Name: Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende el método drop-off ddPCR para detectar múltiples mutaciones en regiones hotspot del ADN tumoral circulante. Esta técnica conserva muestras de pacientes y permite el análisis simultáneo en biopsia líquida.

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Este trabajo fue apoyado por el Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Los autores también desean agradecer a Caroline Hego por su contribución al video.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Varios autores llaman inventores de dos solicitudes de patente (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados con la detección de ctDNA.

Para diseñar un ensayo de ddPCR de entrega eficiente, la optimización es crucial, y el protocolo debe seguirse cuidadosamente. Cada combinación de cebadores y sondas tiene un única eficiencia de reacción de PCR. Así, un ensayo individual tiene que ser cuidadosamente validado en muestras de control antes de ser utilizado en muestras de prueba valiosos. Optimización y validación son importantes para la detección de la señal de pico de certificar y evaluar sensibilidad y especificidad. Como se describe en el protocolo, toda...

Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados1. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida 2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados principalmente para detectar las mutaciones conocidas a priori. Esto limita severamente el uso de ddPCR como una herramienta de descubrimiento cuando la mutación es desconocida. De hecho, en el diseño convencional de ddPCR, una sonda de hidrólisis reconociendo el alelo de tipo salvaje (WT sonda) compite con una sonda específica reconociendo el alelo mutante (MUT Probe) (figura 1A). La sonda con mayor afinidad cruza por hibridación a la plantilla y libera su fluoróforo, indicando la naturaleza del alelo correspondiente. Los datos de fluorescencia obtenidos para cada gotita se pueden visualizar en un diagrama de dispersión que representa la fluorescencia emitida por las sondas WT y MUT en diferentes dimensiones. Una representación esquemática de un resultado típico de un ensayo de ddPCR convencional se presenta en la figura 1A. En este ejemplo, la nube azul corresponde a las gotitas que contienen alelos WT identificados por la punta de prueba de peso, mientras que la nube roja corresponde a gotitas en el que el alelo MUT ha sido amplificado e identificado por la sonda MUT. Dependiendo de la cantidad de DNA en la reacción, doble positivo gotitas que contienen peso y MUT amplicones pueden aparecer (nube verde). La nube gris clara corresponde a gotas de vacías.
Puesto que la mayoría de las plataformas permite la detección de un número limitado de fluoróforos (generalmente 2, pero hasta 5), rendimiento de ddPCR convencional es limitado. Por lo tanto, dirigida a las regiones con múltiples mutaciones adyacentes requiere diseño de técnicamente difícil ensayos multiplex ddPCR o el uso de múltiples reacciones dirigidas a cada mutación en paralelo. La estrategia de ddPCR de entrega, supera esta limitación como es potencialmente capaz de detectar cualquier alteración genética dentro de una región de destino utilizando un único par de sondas de hidrólisis WT. La primera cubre sonda (sonda 1) es complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino donde las mutaciones son una secuencia no variable, adyacente a la región de destino y la segunda sonda (sonda 2) espera (figura 1B). Mientras que la primera punta de prueba cuantifica la cantidad total de amplificable moléculas en la reacción, la segunda sonda discrimina alelos WT y MUT óptimo hibridación a las secuencias mutantes. Punta de prueba 2 puede identificar varios tipos de mutaciones en la región (substituciones del nucleótido único o múltiples, eliminación, etc.) de destino6. Como en ddPCR convencional, la nube gris clara corresponde a las gotas que contienen no las moléculas de ADN. Es importante recordar que en este tipo de análisis, separación óptima de WT y MUT nubes depende de la cantidad de ADN cargado en la reacción, ya que no se pueden distinguir las gotitas que contienen alelos objetivo WT y MUT de gotitas que contienen sólo el peso forma. Por lo tanto, este análisis requiere que la mayoría de las gotas contienen no más de una copia del gen objetivo.

<table><tbody><tr><td>Tubo K2EDTA (código de color: lavanda)</td><td>Los tubos BD</td><td>367863</td><td>EDTA se utilizan para obtener una muestra de sangre completa o plasma EDTA</td></tr><tr><td>Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Para el aislamiento de ADN circulante de libre circulación de plasma humano</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (protocolo automatizado)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Para el aislamiento de ADN circulante libre a partir de plasma humano</td></tr><tr><td>Sistema QIAsymphony SP</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>sistema totalmente integrado y automatizado para la purificación de cfDNA, ADN o ARN</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Para la purificación de hasta 24 cfDNAs simultáneamente</td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>El fluorómetro Qubit es un fluorómetro de sobremesa para la cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>QX100 o QX200 lector</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 o 186-4003, respectivamente</td><td>El lector mide la intensidad de fluorescencia de cada gota y detecta el tamaño y la forma a medida que las gotas pasan por el detector</td></tr><tr><td>QX100 o QX200 generador de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 o 186-4002, respectivamente</td><td>Instrumento utilizado para la generación de gotas</td></tr><tr><td>C1000 termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Plataforma de termociclador modular, incluye chasis de termociclador C1000 Touch, módulo de reacción rápida de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Sellador</td><td>de placas Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; Selladora de placas PCR</td></tr><tr><td>DG8 portacartuchos</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Coloca y sostiene el cartucho DG8 en el instrumento para la generación de gotas</td></tr><tr><td>Cartuchos y juntas generadoras de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Cartucho microfluídico DG8 utilizado para mezclar muestras y aceite para generar gotas; Las juntas DG8 sellan el cartucho para evitar la evaporación y aplicar la presión necesaria para la formación de gotas</td></tr><tr><td>Supermix de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>supermix ddPCR para sondas (sin dUTP)</td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>Placas semifaldón de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Junta de lámina</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Sellado térmico de lámina perforable</td></tr><tr><td>ddPCR Aceite lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>aceite utilizado en la lectura</td></tr><tr><td>Generación de gotas Aceite para sondas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>aceite para generación de gotas</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Los tubos Eppendorf LoBind maximizan la recuperación de muestras al reducir significativamente la unión de la muestra a la superficie</td></tr><tr><td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Los Estándares de Referencia de ADNcf Multiplex I son materiales de referencia altamente caracterizados y biológicamente relevantes que se utilizan para evaluar el rendimiento de los ensayos de ADNcf que detectan mutaciones somáticas</td></tr><tr><td>KIT DE ENSAYO QUBIT DSDNA HS, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>El ensayo HS es altamente selectivo para el ADN bicatenario (dsDNA) sobre el ARN y está diseñado para ser preciso para concentraciones de muestra iniciales de 10 pg/& L a 100 ng/&micro; </td></tr><tr><td>L Tubos de ensayo Qubit Life</td><td>Technologies</td><td>Q32856</td><td>Los tubos de ensayo Qubit son 500 y micro; L Tubos de polipropileno de pared delgada para usar con el fluorímetro Qubit</td></tr></tbody></table>

reacción en cadena polimerasa digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de hotspot

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reacción en cadena de polimerasa digital gota (ddPCR) es un método de reacción en cadena (PCR) alta sensibilidad cuantitativa de polimerasa basado en fraccionamiento de la muestra en miles de reacciones individuales de agua en aceite tamaño nanométrico. Recientemente, ddPCR ha convertido en uno de los instrumentos más precisos y sensibles para la detección de ADN (ctDNA) de tumor de circulación. Una de las principales limitaciones de la técnica de ddPCR estándar es el número limitado de mutaciones que pueden ser defendidos por reacción, como sondas de hidrólisis específica reconociendo cada versión alélica posible son necesarias. Una metodología alternativa, el ddPCR de entrega, aumenta el rendimiento, ya que requiere solamente un solo par de sondas para detectar y cuantificar potencialmente todas las alteraciones genéticas en la región específica. Entrega ddPCR muestra sensibilidad comparable a ensayos ddPCR convencional con la ventaja de detectar un mayor número de mutaciones en una sola reacción. Es rentable, conserva muestras preciosas y puede usarse como una herramienta de descubrimiento cuando las mutaciones se desconocen a priori.

En un estudio de prueba de concepto, mutaciones del exón 2 de KRAS (codones 12 y 13) y EGFR exón 19 eliminaciones fueron investigados en los tejidos FFPE y las muestras de plasma de pacientes con cáncer mediante la entrega ddPCR estrategia6.
La punta de prueba KRAS entrega interrogó a una región de bp 16 que abarca múltiples mutaciones en el exón 2 del gen KRAS , que al...

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Este método se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico para el cáncer para analizar el ADN tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiples alteraciones genéticas en regiones de mutaciones en racimos en una sola reacción. Esto ayuda a guardar muestras preciosas de pacientes.Este método puede proporcionar información sobre la carga tumoral en su perfil mutacional. Ahora también se puede aplicar a un análisis molecular como alternativa a qPCR para obtener una cuantificación absoluta de las secuencias diana de ácido nucleico. Recoger muestras de sangre en tubos EDTA de siete mililitros.Se recomiendan dos tubos para recoger alrededor de cuatro mililitros de plasma. Centrifugar las muestras de sangre durante 10 minutos a 820 veces la gravedad dentro de las tres horas posteriores a la extracción de sangre para separar los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y el plasma. El tiempo entre el muestreo y la centrifugación es fundamental para obtener ADN de alto grado libre de células T no contaminado con ADN liberado de glóbulos blancos.Después de la centrifugación, utilice una pipeta serológica para recoger el sobrenadante sin tocar la capa de glóbulos blancos. Alrededor de d

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

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Investigación

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Genética

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

Este video demuestra el papel de la reacción en cadena de la polimerasa por gota digital en la identificación de la mutación indel en una muestra de ADN. La alta precisión y sensibilidad de la ddPCR permite una detección precisa y consistente de mutaciones raras presentes en una muestra, incluso a niveles bajos. Puede identificar y cuantificar mutaciones de indel en diferentes regiones del genoma, proporcionando información valiosa sobre los mecanismos de mutación y las consecuencias...

Reacción en cadena de la polimerasa en gotas digitales para la detección de mutaciones de Indel en genes diana

En este video, demostramos la técnica de PCR digital dúplex (ddPCR), una modificación de la técnica de PCR tradicional que es útil para detectar dos marcadores genéticos diferentes simultáneamente. Una sola reacción de PCR se divide en gotas emulsionadas del tamaño de un nanolitro que se amplifican de forma independiente, y la detección de señales de amplificación de fluorescencia de diferentes colores a partir de la fracción de gotas se utiliza para calcular la concentración inicial de las...

PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

En este video, describimos una técnica de PCR de fusión de alta resolución para determinar el polimorfismo de longitud de fragmentos de ADN de diferentes longitudes de secuencia, basada en el análisis de la temperatura de fusión.

PCR de fusión de alta resolución para determinar variaciones de secuencia en secuencias de ADN mutante

Este video demuestra la utilidad de la PCR digital en formato de chip en un tubo para la detección de variaciones de un solo nucleótido en muestras de ADN. Una sola reacción de PCR se divide en cámaras que actúan como reacciones de PCR independientes, y la detección de señales de fluorescencia de los objetivos amplificados en las cámaras se utiliza para calcular la frecuencia del alelo variante en la muestra.

PCR digital basada en chip en tubo para la cuantificación de variantes de un solo nucleótido

La PCR de bloqueo de tipo salvaje seguida de secuenciación directa ofrece un método altamente sensible de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras.

El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Este protocolo proporciona los pasos desde la extracción de ADN hasta la configuración experimental para la PCR digital de gotas (ddPCR), incluido el análisis para la identificación y cuantificación de eventos de unión final no homólogos (NHEJ) en sitios objetivo después de la escisión Cas9 inducida por gRNA y la reparación del ADN. Otros usos de este método incluyen aplicaciones como la detección de polimorfismo y la verificación de variantes de edición de genes.

PCR de gotas digitales para detectar mutaciones de Indels en poblaciones de mosquitos anofelinos modificados genéticamente

En este artículo se presenta la aplicación de un método de detección de baja frecuencia basado en la secuenciación de Sanger en el linfoma angioinmunoblástico. Proporcionar una base para aplicar este método a otras enfermedades.

PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia

Se describe un método de longitud de los fragmentos de restricción polimórficos-reacción en cadena de polimerasa mejorado para el genotipado de especies pufferfish por espectrometría de cromatografía / masa líquida. Una columna monolito de sílice de fase inversa se emplea para la separación de amplicones digeridos. Este método puede dilucidar las masas monoisotópicas de oligonucleótidos, que es útil para la identificación de la composición base.

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

Aprende el método drop-off ddPCR para detectar múltiples mutaciones en regiones hotspot del ADN tumoral circulante. Esta técnica conserva muestras de pacientes y permite el análisis simultáneo en biopsia líquida.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot (Video) | JoVE Journal

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

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