribuciones duraderas a nuestro entendimiento de las interacciones planta-insecto y la ecología de la vida en las plantas11. Un área donde los pulgones han hecho contribuciones especialmente importantes es en nuestra comprensión de la ecología química de las interacciones de la planta de host. Adaptaciones expresan diversos insectos herbívoros para superar las defensas de la planta y algunos incluso cooptación las defensas de la planta para su propio benefician de12,13,14. Por ejemplo, el pulgón de la adelfa de algodoncillo, Aphis nerii, es un brillante amarillo, invasor pulgones encontrados en regiones templadas y tropicales en todo el mundo que colonizan en las plantas de la familia del algodoncillo (Apocynaceae). Planta de la familia Apocynaceae ha desarrollado defensas químicas diversas, incluyendo látex lechoso y glucósidos cardíacos conocidos como cardenolides, que se unen el portador de catión Na, K-ATPasa y son eficaces elementos de disuasión a generalistas herbívoros15, 16. especialistas de algodoncillo expresan distintos modos de resistencia a los cardenolides, y selectivamente o pasivamente se acumulan o modificar cardenolides en sus tejidos como medio para disuadir depredadores o para otros beneficios17. A. nerii piensa secuestrar cardenolides de esta manera, aunque los mecanismos y beneficios funcionales siguen siendo claro10,18.
Teniendo en cuenta los recursos genomic a la mano, a. nerii ofrece un excelente modelo experimental para el estudio de los mecanismos moleculares y genéticos involucrados en las interacciones chemo-ecológicas entre las plantas tóxicas acogida y su especialista herbívoros. Cabe señalar que, mientras algunos de los primeros estudios de a. nerii se centró en el secuestro de cardenolides19, desde entonces, los estudios de a. nerii han proporcionado penetraciones en un amplio conjunto de preguntas evolutivas y ecológicas, incluyendo la estructura genética de insectos invasores20 y la interacción entre regulación ascendente y descendente de la densidad de herbívoros21. A. nerii así es un buen candidato como un modelo experimental para un conjunto especialmente amplio de estudios de las interacciones planta insecto. Crítico para el éxito de cualquier estudio con a. nerii es la cultura de cuidado del pulgón las poblaciones, que incluye el cultivo de plantas de las que dependen los pulgones, así como una eficiente generación de datos de alta calidad - omic. Nuestro objetivo es guiar al lector a través de ambos. A continuación figuran los métodos para la generación y mantenimiento de la planta y pulgón en invernadero y laboratorio, DNA y RNA extracciones, análisis de microsatélites, de novo transcriptoma conjunto y anotación, transcriptoma Análisis de expresión diferencial y verificación de la qPCR de diferencialmente expresan genes. Mientras que estos métodos se escriben de a. nerii, los métodos generales de cultivo, la extracción y el análisis se pueden extender a una gran variedad de especies de áfidos.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Mezcla de Germinación</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2" x 4" Maceta Redonda Estándar Anderson</td><td>Pots</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq ADN Polimerasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>SuperScript&reg; III Kit de síntesis de primera cadena</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Áfidos son excelentes modelos experimentales para una variedad de cuestiones biológicas que van desde la evolución de la simbiosis y el desarrollo de polyphenisms a preguntas alrededor de las interacciones de los insectos con sus plantas hospederas. Recursos genómicos están disponibles para varias especies de áfidos, y con los avances en la secuenciación de próxima generación, transcriptómicos estudios se se amplía a organismos no-modelo que carecen de genomas. Además, culturas de pulgón pueden ser recogidas del campo y criadas en el laboratorio para el uso en experimentos moleculares y el brecha entre los estudios ecológicos y genéticos. Por último, muchos pulgones se pueden mantener en el laboratorio en sus plantas del anfitrión favorito en ciclos de vida perpetuos, partenogénesis que permite comparaciones de reproducir asexualmente genotipos. Aphis nerii, el pulgón de la adelfa de algodoncillo, proporciona uno de estos modelos para estudiar interacciones de insectos con plantas tóxicas usando experimentos de organismos y moleculares. Métodos para la generación y mantenimiento de la planta y pulgón en la expresión diferencial del transcriptoma de invernadero y laboratorio, extracciones de DNA y RNA, análisis de microsatélites, de novo transcriptoma montaje y anotación, Análisis y verificación de la qPCR de genes diferencialmente expresados son descritos y discutidos aquí.

Las culturas de la planta: Las semillas llevará aproximadamente de dos a cuatro semanas, dependiendo de la temporada, para crecer lo suficiente como para ser nuevo en maceta (figura 1A). Las plántulas a macetas tendrá otras dos a cuatro semanas para crecer a un tamaño óptimo para los cultivos de pulgón (figura 1B).
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El pulgón Aphis nerii coloniza plantas muy defendido en la familia del dogbane (Apocyanaceae) y ofrece numerosas oportunidades para el estudio de las interacciones planta-insecto. Aquí, presentamos una serie de protocolos para el mantenimiento de la planta y el pulgón de las culturas y la generación y el análisis molecular y los datos de a. nerii- omic.

Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Este método describe los pasos generales para el cultivo de pulgones y los pasos para el análisis genético de los pulgones. Estos métodos se pueden aplicar para responder preguntas clave en la evolución y ecología de los pulgones y los mecanismos moleculares que subyacen a la biología de los pulgones. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar generalmente a la mayoría de las especies de pulgones y se realiza a un costo relativamente bajo.Comience llenando una bandeja de plántulas estándar con tierra de mezcla para germinación, teniendo cuidado de que la tierra llegue a la parte superior de los pozos. Cuando todos los pozos se hayan llenado, haga un hoyo de tres centímetros de profundidad en el suelo de cada pozo y coloque una semilla en cada hoyo. Riegue las celdas hasta que la tierra que cubre las semillas esté saturada y coloque la bandeja en un invernadero con riego diario o cada dos días, para mantener un nivel moderado de humedad del suelo.Cuando las plántulas hayan crecido su primer conjunto de hojas completas, llene macetas redondas de cuatro pulgadas con tierra para macetas, hasta unos cinco centímetros por debajo de sus bordes. Cree un agujero en la tier

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. En este informe se muestra el uso de QRT-PCR para determinar los niveles de ARNm en diferentes tejidos y estadios de desarrollo larvario de las especies de insectos invasores, el barrenador esmeralda del fresno.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Fuente: Rufián, J. S., et al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demuestra un método para analizar la expresión génica en bacterias patógenas extraídas de plantas a nivel unicelular utilizando un factor de transcripción marcado con fluorescencia. La imagen confocal revela heterogeneidad en la expresión génica de virulencia, destacando la diversidad funcional dentro de una población bacteriana clonal.

Análisis de una sola célula de la expresión génica de patógenos extraídos por plantas

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección por Mycobacterium bovis en las larvas de la polilla de la cera mayor, Galleria mellonella. Se inyecta una cepa bioluminiscente de Mycobacterium bovis BCG en la hemolinfa de la larva para establecer la infección, y la bioluminiscencia se mide a intervalos predefinidos para estudiar el progreso de la infección.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en larvas de insectos

La cuantificación del crecimiento de patógenos es una poderosa herramienta para caracterizar diversas respuestas inmunitarias de Arabidopsis thaliana (en adelante: Arabidopsis). El método descrito aquí presenta un ensayo optimizado de infiltración de jeringas para cuantificar la Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 crecimiento en hojas adultas de Arabidopsis.

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

Se presenta un protocolo de inmunotinción de montaje completo en embriones de pulgón, en el que se abordan las condiciones críticas para disminuir la tinción de fondo y aumentar la permeabilidad del tejido. Estas condiciones se han desarrollado específicamente para la detección eficaz de la expresión de proteínas en los tejidos embrionarios de los pulgones.

Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Este protocolo describe un método sencillo para analizar las señales de calcio en las plantas generadas por hemipteran insectos, como pulgones. Thaliana de Arabidopsis transformada con el biosensor de calcio GFP GCaMP3 permiten la proyección de imagen en tiempo real en vivo de la dinámica de calcio con una alta resolución temporal y espacial.

En tiempo real en Vivo la grabación de señales de calcio Arabidopsis durante la alimentación de insectos utilizando un Biosensor fluorescente

Este protocolo describe un método para registrar la actividad eléctrica descendente de la sistema de nervioso central de Drosophila melanogaster para permitir pruebas de agentes farmacológicos, mutaciones genéticas de las proteínas neuronales, conveniente y rentable o el papel de los caminos fisiológicos inexplorados.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Este documento describe métodos básicos para estandarizar factores importantes como la densidad, la disponibilidad de alimento, la fuente de hidratación y los controles ambientales para la cría a largo plazo de cultivos de laboratorio del grillo comestible, Gryllus bimaculatus.

Mantenimiento de cultivos de laboratorio de Gryllus bimaculatus, un modelo versátil de ortópteros para la agricultura de insectos y la fisiología de invertebrados

Aprende a mantener cultivos de Aphis nerii y medir la expresión génica en este áfido no modelo. Estos protocolos de bajo costo permiten estudiar interacciones planta-insecto y mecanismos moleculares.

Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto (Video) | JoVE Journal

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Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

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