Name: La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a aislar y caracterizar feromonas de lamprea de mar mediante extracción en fase sólida y cromatografía. Este método vincula compuestos novedosos a funciones de feromonas en ecología química.

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Agradecemos a la Estados Unidos geológico estudio Hammond Bay estación biológica para el uso de sus instalaciones de investigación y el personal del U.S. Fish y Wildlife Service y pesca y océanos de Canadá para proporcionar lampreas de mar. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones de la Comisión de pesca de los grandes lagos a Li Weiming y Ke Li.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Peces viven en un mundo químico completo de compuestos aún por identificarse. Fraccionamiento guiado por bioensayos se ha demostrado esencial para identificar y caracterizar moléculas bioactivas que median muchas interacciones químicas, como los observados en salmón masu31, elefantes asiáticos32y lampreas de mar33, 34,35. Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque eficaz t...

Las feromonas son señales químicas específicas por personas que les ayudan a localizar fuentes de alimento, detectar depredadores y mediar las interacciones sociales de sus congéneres1. Comunicación de feromonas en insectos ha sido bien estudiado2; sin embargo, la identificación química y función biológica de las feromonas vertebradas acuáticas no han sido estudiados tan extensamente. Conocimiento de la identidad y función de las feromonas liberado pueden aplicarse para facilitar la recuperación de especies amenazadas3,4 o el control de plagas especies5,6. La aplicación de estas técnicas requiere el aislamiento y la caracterización de los componentes bioactivos de la feromona.
Identificación de la feromona es una rama de la química de productos naturales. Progreso en la investigación de la feromona ha sido parcialmente limitada debido a la naturaleza de las moléculas de feromona se. Las feromonas son a menudo inestables y liberado en pequeñas cantidades, y existen sólo unas pocas técnicas de muestreo para detectar cantidades diminutas de volátiles7,8 o compuestos solubles en agua9. Enfoques para identificar las feromonas incluyen 1) una proyección específica de compuestos conocidos, 2) metabolómica y fraccionamiento 3) guiado por bioensayo. Una proyección específica de compuestos conocidos pruebas disponibles comercialmente los subproductos metabólicos de procesos fisiológicos que se presumen para funcionar como las feromonas. Este enfoque limita porque los investigadores sólo pueden probar compuestos conocidos y disponibles. Sin embargo, ha resultado en la identificación acertada de las hormonas sexuales en los peces de colores que funcionan como feromonas10,11,12. Metabolómica es un segundo enfoque de identificación de la feromona que distingue productos metabólicos posibles de molécula pequeña dentro de un sistema biológico13. Una comparación de los perfiles metabólicos de los dos grupos (es decir, un activo versus un extracto inactivo) permite la identificación de un perfil metabólico potencial de que el metabolito es purificado, es dilucidar la estructura y la bioactividad es confirmado14. Efectos aditivos o sinérgicos de complejas formulaciones de mezclas específicas suelen detectarse con metabolómica debido a metabolitos son considerados juntos en lugar de como una serie de fracciones13. Sin embargo, la aplicación de la metabolómica se basa en la disponibilidad de referencias sintéticas porque los datos resultantes no facilitan la elucidación de estructuras novedosas.
Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque integrado, iterativo que abarca dos campos: química y biología. Este enfoque utiliza los resultados de pruebas biológicas fisiológicas y de comportamiento para el aislamiento e identificación de un compuesto activo de la feromona. Un extracto crudo es fraccionado por una propiedad química (es decir, tamaño molecular, polaridad, etc.) y probado con grabaciones de electro-olfactogram (EOG) o en un bioensayo. Los componentes bioactivos se proyectan hacia fuera repitiendo estos pasos de fraccionamiento y EOGs o pruebas biológicas. Las estructuras de compuestos activos puros se esclareció por métodos espectroscópicos y espectrométricos, que el peso molecular e información estructural para producir una plantilla del compuesto a ser sintetizados. Fraccionamiento guiado por bioensayo puede producir diversos metabolitos y potencialmente nuevas feromonas con esqueletos química únicas que no puede predecirse desde las vías biosintéticas.
Aquí, describimos el protocolo de fraccionamiento guiado por bioensayo utilizado para aislar y caracterizar la actividad biológica de compuestos de feromonas sexo masculino lamprea de mar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) es un modelo vertebrado ideal para estudiar comunicación feromonas porque estos peces dependen en gran medida la detección olfativa de señales químicas para mediar su historia de vida anádromo conformada de tres etapas distintas: larvas, juveniles y adultos. Larvas de lamprea marina madriguera en el sedimento de las corrientes de agua dulce sufren una drástica metamorfosis y transforman en juveniles que migran a un lago o un océano donde que parasitan a peces de gran acogida. Después de la extracción de los pescados del anfitrión, los adultos migran hacia arroyos de desove, guiado por las feromonas migratorias publicadas por larvas de corriente residente15,16,17,18,19 . Los machos maduros ascienden para el desove, liberan una feromona sexual multicomponente para atraer a compañeros, aparecen intermitentemente durante aproximadamente una semana y luego mueren15,20. La identificación de las feromonas de la lamprea marina es importante porque una modulación del sistema de comunicación de feromona es entre las opciones consideradas para el control de las lampreas de mar invasivas en el Laurentian Great Lakes21.

<table><tbody><tr><td>Capilares de borosilicato de pared estándar de primera calidad con filamento&nbsp;</td><td>Electrodo</td> de registro y referencia <td>G150F-4</td> de Warner Instruments <td>(diámetro exterior 1,5 mm, diámetro interior 0,86 mm)</td></tr><tr><td>Instrumento extractor de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>tira de electrodos para EOG</td></tr><tr><td>Cortador de vidrio con punta de diamante</td> Punta de corte <td>genérica</td><td></td><td>de electrodos para EOG</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td> Tubo de administración de odorante <td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>para EOG</td></tr><tr><td>Portaelectrodos de registro Serie E cuerpo recto con pellet de Ag/AgCl para capilar de vidrio OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>Soporte de</td></tr><tr><td>electrodo de referencia Serie E con asa con&nbsp; Pellet de Ag/AgCl&nbsp; para capilar de vidrio OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>portaelectrodos</td></tr> de <tr><td>referencia pin de 1 mm pin</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>para puente portaelectrodos de referencia y registro</td></tr><tr><td>pin de 2 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>para puente portaelectrodos de referencia y registro</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>agar fundido para llenar electrodos</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl para llenar electrodos y portaelectrodos</td></tr><tr><td>Micropipeta microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>para llenar electrodos y portaelectrodos</td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>Odorante de control positivo para EOG</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua Hecho</td> a <td>medida</td><td>N/A</td><td>mantiene odorantes para EOG</td></tr><tr><td>Éster etílico del ácido 3-aminobenzoico (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaína1G</td><td>EOG anestésico</td></tr><tr><td>Trietiduro de gallamina</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG paralítico</td></tr><tr><td>1 mL jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>para administrar paralítico</td></tr><tr><td>Aguja subcutánea 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>para administrar paralizante</td></tr><tr><td>Pinza de rodillo</td><td>World Precision Instrumentos</td><td>14043-20</td><td>ajustar el caudal de anesíptico en la boca de la lamprea</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>para la preparación de un soporte de plástico en forma de V con solución salina al 0,9%</td></tr><tr><td>como etapa de muestra</td><td>El</td><td>N/A</td> hecho a medida <td>sostiene la lamprea durante el EOG</td></tr> El canal de plástico hecho a <tr><td></td><td>medida</td> N<td>/A</td><td>sostiene el soporte de plástico en forma de V durante el EOG</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>para la disección EOG</td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>para la disección EOG</td></tr><tr><td>Pinzas rectas ultrafinas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>para disección EOG, Pinzas Dumont #5SF Pinzas</td></tr><tr><td>ultrafinas curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-42</td><td>para disección EOG, Tijeras rectas</td></tr> <tr><td></td><td>Moria MC40BFine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>para la disección de EOG</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>para la disección de EOG</td></tr><tr><td>Luz iluminadora</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>para la disección de EOG</td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Genérico</td><td></td><td>para conectar la configuración de recirculación de EOG y los baños de agua</td></tr><tr><td>Tubo de suministro de odorante</td><td>Hecho a medida</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>en Filtro de línea y juego de juntas</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>para posicionar electrodos y aceite Tubo capilar</td></tr><tr><td>de suministro Dispositivos de sujeción magnéticos</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de válvulas</td><td>Arduino</td><td>hecho a medida</td><td>para controlar la apertura de la válvula para la estimulación de olores</td></tr><tr><td>Válvula electromagnética</td><td>Lee Válvula</td><td>de LFAA1201618H</td><td>para la estimulación de olores</td></tr><tr><td>NeuroLog Amplificador AC/DC</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>para aumentar la amplitud de la señal elíctica</td></tr><tr><td>NeuroLog DC preamplificador con cabecera</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>para aumentar la amplitud de la señal elíctica</td></tr><tr><td>Filtro de paso bajo de 60 Hz</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Ordenador Dell (OptiPlex 745) con software de adquisición de datos Axoscope</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope versión 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>Hecho a medida</td><td>N/A</td><td>Blindaje contra ruido electromagnético</td></tr><tr><td>Laberinto de dos opciones</td><td>Hecho a medida</td><td>N/A</td><td>Madera contrachapada impermeabilizada de grado marino cubierta con revestimiento de plástico</td></tr><tr><td>Bomba de basura</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>llena el laberinto con agua del río cercano</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica con tubería</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>para administrar odorantes en laberinto</td></tr><tr><td>Generador inversor</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>alimenta la bomba perstálica</td></tr><tr><td>Jaula de liberación Hecho</td><td>a medida</td><td>N/A</td><td>Se utiliza para aclimatar la lamprea en el laberinto</td></tr><tr><td>Malla</td><td>Genérico</td><td></td><td>utilizado para contener las dimensiones del laberinto y minimizar la turbulencia del agua con rodillos de malla</td></tr><tr><td>Cubetas (5 galones)</td><td>Genérico</td><td></td><td>para mezclar odorantes</td></tr><tr><td>Caudalímetro</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>para medir la descarga</td></tr><tr><td>XAD 7 HP resina</td><td>Dow chemical</td><td>37380-43-1</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Concentrador</td><td>para la extracción de agua acondicionada</td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma</td><td>CX1050</td><td>para el aislamiento de piscinas de fracciones</td></tr><tr><td>Gel de sílice 70-230 malla</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>para el aislamiento de piscinas de fracciones</td></tr><tr><td>Gel de sílice 230-400 malla</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>para el aislamiento de piscinas de fracciones Sílice</td></tr><tr><td>prerrevestida placas de gel TLC Sigma</td><td></td><td>99571</td><td>para el aislamiento de piscinas de fracciones</td></tr><tr><td>anisaldehído</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>para el aislamiento de piscinas de fracciones</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>para el aislamiento de piscinas de fracciones</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP resina</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>4, columnas de vidrio de 2.5L de capacidad</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas TQ-S TOF LC (o equivalente)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>para la elucidación de la estructura</td></tr><tr><td>Bomba binaria de HPLC</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>para el aislamiento de fracciones pools/compuestos</td></tr><tr><td>Espectrómetro de RMN Agilent, 900MHz (o equivalente)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>para la elucidación de estructuras</td></tr><tr><td>Sistema de secado Rotovap</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>para la extracción de agua acondicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Lámpara UV (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>para cromatografía en capa fina&nbsp;</td></tr></tbody></table>

la identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque iterativo que utiliza los resultados de pruebas biológicas fisiológicas y de comportamiento para el aislamiento e identificación de un compuesto activo de la feromona. Este método ha dado como resultado la acertada caracterización de las señales químicas que actúan como feromonas en una amplia gama de especies animales. Lampreas del mar dependen de olfato para detectar las feromonas que median las respuestas conductuales o fisiológicas. Utilizamos este conocimiento de la biología de peces para afirmar las funciones de las supuestas feromonas y para el aislamiento e identificación de los componentes de la feromona activa. Cromatografía se utiliza para extraer, concentrar y separar compuestos del agua condicionado. Electro-olfactogram (EOG) las grabaciones se llevan a cabo para determinar qué fracciones provocan respuestas olfativas. Ensayos conductuales laberinto dos opción entonces se utilizan para determinar si cualquiera de las fracciones los también son su comportamiento activo e inducen una preferencia. Métodos espectroscópicos y espectrométricos proporcionan el peso molecular e información estructural para ayudar en la aclaración de la estructura. La bioactividad de los puros se confirma con análisis de comportamiento y EOG. Las respuestas conductuales observadas en el laberinto, en definitiva, deberán validarse en un ambiente de campo para confirmar su función en un entorno natural de la corriente. Estas pruebas biológicas desempeñan un papel dual para 1) guiar el proceso de fraccionamiento y 2) confirmar y definir con mayor precisión la bioactividad de componentes aislados. Aquí, Divulgamos los resultados representativos de una identificación de la feromona de lamprea marina que ejemplifican la utilidad del enfoque fraccionamiento guiado por bioensayo. La identificación de las feromonas de la lamprea marina es particularmente importante porque una modulación de su sistema de comunicación de feromona es entre las opciones consideradas para el control de la lamprea de mar invasiva en el Laurentian Great Lakes. Este método se puede adaptar fácilmente para caracterizar la comunicación química en una amplia gama de taxa y arrojar luz sobre ecología química transmitidas por el agua.

En la figura 1muestra un diagrama que resume los pasos descritos en el protocolo de fraccionamiento guiado por bioensayo. El protocolo trata de pasos para aislar y caracterizar la estructura, la potencia olfativa y la actividad conductual de las 5 feromonas supuesta lamprea de mar (figura 2). Utilizando los datos de NMR (figura 3 y figura 4) y espectrometría de masa, las...

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y caracterizar la estructura, potencia olfativa y respuesta comportamiento de compuestos de feromonas putativos de lampreas de mar.

La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología química, como la identificación de feromonas. La principal ventaja de esta técnica es que vincula nuevos compuestos a la función de las feromonas. Para comenzar este procedimiento, coloque de 15 a 30 lampreas de mar macho sexualmente maduras en un tanque provisto de 250 litros de agua aireada del lago Hurón, mantenida a 16-18 grados centígrados.Para extraer el agua acondicionada por extracción en fase sólida, pásela desde el tanque a través del sistema de bombeo hasta la parte superior de la columna. El agua pasa a través de un lecho de dos kilogramos de resina polimérica de intercambio iónico moderadamente polar contenida en una serie de cuatro columnas de vidrio de un litro de capacidad. A continuación, retire el disolvente orgánico y coseche el extracto por evaporación rotativa durante cinco horas a presión reducida a 40 grados centígrados.Para aislar las piscinas de fracciones, remoje el gel de sílice en la fase móvil inicial durante 30 minutos. Transfiera el gel con el solvente a una columna de vidrio y abra su válvula para permitir el paso de la fase móvil. A continuación, mezcle bien los extractos con gel de sílice y cárguelos en la columna de cromatografía líquida sobre el lecho de gel de sílice.Eluirlos con un gradiente de 95% de cloroformo a metanol a 100% de metanol, lo que da como resultado un total de 2,5 litros, luego recoger el eluyente en viales individuales de 10 mililitros. Posteriormente, realice el experimento TLC en placas de gel de sílice prerrevestidas aplicando la muestra en la línea de inicio y sumergiendo la línea de inicio de la placa en el solvente en desarrollo en un tanque de vidrio sellado. Después de que el solvente en desarrollo llegue a la línea final, saque la placa del tanque y espere 10 minutos para que el solvente se evapore.Visualice las manchas, primero bajo luz ultravioleta a 254 nanómetros, luego tiña la placa rociándola con una solución ácida de metanol al 5% de anisaldehído usando un rociador de cromatografía y calentándola a 85 grados Celsius durante tres minutos. Posteriormente, concentrar la fracción en un residuo por evaporación rotativa a presión reducida a 40 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos. Para realizar el registro de EOG, llene los electrodos capilares polares y los portaelectrodos de estado sólido, prefabricados con gránulos de cloruro de plata-plata, con cloruro de potasio de tres molares utilizando una micropipeta.A continuación, inserte los electrodos polares en los portaelectrodos. A continuación, prepare 100 mililitros de L-arginina de 10 a menos cinco molares en agua filtrada con carbón vegetal de una solución madre de L-arginina de 10 a menos dos molares en agua desionizada en un matraz aforado. Para la curva de respuesta a la concentración, prepare 10 mililitros de diluciones 10 veces mayores de los grupos de fracciones.Ahora, oriente una lamprea anestesiada en un soporte en forma de V y envuélvala con una toalla de papel húmeda para evitar la desecación. Inserte un tubo de agua aireada recirculante que contenga 50 miligramos por litro de MS222 en la cavidad bucal. Ajuste el caudal y asegúrese de que el agua salga a través de las aberturas branquiales para regar continuamente las branquias.Enjuague el tubo de suministro de odorante con agua filtrada y conéctelo a la válvula montada en un micromanipulador. A continuación, coloque el tubo capilar de administración de odorante en la cavidad del epitelio olfativo para suministrar agua filtrada al epitelio olfativo y evitar la desecación cuando no se administren odorantes. A continuación, monte los electrodos de registro y referencia en los micromanipuladores.Baje el electrodo de referencia sobre la piel externa cerca de las fosas nasales. Con el microscopio estereoscópico, baje el electrodo de registro para que apenas toque la superficie del epitelio olfativo. Posteriormente, transfiera la absorción del tubo de administración de odorante del agua filtrada de fondo a la solución de L-arginina de 10 a menos cinco molares.Encienda la computadora, el amplificador, el filtro y el digitalizador. Usando el software del controlador de válvulas, programe el procedimiento para administrar un solo pulso de odorante de cuatro segundos marcando la casilla de T1, configurando T en cuatro segundos y marcando la casilla de T2.In el software de adquisición de datos, configure el modo de adquisición en un osciloscopio de alta velocidad. Haga clic en el icono Reproducir y, a continuación, haga clic en Iniciar en el controlador de válvulas para activar el pulso de odorante.Comience a registrar el control en blanco, L-arginina, y luego los odorantes de concentraciones bajas a altas con un lavado de dos minutos de agua filtrada entre aplicaciones. Para identificar las fracciones conductualmente activas, aclimate a la lamprea de mar hembra sexualmente madura en la jaula de liberación en el laberinto durante cinco minutos. Libere la lamprea de mar y registre la cantidad acumulada de tiempo que la lamprea pasa en el canal experimental y de control, cada uno con agua de río, durante 10 minutos.A continuación, aplique el estímulo de prueba al canal experimental asignado aleatoriamente en el vehículo al canal de control utilizando bombas peristálticas a velocidades constantes de 200 mililitros por minuto durante cinco minutos, luego aplique el estímulo de prueba en el vehículo durante 10 minutos adicionales y registre la cantidad acumulada de tiempo que la lamprea pasa en los canales experimental y de control. En este procedimiento, purifique aún más las fracciones activas en compuestos con cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna Sephadex LH-20. Preparar la muestra en 0,5 mililitros de la fase móvil inicial, cargándola en la columna de cloroformo a metanol y luego en la columna de metanol, y eluir las fracciones activas para producir el compuesto.Disuelva y diluya el compuesto purificado en la fase móvil inicial de HPLC para formar una solución de 10 microlitros de aproximadamente un microgramo por mililitro. A continuación, transfiera la solución de muestra a los viales de HPLC y colóquelos en el muestreador automático de HPLC. Inyecte la muestra en la espectrometría de masas de ionización por electrospray y registre los espectros de espectrometría de masas de ionización por electrospray de alta resolución utilizando un espectrómetro de masas de cromatografía.Disuelva completamente la muestra en los disolventes deuterados seleccionados para formar una solución con una concentración que oscila aproximadamente entre 0,1 y 10 miligramos por mililitro. Transfiera la solución de muestra a un tubo de RMN para registrar los espectros de RMN 1D y 2D en un espectrómetro de RMN de 900 megahercios. Aquí se muestra un espectrómetro de RMN de 600 megahercios.Se identificaron cinco nuevas feromonas putativas de lamprea de mar y se dilucidaron sus estructuras con métodos espectrométricos y espectroscópicos. Estas feromonas putativas fueron estimuladoras del epitelio olfativo de la lamprea de mar adulta y tuvieron umbrales de detección bajos en los registros de electro-olfatogramas. En los ensayos de comportamiento de laberinto de dos opciones, las lampreas de mar hembras ovuladas fueron atraídas por Petromyzone A, Petromyzene A y Petromyzene B, y rechazadas por Petromyzone C. Al intentar este procedimiento interdisciplinario, es importante recordar coordinar los experimentos químicos y biológicos para llevar a cabo este protocolo iterativo.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cristalografía de rayos X y las reacciones de derivatización para responder a preguntas adicionales como la estereoquímica de los compuestos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los productos naturales y la neuroetología exploraran la biosíntesis plausible y la función biológica de las feromonas en organismos acuáticos como la lamprea de mar. No olvide que trabajar con cloroformo puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en la cubierta química, usar guantes y gafas de seguridad, al manipular este reactivo.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Un método para rápidamente volátiles de las plantas huésped de pantalla mediante la medición de la respuesta electrofisiológica de la naranja ombligo adulto...

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

En este video, demostramos un ensayo para establecer la presencia de fosfolipasa en el extracto de veneno crudo de Anthopleura dowii, una anémona marina de mar. El ensayo utiliza una técnica de difusión en gel de agarosa, en la que la enzima fosfolipasa difunde y descompone los fosfolípidos incorporados en el medio sólido de manera radial.

Ensayo de actividad de fosfolipasa: un ensayo de difusión en gel para determinar la actividad de la fosfolipasa en extracto de veneno crudo de Anthopleura dowii

Lamprea de mar pierde la vesícula biliar y los conductos biliares durante la metamorfosis, un proceso similar a la atresia biliar humano. Un nuevo método de fijación y aclaración (CLARITY) se modificó para visualizar todo el árbol biliar mediante microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la degeneración biliar.

Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

Este bioensayo emplea un pez depredador modelo para evaluar la presencia de metabolitos de alimentación-disuasión a partir de extractos orgánicos de los tejidos de organismos marinos naturales en concentraciones utilizando una matriz de comida comparable nutricionalmente.

Un pez de amamantar Laboratorio Bioensayo para evaluar la actividad antidepredación de metabolitos secundarios de los tejidos de organismos marinos

En reptiles, los lípidos de la piel de sus congéneres son cruciales para la señalización sexual, con uso potencial en la gestión de especies invasoras. Aquí, describimos protocolos para la extracción de lípidos de la piel de la piel de la vertiente o animales enteros, determinar y analizar la masa total de lípidos y los lípidos cromatografía fraccionamiento mediante columna de separación.

Aislamiento químico, cuantificación y separación de los lípidos de la piel de los Reptiles

El registro extracelular multi-unidad del nervio olfativo es un método sensible, robusto y reproducible para evaluar la sensibilidad olfativa en peces marinos. Registra la entrada sensorial primaria y es independiente de la salinidad externa.

Grabación extracelular multiinsular del nervio olfativo de los teleosts

La caracterización espectrométrica de masas de neuropéptidos proporciona información de secuencia, cuantificación y localización. Este flujo de trabajo optimizado no solo es útil para estudios de neuropéptidos, sino también para otros péptidos endógenos. Los protocolos proporcionados aquí describen la preparación de muestras, la adquisición de EM, el análisis de EM y la generación de neuropéptidos en bases de datos utilizando LC-ESI-MS, maldi-MS spotting e imágenes MALDI-MS.

Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

Aquí, describimos un protocolo para obtener extracto de veneno crudo de la anémona de mar y detectar su actividad hemolítica y fosfolipasa.

Identificación de la actividad hemolítica y fosfolipasa en extractos crudos de anémonas de mar mediante bioensayos sencillos

Este trabajo tiene como objetivo evaluar y revisar el procedimiento de bioensayo de letalidad de Artemia salina , también identificado como ensayo de letalidad de camarones en salmuera. Este método simple y barato proporciona información sobre la toxicidad general (considerada como una evaluación preliminar de la toxicidad) de las muestras, es decir, los productos naturales.

Bioensayo de letalidad utilizando Artemia salina L.

Este protocolo establece métodos para extraer y cuantificar las respuestas a la feromona sexual volátil en C. elegans, proporcionando herramientas para estudiar la comunicación química y la trayectoria de navegación.

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Este protocolo presenta un flujo de trabajo totalmente automatizado para la extracción de geosmina y 2-metilisoborneol del agua y tejidos de peces ricos en lípidos. El método permite la detección temprana de estas moléculas antes de que alcancen los umbrales de olor. Se proporcionan datos representativos de un entorno acuícola.

Extracción y detección de geosmina y 2-metilisoborneol en agua y peces utilizando sondas de extracción por sorción de alta capacidad y GC-MS

Aprenda a aislar y caracterizar feromonas de lamprea de mar mediante extracción en fase sólida y cromatografía. Este método vincula compuestos novedosos a funciones de feromonas en ecología química.

La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

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