La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología química, como la identificación de feromonas. La principal ventaja de esta técnica es que vincula nuevos compuestos a la función de las feromonas. Para comenzar este procedimiento, coloque de 15 a 30 lampreas de mar macho sexualmente maduras en un tanque provisto de 250 litros de agua aireada del lago Hurón, mantenida a 16-18 grados centígrados.

Para extraer el agua acondicionada por extracción en fase sólida, pásela desde el tanque a través del sistema de bombeo hasta la parte superior de la columna. El agua pasa a través de un lecho de dos kilogramos de resina polimérica de intercambio iónico moderadamente polar contenida en una serie de cuatro columnas de vidrio de un litro de capacidad. A continuación, retire el disolvente orgánico y coseche el extracto por evaporación rotativa durante cinco horas a presión reducida a 40 grados centígrados.

Para aislar las piscinas de fracciones, remoje el gel de sílice en la fase móvil inicial durante 30 minutos. Transfiera el gel con el solvente a una columna de vidrio y abra su válvula para permitir el paso de la fase móvil. A continuación, mezcle bien los extractos con gel de sílice y cárguelos en la columna de cromatografía líquida sobre el lecho de gel de sílice.

Eluirlos con un gradiente de 95% de cloroformo a metanol a 100% de metanol, lo que da como resultado un total de 2,5 litros, luego recoger el eluyente en viales individuales de 10 mililitros. Posteriormente, realice el experimento TLC en placas de gel de sílice prerrevestidas aplicando la muestra en la línea de inicio y sumergiendo la línea de inicio de la placa en el solvente en desarrollo en un tanque de vidrio sellado. Después de que el solvente en desarrollo llegue a la línea final, saque la placa del tanque y espere 10 minutos para que el solvente se evapore.

Visualice las manchas, primero bajo luz ultravioleta a 254 nanómetros, luego tiña la placa rociándola con una solución ácida de metanol al 5% de anisaldehído usando un rociador de cromatografía y calentándola a 85 grados Celsius durante tres minutos. Posteriormente, concentrar la fracción en un residuo por evaporación rotativa a presión reducida a 40 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos. Para realizar el registro de EOG, llene los electrodos capilares polares y los portaelectrodos de estado sólido, prefabricados con gránulos de cloruro de plata-plata, con cloruro de potasio de tres molares utilizando una micropipeta.

A continuación, inserte los electrodos polares en los portaelectrodos. A continuación, prepare 100 mililitros de L-arginina de 10 a menos cinco molares en agua filtrada con carbón vegetal de una solución madre de L-arginina de 10 a menos dos molares en agua desionizada en un matraz aforado. Para la curva de respuesta a la concentración, prepare 10 mililitros de diluciones 10 veces mayores de los grupos de fracciones.

Ahora, oriente una lamprea anestesiada en un soporte en forma de V y envuélvala con una toalla de papel húmeda para evitar la desecación. Inserte un tubo de agua aireada recirculante que contenga 50 miligramos por litro de MS222 en la cavidad bucal. Ajuste el caudal y asegúrese de que el agua salga a través de las aberturas branquiales para regar continuamente las branquias.

Enjuague el tubo de suministro de odorante con agua filtrada y conéctelo a la válvula montada en un micromanipulador. A continuación, coloque el tubo capilar de administración de odorante en la cavidad del epitelio olfativo para suministrar agua filtrada al epitelio olfativo y evitar la desecación cuando no se administren odorantes. A continuación, monte los electrodos de registro y referencia en los micromanipuladores.

Baje el electrodo de referencia sobre la piel externa cerca de las fosas nasales. Con el microscopio estereoscópico, baje el electrodo de registro para que apenas toque la superficie del epitelio olfativo. Posteriormente, transfiera la absorción del tubo de administración de odorante del agua filtrada de fondo a la solución de L-arginina de 10 a menos cinco molares.

Encienda la computadora, el amplificador, el filtro y el digitalizador. Usando el software del controlador de válvulas, programe el procedimiento para administrar un solo pulso de odorante de cuatro segundos marcando la casilla de T1, configurando T en cuatro segundos y marcando la casilla de T2.In el software de adquisición de datos, configure el modo de adquisición en un osciloscopio de alta velocidad. Haga clic en el icono Reproducir y, a continuación, haga clic en Iniciar en el controlador de válvulas para activar el pulso de odorante.

Comience a registrar el control en blanco, L-arginina, y luego los odorantes de concentraciones bajas a altas con un lavado de dos minutos de agua filtrada entre aplicaciones. Para identificar las fracciones conductualmente activas, aclimate a la lamprea de mar hembra sexualmente madura en la jaula de liberación en el laberinto durante cinco minutos. Libere la lamprea de mar y registre la cantidad acumulada de tiempo que la lamprea pasa en el canal experimental y de control, cada uno con agua de río, durante 10 minutos.

A continuación, aplique el estímulo de prueba al canal experimental asignado aleatoriamente en el vehículo al canal de control utilizando bombas peristálticas a velocidades constantes de 200 mililitros por minuto durante cinco minutos, luego aplique el estímulo de prueba en el vehículo durante 10 minutos adicionales y registre la cantidad acumulada de tiempo que la lamprea pasa en los canales experimental y de control. En este procedimiento, purifique aún más las fracciones activas en compuestos con cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna Sephadex LH-20. Preparar la muestra en 0,5 mililitros de la fase móvil inicial, cargándola en la columna de cloroformo a metanol y luego en la columna de metanol, y eluir las fracciones activas para producir el compuesto.

Disuelva y diluya el compuesto purificado en la fase móvil inicial de HPLC para formar una solución de 10 microlitros de aproximadamente un microgramo por mililitro. A continuación, transfiera la solución de muestra a los viales de HPLC y colóquelos en el muestreador automático de HPLC. Inyecte la muestra en la espectrometría de masas de ionización por electrospray y registre los espectros de espectrometría de masas de ionización por electrospray de alta resolución utilizando un espectrómetro de masas de cromatografía.

Disuelva completamente la muestra en los disolventes deuterados seleccionados para formar una solución con una concentración que oscila aproximadamente entre 0,1 y 10 miligramos por mililitro. Transfiera la solución de muestra a un tubo de RMN para registrar los espectros de RMN 1D y 2D en un espectrómetro de RMN de 900 megahercios. Aquí se muestra un espectrómetro de RMN de 600 megahercios.

Se identificaron cinco nuevas feromonas putativas de lamprea de mar y se dilucidaron sus estructuras con métodos espectrométricos y espectroscópicos. Estas feromonas putativas fueron estimuladoras del epitelio olfativo de la lamprea de mar adulta y tuvieron umbrales de detección bajos en los registros de electro-olfatogramas. En los ensayos de comportamiento de laberinto de dos opciones, las lampreas de mar hembras ovuladas fueron atraídas por Petromyzone A, Petromyzene A y Petromyzene B, y rechazadas por Petromyzone C. Al intentar este procedimiento interdisciplinario, es importante recordar coordinar los experimentos químicos y biológicos para llevar a cabo este protocolo iterativo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cristalografía de rayos X y las reacciones de derivatización para responder a preguntas adicionales como la estereoquímica de los compuestos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los productos naturales y la neuroetología exploraran la biosíntesis plausible y la función biológica de las feromonas en organismos acuáticos como la lamprea de mar. No olvide que trabajar con cloroformo puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en la cubierta química, usar guantes y gafas de seguridad, al manipular este reactivo.