Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Este método se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico para el cáncer para analizar el ADN tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiples alteraciones genéticas en regiones de mutaciones en racimos en una sola reacción. Esto ayuda a guardar muestras preciosas de pacientes.

Este método puede proporcionar información sobre la carga tumoral en su perfil mutacional. Ahora también se puede aplicar a un análisis molecular como alternativa a qPCR para obtener una cuantificación absoluta de las secuencias diana de ácido nucleico. Recoger muestras de sangre en tubos EDTA de siete mililitros.

Se recomiendan dos tubos para recoger alrededor de cuatro mililitros de plasma. Centrifugar las muestras de sangre durante 10 minutos a 820 veces la gravedad dentro de las tres horas posteriores a la extracción de sangre para separar los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y el plasma. El tiempo entre el muestreo y la centrifugación es fundamental para obtener ADN de alto grado libre de células T no contaminado con ADN liberado de glóbulos blancos.

Después de la centrifugación, utilice una pipeta serológica para recoger el sobrenadante sin tocar la capa de glóbulos blancos. Alrededor de dos mililitros de plasma generalmente se recuperan por tubo EDTA. Después de transferir los plasmos a dos tubos de mililitro, centrifugar las alícuotas a 16.000 veces la gravedad durante 10 minutos a 15 grados celsius para eliminar los desechos celulares.

Recoja cuidadosamente el plasma sin alterar el pellet y transfiera a dos tubos criogénicos mililitros. Conservar a 80 grados Celsius negativos hasta que sea necesario. Comience agregando 400 microlitros de proteinasa K a un tubo de 50 mililitros.

A continuación, agregue cuatro mililitros de plasma y 3,2 mililitros de tampón de lelisis ACL que contenga un microgramo de ARN portador del kit de extracción. Cierre el tubo y mezcle por vórtice durante 30 segundos para obtener una solución homogénea. Luego, incubar a 60 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de la incubación, añadir 7,2 mililitros de ACB tampón al lisato para optimizar la unión de los ácidos nucleicos circulantes a la membrana de sílice. Mezclar por vórtice durante 15 a 30 segundos. Luego, incuba el tubo sobre hielo durante cinco minutos.

Coloque la columna y el extensor de 20 mililitros en la bomba de vacío. Cierre las porciones no utilizadas para permitir la aspiración al vacío. Después de centrifugar brevemente el tubo, introduzca cuidadosamente la mezcla en el extensor del tubo.

A continuación, encienda la bomba de vacío y deje que el izado se extraiga completamente a través de las columnas. Retire y deseche el extensor de tubo. A continuación, aplique 600 microlitros de búfer ACW1 a la columna.

Cuando el búfer ACW1 se haya dibujado a través de la columna, agregue 750 microlitros de búfer ACW2 y, por último, 750 microlitros de 96 a 100% etanol. A continuación, coloque la columna en un tubo de recogida limpio de dos mililitros y centrífuga a toda velocidad durante tres minutos para eliminar el etanol. Después de colocar la columna en un nuevo tubo de recogida de dos mililitros, abra la tapa y luego incubar a 56 grados Centígrados durante 10 minutos para secar la membrana por completo.

Después de la incubación, coloque la columna en un tubo limpio de baja unión de 1,5 mililitros. Aplique cuidadosamente 36 microlitros de agua libre de RNase con 0,04%azida sódica. Luego, cierre la tapa e incubar a temperatura ambiente durante tres minutos.

Centrifugar a toda velocidad de nuevo durante un minuto para eluir los ácidos nucleicos. Luego, almacene a 20 grados Celsius negativos hasta que sea necesario. Comience descongelando y equilibrando los componentes de reacción a temperatura ambiente en una campana PCR limpia.

A continuación, prepare una mezcla de 20 veces de imprimaciones y sondas en agua destilada sin RNase y Dnase con cada imprimación a 18 micromolares de concentración y cada sonda a cinco micromolares de concentración. Para todas las reacciones PCR individuales, prepare una mezcla de muestra combinando 10 microlitros de dos veces ddPCR Supermix, un microlitro de 20 veces imprimadores y se mezclan sondas, y hasta 10 nanogramos de la muestra de ADN en 20 microlitros de agua destilada. Vórtice la mezcla de reacción a fondo para asegurar la homogeneidad.

Y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo antes de la dosificación. Inserte el cartucho ddPCR en el soporte y cargue 20 microlitros de mezcla de reacción de muestra en los pozos medios del cartucho para la generación de gotas. Agregue 70 microlitros de aceite generador de gotas en los pozos inferiores.

Inserte el cartucho con una junta en el generador de gotas. Las gotas se producirán en los pozos superiores del cartucho. Aspirar lenta y suavemente 40 microlitros de las gotas de los cartuchos y dispensar en una placa PCR de 96 pozos.

Selle la placa PCR final con papel de aluminio utilizando un sellador de placas inmediatamente después de transferir las gotas para evitar la evaporación. Centrifugar brevemente la placa para recoger el contenido en la parte inferior de los pozos. Ejecute una amplificación de PCR convencional en un ciclor térmico.

Cuando se complete la carrera, centrifuga brevemente la placa para recoger el contenido en la parte inferior de los pozos. Después de la amplificación de PCR, utilice el lector de gotas para contar las gotas negativas PCR positivas y PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes son resultados representativos obtenidos durante los pasos de optimización del ensayo ddPCR de entrega.

Esta imagen muestra la detección de ADN mutante y ADN de tipo salvaje en una reacción que contiene ADN 100% mutante, ADN 5% mutante y ADN 100%salvaje. Esta imagen muestra ejemplos de muestras de plasma analizadas con los ensayos DdPCR de entrega de KRAS y EGFR que muestran la detección de un solo nucleótido y múltiples sustituciones en exón dos de KRAS y una eliminación en EGFR exón 19. Al intentar este procedimiento, es importante proceder cuidadosamente en cada paso con una atención especial en la generación de gotas, que es un paso crítico de este método.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores y clínicos en el campo de la investigación del cáncer optimizaran el análisis de mutaciones tumorales mediante biopsia líquida.