Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot
25 de septiembre de 2018
Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.
Este método se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico para el cáncer para analizar el ADN tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiples alteraciones genéticas en regiones de mutaciones en racimos en una sola reacción. Esto ayuda a guardar muestras preciosas de pacientes.
Este método puede proporcionar información sobre la carga tumoral en su perfil mutacional. Ahora también se puede aplicar a un análisis molecular como alternativa a qPCR para obtener una cuantificación absoluta de las secuencias diana de ácido nucleico. Recoger muestras de sangre en tubos EDTA de siete mililitros.
Se recomiendan dos tubos para recoger alrededor de cuatro mililitros de plasma. Centrifugar las muestras de sangre durante 10 minutos a 820 veces la gravedad dentro de las tres horas posteriores a la extracción de sangre para separar los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y el plasma. El tiempo entre el muestreo y la centrifugación es fundamental para obtener ADN de alto grado libre de células T no contaminado con ADN liberado de glóbulos blancos.
Después de la centrifugación, utilice una pipeta serológica para recoger el sobrenadante sin tocar la capa de glóbulos blancos. Alrededor de dos mililitros de plasma generalmente se recuperan por tubo EDTA. Después de transferir los plasmos a dos tubos de mililitro, centrifugar las alícuotas a 16.000 veces la gravedad durante 10 minutos a 15 grados celsius para eliminar los desechos celulares.
Recoja cuidadosamente el plasma sin alterar el pellet y transfiera a dos tubos criogénicos mililitros. Conservar a 80 grados Celsius negativos hasta que sea necesario. Comience agregando 400 microlitros de proteinasa K a un tubo de 50 mililitros.
A continuación, agregue cuatro mililitros de plasma y 3,2 mililitros de tampón de lelisis ACL que contenga un microgramo de ARN portador del kit de extracción. Cierre el tubo y mezcle por vórtice durante 30 segundos para obtener una solución homogénea. Luego, incubar a 60 grados centígrados durante 30 minutos.
Después de la incubación, añadir 7,2 mililitros de ACB tampón al lisato para optimizar la unión de los ácidos nucleicos circulantes a la membrana de sílice. Mezclar por vórtice durante 15 a 30 segundos. Luego, incuba el tubo sobre hielo durante cinco minutos.
Coloque la columna y el extensor de 20 mililitros en la bomba de vacío. Cierre las porciones no utilizadas para permitir la aspiración al vacío. Después de centrifugar brevemente el tubo, introduzca cuidadosamente la mezcla en el extensor del tubo.
A continuación, encienda la bomba de vacío y deje que el izado se extraiga completamente a través de las columnas. Retire y deseche el extensor de tubo. A continuación, aplique 600 microlitros de búfer ACW1 a la columna.
Cuando el búfer ACW1 se haya dibujado a través de la columna, agregue 750 microlitros de búfer ACW2 y, por último, 750 microlitros de 96 a 100% etanol. A continuación, coloque la columna en un tubo de recogida limpio de dos mililitros y centrífuga a toda velocidad durante tres minutos para eliminar el etanol. Después de colocar la columna en un nuevo tubo de recogida de dos mililitros, abra la tapa y luego incubar a 56 grados Centígrados durante 10 minutos para secar la membrana por completo.
Después de la incubación, coloque la columna en un tubo limpio de baja unión de 1,5 mililitros. Aplique cuidadosamente 36 microlitros de agua libre de RNase con 0,04%azida sódica. Luego, cierre la tapa e incubar a temperatura ambiente durante tres minutos.
Centrifugar a toda velocidad de nuevo durante un minuto para eluir los ácidos nucleicos. Luego, almacene a 20 grados Celsius negativos hasta que sea necesario. Comience descongelando y equilibrando los componentes de reacción a temperatura ambiente en una campana PCR limpia.
A continuación, prepare una mezcla de 20 veces de imprimaciones y sondas en agua destilada sin RNase y Dnase con cada imprimación a 18 micromolares de concentración y cada sonda a cinco micromolares de concentración. Para todas las reacciones PCR individuales, prepare una mezcla de muestra combinando 10 microlitros de dos veces ddPCR Supermix, un microlitro de 20 veces imprimadores y se mezclan sondas, y hasta 10 nanogramos de la muestra de ADN en 20 microlitros de agua destilada. Vórtice la mezcla de reacción a fondo para asegurar la homogeneidad.
Y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo antes de la dosificación. Inserte el cartucho ddPCR en el soporte y cargue 20 microlitros de mezcla de reacción de muestra en los pozos medios del cartucho para la generación de gotas. Agregue 70 microlitros de aceite generador de gotas en los pozos inferiores.
Inserte el cartucho con una junta en el generador de gotas. Las gotas se producirán en los pozos superiores del cartucho. Aspirar lenta y suavemente 40 microlitros de las gotas de los cartuchos y dispensar en una placa PCR de 96 pozos.
Selle la placa PCR final con papel de aluminio utilizando un sellador de placas inmediatamente después de transferir las gotas para evitar la evaporación. Centrifugar brevemente la placa para recoger el contenido en la parte inferior de los pozos. Ejecute una amplificación de PCR convencional en un ciclor térmico.
Cuando se complete la carrera, centrifuga brevemente la placa para recoger el contenido en la parte inferior de los pozos. Después de la amplificación de PCR, utilice el lector de gotas para contar las gotas negativas PCR positivas y PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes son resultados representativos obtenidos durante los pasos de optimización del ensayo ddPCR de entrega.
Esta imagen muestra la detección de ADN mutante y ADN de tipo salvaje en una reacción que contiene ADN 100% mutante, ADN 5% mutante y ADN 100%salvaje. Esta imagen muestra ejemplos de muestras de plasma analizadas con los ensayos DdPCR de entrega de KRAS y EGFR que muestran la detección de un solo nucleótido y múltiples sustituciones en exón dos de KRAS y una eliminación en EGFR exón 19. Al intentar este procedimiento, es importante proceder cuidadosamente en cada paso con una atención especial en la generación de gotas, que es un paso crítico de este método.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores y clínicos en el campo de la investigación del cáncer optimizaran el análisis de mutaciones tumorales mediante biopsia líquida.
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Resumen
Este artículo describe el método de PCR digital por gotas (ddPCR) de tipo drop-off, una técnica altamente sensible para la detección y cuantificación de ADN tumoral circulante (ctDNA) en el diagnóstico del cáncer. El enfoque de ddPCR de tipo drop-off permite la interrogación simultánea de múltiples alteraciones genéticas dentro de regiones de mutaciones agrupadas, conservando valiosas muestras de pacientes y aumentando el rendimiento en comparación con la ddPCR estándar.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Diagnóstico molecular
- Genómica del cáncer
- Biópsia líquida
Antecedentes
- La ddPCR estándar es un método sensible de PCR cuantitativa que particiona muestras en miles de gotas de tamaño nanométrico de agua en aceite.
- Se utiliza ampliamente para la detección de ADNct, pero está limitada por el número de mutaciones que pueden analizarse por reacción debido a la necesidad de sondas específicas.
- El método ddPCR de tipo drop-off emplea un único par de sondas para detectar una amplia variedad de alteraciones genéticas en una región diana.
- Este enfoque es rentable, conserva el material de la muestra y puede utilizarse para el descubrimiento de mutaciones cuando estas no se conocen de antemano.
Objetivo del estudio
- Presentar un protocolo para la técnica de ddPCR por eliminación para el análisis de ctADN.
- Mostrar su aplicación en la detección de múltiples mutaciones en una sola reacción.
- Destacar sus ventajas frente a los métodos convencionales de ddPCR y qPCR.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras de sangre en tubos con EDTA y separación del plasma mediante centrifugación.
- Extracción de ácidos nucleicos circulantes utilizando proteinasa K, tampón de lisis y columnas con membrana de sílice.
- Preparación de reacciones de ddPCR con cebadores y sondas específicas.
- Generación de gotas, amplificación por PCR y lectura de gotas para la cuantificación del ADN mutante y de tipo silvestre.
Resultados principales
- El ensayo ddPCR de descarte detecta con éxito sustituciones de un solo nucleótido y múltiples, así como deleciones en genes diana (por ejemplo, KRAS y EGFR).
- Los resultados representativos muestran una clara discriminación entre el ADN mutante y el de tipo silvestre en muestras de plasma.
- El método permite la cuantificación absoluta de los ácidos nucleicos diana y proporciona información sobre la carga tumoral y los perfiles mutacionales.
- Los pasos críticos incluyen la generación y manipulación cuidadosas de las gotas para garantizar la sensibilidad y precisión del ensayo.
Conclusiones
- La ddPCR por pérdida es un método robusto, sensible y rentable para el análisis de ctADN en el diagnóstico del cáncer.
- Permite la detección multiplex de mutaciones en una sola reacción, conservando el material de la muestra.
- Esta técnica apoya tanto aplicaciones clínicas como de investigación en el perfilado de mutaciones tumorales mediante biopsia líquida.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La PCR digital por gotas (ddPCR) permite la detección completa y simultánea de múltiples mutaciones en regiones hotspot a partir de muestras limitadas de biopsia líquida, abordando directamente los desafíos de sensibilidad y rendimiento en el descubrimiento temprano de biomarcadores en oncología. Este enfoque posibilita la cuantificación absoluta del ADN tumoral circulante (ctDNA), facilitando un perfilado robusto de mutaciones tumorales y mejorando la confianza predictiva en puntos críticos de descubrimiento y transición traslacional. Su eficiencia en el uso de muestras y su capacidad de multiplexación lo convierten en un recurso estratégico para la selección de carteras y el avance ajustado al riesgo en I+D oncológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar regiones de mutaciones agrupadas para aclarar las vías oncogénicas y validar dianas terapéuticas accionables.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al proporcionar perfiles cuantitativos de mutaciones a partir de muestras mínimas de pacientes.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de dianas y en las decisiones tempranas de avance o interrupción de programas en oncología.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas validados de detección de ADN tumoral circulante para cribados posteriores y flujos de trabajo de biomarcadores.
- Proporciona salidas estandarizadas, reproducibles y cuantitativas para la detección de mutaciones en múltiples alelos.
- Permite un cribado escalable y multiplexado con entrada mínima de muestra, favoreciendo un desarrollo eficiente de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con estrategias de biomarcadores relevantes para enfermedades al permitir el seguimiento de mutaciones basado en biopsia líquida.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la cuantificación absoluta de ADN tumoral circulante (ctDNA).
- Reduce el riesgo de traslación al permitir la detección temprana de heterogeneidad mutacional en muestras derivadas de pacientes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La ddPCR por pérdida integra desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de candidatos y la investigación traslacional, apoyando la verificación de hipótesis, la aclaración de vías y la toma de decisiones basada en biomarcadores en las líneas de desarrollo oncológico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas rigurosas de hipótesis nulas y reducción del riesgo mecanicista al permitir la detección multiplex de mutaciones en el ADN tumoral circulante (ctDNA).
- Detección: Proporciona disponibilidad y reproducibilidad del ensayo para el análisis de alto rendimiento de mutaciones en muestras de biopsia líquida.
- Análisis: Ofrece cuantificación absoluta y clara discriminación entre alelos mutantes y de tipo silvestre para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la continuidad preclínica mediante el seguimiento de la carga tumoral y los perfiles mutacionales.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable y escalable para el descubrimiento y monitoreo de mutaciones en diversos programas de oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación oncológica basada en mutaciones.
- Valor operativo: Estandariza el análisis de ADN circulante (ctDNA) con alta sensibilidad, reproducibilidad y requisitos mínimos de muestra.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del portafolio al proporcionar datos multiplexados de mutaciones desde etapas tempranas.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos oncológicos basados en evidencia robusta de biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en diagnóstico molecular e instrumentación de PCR digital por gotas.
- Exige una generación y manipulación precisas de las gotas para mantener la sensibilidad y exactitud del ensayo.
- Necesita protocolos estandarizados para la recolección, procesamiento y almacenamiento de muestras para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos objetivos de mutación, pero depende del diseño de las sondas para las regiones diana.
- Las limitaciones en la cantidad de muestra y la generación de gotas son factores críticos para obtener resultados confiables.
