Name: Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende el método drop-off ddPCR para detectar múltiples mutaciones en regiones hotspot del ADN tumoral circulante. Esta técnica conserva muestras de pacientes y permite el análisis simultáneo en biopsia líquida.

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Este trabajo fue apoyado por el Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Los autores también desean agradecer a Caroline Hego por su contribución al video.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
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<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
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<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Varios autores llaman inventores de dos solicitudes de patente (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados con la detección de ctDNA.

Para diseñar un ensayo de ddPCR de entrega eficiente, la optimización es crucial, y el protocolo debe seguirse cuidadosamente. Cada combinación de cebadores y sondas tiene un única eficiencia de reacción de PCR. Así, un ensayo individual tiene que ser cuidadosamente validado en muestras de control antes de ser utilizado en muestras de prueba valiosos. Optimización y validación son importantes para la detección de la señal de pico de certificar y evaluar sensibilidad y especificidad. Como se describe en el protocolo, toda...

Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados1. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida 2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados principalmente para detectar las mutaciones conocidas a priori. Esto limita severamente el uso de ddPCR como una herramienta de descubrimiento cuando la mutación es desconocida. De hecho, en el diseño convencional de ddPCR, una sonda de hidrólisis reconociendo el alelo de tipo salvaje (WT sonda) compite con una sonda específica reconociendo el alelo mutante (MUT Probe) (figura 1A). La sonda con mayor afinidad cruza por hibridación a la plantilla y libera su fluoróforo, indicando la naturaleza del alelo correspondiente. Los datos de fluorescencia obtenidos para cada gotita se pueden visualizar en un diagrama de dispersión que representa la fluorescencia emitida por las sondas WT y MUT en diferentes dimensiones. Una representación esquemática de un resultado típico de un ensayo de ddPCR convencional se presenta en la figura 1A. En este ejemplo, la nube azul corresponde a las gotitas que contienen alelos WT identificados por la punta de prueba de peso, mientras que la nube roja corresponde a gotitas en el que el alelo MUT ha sido amplificado e identificado por la sonda MUT. Dependiendo de la cantidad de DNA en la reacción, doble positivo gotitas que contienen peso y MUT amplicones pueden aparecer (nube verde). La nube gris clara corresponde a gotas de vacías.
Puesto que la mayoría de las plataformas permite la detección de un número limitado de fluoróforos (generalmente 2, pero hasta 5), rendimiento de ddPCR convencional es limitado. Por lo tanto, dirigida a las regiones con múltiples mutaciones adyacentes requiere diseño de técnicamente difícil ensayos multiplex ddPCR o el uso de múltiples reacciones dirigidas a cada mutación en paralelo. La estrategia de ddPCR de entrega, supera esta limitación como es potencialmente capaz de detectar cualquier alteración genética dentro de una región de destino utilizando un único par de sondas de hidrólisis WT. La primera cubre sonda (sonda 1) es complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino donde las mutaciones son una secuencia no variable, adyacente a la región de destino y la segunda sonda (sonda 2) espera (figura 1B). Mientras que la primera punta de prueba cuantifica la cantidad total de amplificable moléculas en la reacción, la segunda sonda discrimina alelos WT y MUT óptimo hibridación a las secuencias mutantes. Punta de prueba 2 puede identificar varios tipos de mutaciones en la región (substituciones del nucleótido único o múltiples, eliminación, etc.) de destino6. Como en ddPCR convencional, la nube gris clara corresponde a las gotas que contienen no las moléculas de ADN. Es importante recordar que en este tipo de análisis, separación óptima de WT y MUT nubes depende de la cantidad de ADN cargado en la reacción, ya que no se pueden distinguir las gotitas que contienen alelos objetivo WT y MUT de gotitas que contienen sólo el peso forma. Por lo tanto, este análisis requiere que la mayoría de las gotas contienen no más de una copia del gen objetivo.

<table><tbody><tr><td>Tubo K2EDTA (código de color: lavanda)</td><td>Los tubos BD</td><td>367863</td><td>EDTA se utilizan para obtener una muestra de sangre completa o plasma EDTA</td></tr><tr><td>Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Para el aislamiento de ADN circulante de libre circulación de plasma humano</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (protocolo automatizado)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Para el aislamiento de ADN circulante libre a partir de plasma humano</td></tr><tr><td>Sistema QIAsymphony SP</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>sistema totalmente integrado y automatizado para la purificación de cfDNA, ADN o ARN</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Para la purificación de hasta 24 cfDNAs simultáneamente</td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>El fluorómetro Qubit es un fluorómetro de sobremesa para la cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>QX100 o QX200 lector</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 o 186-4003, respectivamente</td><td>El lector mide la intensidad de fluorescencia de cada gota y detecta el tamaño y la forma a medida que las gotas pasan por el detector</td></tr><tr><td>QX100 o QX200 generador de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 o 186-4002, respectivamente</td><td>Instrumento utilizado para la generación de gotas</td></tr><tr><td>C1000 termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Plataforma de termociclador modular, incluye chasis de termociclador C1000 Touch, módulo de reacción rápida de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Sellador</td><td>de placas Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; Selladora de placas PCR</td></tr><tr><td>DG8 portacartuchos</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Coloca y sostiene el cartucho DG8 en el instrumento para la generación de gotas</td></tr><tr><td>Cartuchos y juntas generadoras de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Cartucho microfluídico DG8 utilizado para mezclar muestras y aceite para generar gotas; Las juntas DG8 sellan el cartucho para evitar la evaporación y aplicar la presión necesaria para la formación de gotas</td></tr><tr><td>Supermix de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>supermix ddPCR para sondas (sin dUTP)</td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>Placas semifaldón de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Junta de lámina</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Sellado térmico de lámina perforable</td></tr><tr><td>ddPCR Aceite lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>aceite utilizado en la lectura</td></tr><tr><td>Generación de gotas Aceite para sondas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>aceite para generación de gotas</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Los tubos Eppendorf LoBind maximizan la recuperación de muestras al reducir significativamente la unión de la muestra a la superficie</td></tr><tr><td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Los Estándares de Referencia de ADNcf Multiplex I son materiales de referencia altamente caracterizados y biológicamente relevantes que se utilizan para evaluar el rendimiento de los ensayos de ADNcf que detectan mutaciones somáticas</td></tr><tr><td>KIT DE ENSAYO QUBIT DSDNA HS, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>El ensayo HS es altamente selectivo para el ADN bicatenario (dsDNA) sobre el ARN y está diseñado para ser preciso para concentraciones de muestra iniciales de 10 pg/& L a 100 ng/&micro; </td></tr><tr><td>L Tubos de ensayo Qubit Life</td><td>Technologies</td><td>Q32856</td><td>Los tubos de ensayo Qubit son 500 y micro; L Tubos de polipropileno de pared delgada para usar con el fluorímetro Qubit</td></tr></tbody></table>

reacción en cadena polimerasa digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de hotspot

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reacción en cadena de polimerasa digital gota (ddPCR) es un método de reacción en cadena (PCR) alta sensibilidad cuantitativa de polimerasa basado en fraccionamiento de la muestra en miles de reacciones individuales de agua en aceite tamaño nanométrico. Recientemente, ddPCR ha convertido en uno de los instrumentos más precisos y sensibles para la detección de ADN (ctDNA) de tumor de circulación. Una de las principales limitaciones de la técnica de ddPCR estándar es el número limitado de mutaciones que pueden ser defendidos por reacción, como sondas de hidrólisis específica reconociendo cada versión alélica posible son necesarias. Una metodología alternativa, el ddPCR de entrega, aumenta el rendimiento, ya que requiere solamente un solo par de sondas para detectar y cuantificar potencialmente todas las alteraciones genéticas en la región específica. Entrega ddPCR muestra sensibilidad comparable a ensayos ddPCR convencional con la ventaja de detectar un mayor número de mutaciones en una sola reacción. Es rentable, conserva muestras preciosas y puede usarse como una herramienta de descubrimiento cuando las mutaciones se desconocen a priori.

En un estudio de prueba de concepto, mutaciones del exón 2 de KRAS (codones 12 y 13) y EGFR exón 19 eliminaciones fueron investigados en los tejidos FFPE y las muestras de plasma de pacientes con cáncer mediante la entrega ddPCR estrategia6.
La punta de prueba KRAS entrega interrogó a una región de bp 16 que abarca múltiples mutaciones en el exón 2 del gen KRAS , que al...

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Este método se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico para el cáncer para analizar el ADN tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiples alteraciones genéticas en regiones de mutaciones en racimos en una sola reacción. Esto ayuda a guardar muestras preciosas de pacientes.Este método puede proporcionar información sobre la carga tumoral en su perfil mutacional. Ahora también se puede aplicar a un análisis molecular como alternativa a qPCR para obtener una cuantificación absoluta de las secuencias diana de ácido nucleico. Recoger muestras de sangre en tubos EDTA de siete mililitros.Se recomiendan dos tubos para recoger alrededor de cuatro mililitros de plasma. Centrifugar las muestras de sangre durante 10 minutos a 820 veces la gravedad dentro de las tres horas posteriores a la extracción de sangre para separar los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y el plasma. El tiempo entre el muestreo y la centrifugación es fundamental para obtener ADN de alto grado libre de células T no contaminado con ADN liberado de glóbulos blancos.Después de la centrifugación, utilice una pipeta serológica para recoger el sobrenadante sin tocar la capa de glóbulos blancos. Alrededor de dos mililitros de plasma generalmente se recuperan por tubo EDTA. Después de transferir los plasmos a dos tubos de mililitro, centrifugar las alícuotas a 16.000 veces la gravedad durante 10 minutos a 15 grados celsius para eliminar los desechos celulares.Recoja cuidadosamente el plasma sin alterar el pellet y transfiera a dos tubos criogénicos mililitros. Conservar a 80 grados Celsius negativos hasta que sea necesario. Comience agregando 400 microlitros de proteinasa K a un tubo de 50 mililitros.A continuación, agregue cuatro mililitros de plasma y 3,2 mililitros de tampón de lelisis ACL que contenga un microgramo de ARN portador del kit de extracción. Cierre el tubo y mezcle por vórtice durante 30 segundos para obtener una solución homogénea. Luego, incubar a 60 grados centígrados durante 30 minutos.Después de la incubación, añadir 7,2 mililitros de ACB tampón al lisato para optimizar la unión de los ácidos nucleicos circulantes a la membrana de sílice. Mezclar por vórtice durante 15 a 30 segundos. Luego, incuba el tubo sobre hielo durante cinco minutos.Coloque la columna y el extensor de 20 mililitros en la bomba de vacío. Cierre las porciones no utilizadas para permitir la aspiración al vacío. Después de centrifugar brevemente el tubo, introduzca cuidadosamente la mezcla en el extensor del tubo.A continuación, encienda la bomba de vacío y deje que el izado se extraiga completamente a través de las columnas. Retire y deseche el extensor de tubo. A continuación, aplique 600 microlitros de búfer ACW1 a la columna.Cuando el búfer ACW1 se haya dibujado a través de la columna, agregue 750 microlitros de búfer ACW2 y, por último, 750 microlitros de 96 a 100% etanol. A continuación, coloque la columna en un tubo de recogida limpio de dos mililitros y centrífuga a toda velocidad durante tres minutos para eliminar el etanol. Después de colocar la columna en un nuevo tubo de recogida de dos mililitros, abra la tapa y luego incubar a 56 grados Centígrados durante 10 minutos para secar la membrana por completo.Después de la incubación, coloque la columna en un tubo limpio de baja unión de 1,5 mililitros. Aplique cuidadosamente 36 microlitros de agua libre de RNase con 0,04%azida sódica. Luego, cierre la tapa e incubar a temperatura ambiente durante tres minutos.Centrifugar a toda velocidad de nuevo durante un minuto para eluir los ácidos nucleicos. Luego, almacene a 20 grados Celsius negativos hasta que sea necesario. Comience descongelando y equilibrando los componentes de reacción a temperatura ambiente en una campana PCR limpia.A continuación, prepare una mezcla de 20 veces de imprimaciones y sondas en agua destilada sin RNase y Dnase con cada imprimación a 18 micromolares de concentración y cada sonda a cinco micromolares de concentración. Para todas las reacciones PCR individuales, prepare una mezcla de muestra combinando 10 microlitros de dos veces ddPCR Supermix, un microlitro de 20 veces imprimadores y se mezclan sondas, y hasta 10 nanogramos de la muestra de ADN en 20 microlitros de agua destilada. Vórtice la mezcla de reacción a fondo para asegurar la homogeneidad.Y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo antes de la dosificación. Inserte el cartucho ddPCR en el soporte y cargue 20 microlitros de mezcla de reacción de muestra en los pozos medios del cartucho para la generación de gotas. Agregue 70 microlitros de aceite generador de gotas en los pozos inferiores.Inserte el cartucho con una junta en el generador de gotas. Las gotas se producirán en los pozos superiores del cartucho. Aspirar lenta y suavemente 40 microlitros de las gotas de los cartuchos y dispensar en una placa PCR de 96 pozos.Selle la placa PCR final con papel de aluminio utilizando un sellador de placas inmediatamente después de transferir las gotas para evitar la evaporación. Centrifugar brevemente la placa para recoger el contenido en la parte inferior de los pozos. Ejecute una amplificación de PCR convencional en un ciclor térmico.Cuando se complete la carrera, centrifuga brevemente la placa para recoger el contenido en la parte inferior de los pozos. Después de la amplificación de PCR, utilice el lector de gotas para contar las gotas negativas PCR positivas y PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes son resultados representativos obtenidos durante los pasos de optimización del ensayo ddPCR de entrega.Esta imagen muestra la detección de ADN mutante y ADN de tipo salvaje en una reacción que contiene ADN 100% mutante, ADN 5% mutante y ADN 100%salvaje. Esta imagen muestra ejemplos de muestras de plasma analizadas con los ensayos DdPCR de entrega de KRAS y EGFR que muestran la detección de un solo nucleótido y múltiples sustituciones en exón dos de KRAS y una eliminación en EGFR exón 19. Al intentar este procedimiento, es importante proceder cuidadosamente en cada paso con una atención especial en la generación de gotas, que es un paso crítico de este método.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores y clínicos en el campo de la investigación del cáncer optimizaran el análisis de mutaciones tumorales mediante biopsia líquida.

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Investigación

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Genetics

Genética

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

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Reacción en cadena de la polimerasa en gotas digitales para la detección de mutaciones de Indel en genes diana

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PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

Este video demuestra la técnica de reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para la cuantificación simultánea de regiones de ADN metiladas en diferentes poblaciones de glóbulos blancos como biomarcador temprano para el diagnóstico clínico y el pronóstico.

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La PCR de bloqueo de tipo salvaje seguida de secuenciación directa ofrece un método altamente sensible de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras.

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Reacción en cadena digital de la polimerasa (PCR) es una herramienta útil para la detección de alta sensibilidad de variantes de un solo nucleótido y ADN copia número variantes. Aquí, demostramos las más importantes consideraciones para la medición de variantes raras en el genoma mediante PCR digital con el formato de chip en tubo.

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Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

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Se describe un método de longitud de los fragmentos de restricción polimórficos-reacción en cadena de polimerasa mejorado para el genotipado de especies pufferfish por espectrometría de cromatografía / masa líquida. Una columna monolito de sílice de fase inversa se emplea para la separación de amplicones digeridos. Este método puede dilucidar las masas monoisotópicas de oligonucleótidos, que es útil para la identificación de la composición base.

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

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