Name: Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a determinar el contenido de ficobiliproteínas en la cianobacteria Synechocystis mediante espectrofotometría. Este método permite cuantificar ficocianina y aloficocianina de forma eficiente y confiable.

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El protocolo fue adoptado de una anterior publicación11. T. Z., CH. D. y J. Č. fueron apoyados por el Ministerio de educación, juventud y deportes de la República Checa en el programa nacional de sustentabilidad (NPU I), concesión número LO1415. J. Č. también fue apoyada por el GA CR, número 18-24397S. Acceso a los instrumentos y otras instalaciones fue apoyado por la infraestructura de investigación Checa para Biología de sistemas C4SYS (no proyecto LM2015055). M. A. S. fue apoyado por una beca de la Fundación de la ciencia rusa [no. 14-14-00904].

1. cianobacterias cultivo

<ol><li>Cultivar células de Synechocystis en matraces Erlenmeyer o en fotobiorreactores10,19 en tampón BG11 medio20 a mantener un pH &lt; 10 (p. ej., con 17 mM HEPES10). Nota: Las condiciones de cultivo estándar requieren una temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, la temperatura óptima es de 35 ° C)21, iluminación (por lo general, una luz blanca de intensidad hasta 800 μmol [fotones] / [m2·s])21y un CO fuente 2 (en el fotobiorreactor de planas de 400 mL, el crecimiento de saturar la concentración de CO2 es 1.700 ppm)21.</li>
	<li>Para determinar la densidad de cultivo, medir la densidad óptica de la cultura mediante espectrofotometría a 730 nm (OD730) utilizando una cubeta con una trayectoria de la luz de 1 cm. por otra parte, contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro o una célula automatizada contador.</li>
</ol>2. preparación de muestras
<ol><li>Trabajo con baja radiación para evitar la degradación de ficobiliproteína.</li>
	<li>3 x 1 mL de suspensión de cultivo en tubos safe-lock de la cosecha. Uso se triplica para la estimación de errores técnicos en la medición. Para realizar el muestreo del cultivo bajo condiciones estériles, cosechar las células en una campana laminar y siga las prácticas de trabajo y seguridad adecuadas.</li>
	<li>Centrifugar las células a 15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min ponga atención en el rotor de la centrífuga correctamente equilibrada. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante. Asegúrese de no perturbar el sedimento.</li>
	<li>Poner las muestras en un congelador. Para almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras a-80 ° C. Esto es necesario para evitar la degradación de ficobiliproteína. Para el almacenamiento a corto plazo,-20 ° C es suficiente.</li>
	<li>Las muestras por congelación durante la noche. Para un adecuado proceso de liofilización, mantener la temperatura del condensador secador de congelación por debajo de-60 ° C y la presión en la cámara de congelar-secador alrededor de 1 hPa.</li>
	<li>Después de terminar el ciclo de liofilización, cierre el tubo tan pronto como sea posible para evitar la reabsorción de agua desde el aire.</li>
</ol>3. célula de homogeneización y extracción de pigmentos
<ol><li>Añadir cuatro pedazos de granos de cristal (con un diámetro de 2 mm) a cada tubo de muestra y cerrar los tubos. Nota: Cuando la tapa del tubo de safe-lock usado para la homogeneización es demasiado fina, puede romper durante la homogeneización; por lo tanto, sólo el safe-lock tubos con tapas fuertes se recomiendan para este protocolo.</li>
	<li>Homogeneizar las muestras con los granos de cristal de 15 s en un homogeneizador a temperatura de laboratorio. Nota: Una muestra bien homogeneizada se extiende sobre la superficie interna entera de los tubos safe-lock.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón PBS (pH 7.4), preenfriado a 4 ° C, para las muestras con el fin de extraer ficobiliproteínas. Nota: De este paso, mantener las muestras en hielo para evitar la degradación de las proteínas extraídas. Esto es fundamental.</li>
	<li>Mezclar las muestras con PBS durante 5 s en el homogenizador a temperatura de laboratorio. Nota: Después de mezclar, las muestras son de color verdosas.</li>
	<li>Después de mezclar, mantener las muestras en hielo durante 60 minutos tapa el baño de hielo con una tapa para evitar la degradación de pigmentos.</li>
	<li>Después de 60 min de ficobiliproteína extracción, centrifugar las muestras a 15.000 x g a 4 ° C por 5 min atención para equilibrar adecuadamente el rotor de la centrífuga. Nota: Después de la centrifugación, el sobrenadante tiene un color azul cian.</li>
</ol>4. ficobiliproteína cuantificación
<ol><li>Antes de la medición espectrofotométrica, calibrar el espectrofotómetro a la línea de base utilizando el tampón de PBS como un blanco.</li>
	<li>Una vez calibrado el espectrofotómetro es descartar el PBS de una cubeta de espectrofotómetro y pipetear el sobrenadante con ficobiliproteínas extraído en vez de con el tampón de desecho.</li>
	<li>Cuantificar la concentración de ficobiliproteína mediante espectrofotometría, utilizando un ancho de corte de 0.5 nm.<ol>
<li>Medir la absorbencia de la phycocyanobilins en ficocianina y allophycocyanin contra el tampón de PBS en blanco a 615 nm (un615) y 652 nm (A652), respectivamente, y medir la absorbencia de la ruina celular a 720 nm (un720).</li>
		<li>Calcular la concentración de ficocianina y allophycocyanin según las ecuaciones (1) y (2) de Bennett y Bogorad12: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq2.jpg"> Nota: A615, A652y un720 deben ajustarse a la gama de absorbancia lineal del espectrofotómetro. Si es necesario, diluir la muestra con tampón PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular la concentración de pigmento en las muestras originales. La concentración de pigmento en la muestra se corresponde directamente con los resultados de las ecuaciones (1) y (2) cuando 1 mL de cultivo y 1 mL de la solución de extracción se utilizan para el análisis. En caso de utilizar diferentes volúmenes de las muestras de cianobacterias o tampón PBS, la concentración de pigmento final debe calcularse según la ecuación (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq3.jpg">(3) Nota: En caso de un contenido de ficobiliproteína normalización por peso seco de la célula, la concentración de pigmento final se calculará según la ecuación (4)<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq4.jpg"> (4)</li>
</ol>5. determinación del peso seco celular (opcional)
<ol><li>Pesan tres tubos safe-lock vacíos en balanzas analíticas. PRECAUCIÓN: Es fundamental que los tubos safe-lock están secos. En el caso de almacenar los tubos en un ambiente húmedo, secar los tubos durante varias horas en congelar secador antes de pesarles. Manipular los tubos suavemente y sólo con las manos enguantadas para evitar cualquier contacto entre el material y los dedos del investigador libre de polvo. Mantenga todos los titulares y limpia para evitar a la transferencia de cualquier material de los tubos de centrífuga.</li>
	<li>1 x 15 mL de suspensión de cultivo en tubo cónico de 15 mL de la muestra.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de la cultura en los tubos cónicos de 15 mL a 4.000 x g a temperatura de laboratorio durante 10 min equilibrio del rotor de la centrífuga con tres adicionales 15 mL tubos cónicos, cada uno conteniendo 15 mL de agua. Después de la centrifugación, descartar 12 mL del sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y la transferencia de 3 x 1 mL de la mezcla de tres tubos safe-lock de 1,5 mL con una pipeta. En el caso de algunas sobras de la pelotilla permanecen en el tubo cónico de 15 mL, agregar 1,5 mL de agua desionizada al tubo cónico, vortex o agitar el tubo para suspender de nuevo los restantes de la pelotilla y transferencia de 3 x 0,5 mL de la mezcla de los tres tubos de safe-lock de 1,5 mL (ya containi 3 x 1 mL de la pelotilla del ng) con una pipeta. Nota: Dividir la pastilla en tres tubos safe-lock de 1,5 mL permitirá la estimación de cualquier error técnico de medición de peso seco.</li>
	<li>Centrifugar las células en tubos safe-lock de 1,5 mL a 15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min equilibrio del rotor de la centrífuga con un tubo adicional de safe-lock de 1,5 mL que contiene 1 mL de agua. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Poner las muestras en el congelador. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras a-80 ° C; para el almacenamiento a corto plazo,-20 ° C es suficiente.</li>
	<li>Las muestras por congelación durante la noche. Para un adecuado proceso de liofilización, mantener la temperatura del condensador secador de congelación por debajo de-90 ° C y la presión en la cámara de congelar-secador alrededor de 1 hPa.</li>
	<li>Después de la liofilización, cierre los tubos y pese las muestras en balanzas analíticas. Nota: El valor del peso seco puede utilizarse para la normalización de los contenidos de ficobiliproteína por peso seco de la célula.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método sencillo, rápido y reproducible para la cuantificación del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Se comparan varios métodos de homogeneización de la célula, extracción de proteínas y cuantificación de ficocianina y allophycocyanin y el protocolo final representa una combinación de lo óptimo de cada procedimiento individual. Como datos representativos, se cuantificó el contenido de ficobiliproteínas en Synechocystis células cada vez m...

fPhycobiliproteins son complejos de proteína pigmento soluble en agua que representan los componentes principales de las antenas de luz-cosechar en procariotas cianobacterias (Cyanophyta) y varios taxones eucariotas (Glaucophyta, Rhodophyta y Cryptophyta)1. Se producen principalmente como complejos supramoleculares llamados phycobilisomes y por lo general se unen a la superficie de las membranas fotosintéticas en el lado del estroma, a excepción de Cryptophyta, donde se localizan las ficobiliproteínas en la tilacoides lumen2. Hasta la fecha se han identificado cuatro tipos de ficobiliproteínas: el núcleo allophycocyanin y la ficocianina, ficoeritrina y phycoerythrocyanin periférica1. Como los complejos principales de recolección de luz, phycobilisomes representan uno de los factores cruciales de la productividad de culturas masivas de algas y cianobacterias. Se ha demostrado que phycobilisomes truncamiento puede aumentar la acumulación de biomasa bajo luz fuerte3. Por otra parte, con irradiación moderada o baja, el truncamiento de la antena daba como resultado tasas de crecimiento y acumulación de biomasa reducción3,4. Ficobiliproteínas comercialmente se utilizan como colorantes de alimentos, productos farmacéuticos y aditivos alimentarios, en la industria cosmética y fluorescencia sondas con aplicaciones en citometría de flujo, inmunoensayos fluorescentes y microscopía de fluorescencia5.
Este protocolo se centra en la determinación cuantitativa de ficobiliproteínas en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Cianobacterias están el primeros autótrofos fotosíntesis oxygenic; ha formando la Biosfera de la tierra por más de 2,4 billones de años6. Desempeñan un papel crucial en los ciclos biogeoquímicos globales de nitrógeno, carbono, oxígeno y otros elementos. Entre cianobacterias, una cepa unicelular Synechocystis ganó una posición única ya que fue el primer cianobacteria con la totalidad del genoma secuenciado7,8, es naturalmente transformable por ADN exógeno9, y realiza un crecimiento estable y relativamente rápido de10,11. En Synechocystis, el componente base de antena, allophycocyanin, se asocia con las proteínas integrales de membrana y la ficocianina adjunto se encuentra en la periferia de la membrana del thylakoid.
Varios métodos para la extracción de ficobiliproteína y cuantificación se comparan dentro de este protocolo. El procedimiento de extracción final fue aplicado con éxito para Synechocystis, así como a otras cepas de cianobacterias, incluyendo Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.y Nostoc SP. y se aplicó con éxito a algas rojas Porphyridium cruentum. Por lo tanto, el método desarrollado en este protocolo puede considerarse como un método universal para la extracción de ficobiliproteína. A pesar de que algunos de los métodos de extracción probadas resultaron en mayores rendimientos de proteína total, aquí describe procedimiento de extracción siempre ficobiliproteína más rendimientos con el menor contenido de clorofila un residuo en el Extracto de ficobiliproteína. Reducir el contenido de clorofila a fue esencial para la correcta ficocianina y cuantificación espectrofotométrica allophycocyanin.
Los espectros de absorción de ficobiliproteína pueden variar significativamente entre diferentes algas y cianobacterias especies12,13,14,15,16,17 e incluso entre varias cepas de un género de cianobacterias solo18. Por lo tanto, las longitudes de onda específicas y coeficientes de absorción según lo utilizado para la determinación de ficocianina y allophycocyanin en Synechocystis no son generalmente aplicables a otras cepas. Además, Synechocystis no contienen ficoeritrina y phycoerythrocyanin que se puede encontrar en algunas algas y cianobacterias. A los efectos de la determinación de ficobiliproteínas en cepas que no sean de Synechocystis, se recomienda evaluar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.
Aunque el protocolo contiene dos pasos más (durante la noche la liofilización de los pellets celulares y extracción de proteínas de 1 hora), el tiempo de trabajo total para la cuantificación de ficobiliproteínas es no más de 2 horas.

<table><tbody><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>Institut Pasteur, París, Francia</td><td>6803</td><td>Cepa de cianobacteria</td></tr><tr><td>Roti-CELL PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>9143.1</td><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4</td></tr><tr><td>Tubos de bloqueo seguro Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburk, Alemania</td><td>30120086</td><td>Tubos con cierre de seguridad 1,5 ml</td></tr><tr><td>Sistema de almacenamiento de 80 plazas</td><td>VWR VWR International, Radnor, Pensilvania, EE. UU</td>. <td>30128-282</td><td>Soporte para tubos con cierre de seguridad&nbsp;</td></tr><tr><td>RAININ 100 &micro; l -1000 y micro; l&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, EE. UU.</td><td>17014382</td><td>Pipeta</td></tr><tr><td>GP-LTS-A-1000&micro; L-/F-768/8</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, EE. UU.</td><td>30389272</td><td>Puntas de pipeta</td></tr><tr><td>Rotina 420R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Alemania</td><td>4701</td><td>Centrífuga refrigerada para tubos de cierre seguro de 1,5 ml y tubos de centrífuga cónicos de 15 ml</td></tr><tr><td>LCexv 4010</td><td>Liebherr, Bulle, Suiza</td><td>9005382197172</td><td>Refrigerador y congelador -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Revco ExF -86&deg; C Congelador vertical de temperatura ultrabaja</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU</td><td>. EXF24086V&nbsp;</td><td>Congelador -80&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>CoolSafe</td><td>LaboGene, Liller &oslash; d, Dinamarca</td><td>7.001.000.615</td><td>Liofilizador&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-2600</td><td>Shimadzu, Kioto, Japón</td> Espectrofotómetro <td>UV-2600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubetas de absorción Hellma, semi Micro</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU</td><td>. Z600288&nbsp;</td><td>Cubetas semimicro VIS/UV-VIS 0,75-1,5 ml, rango espectral 200-2500 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Silamat S6</td><td>Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein</td><td>602286WU</td><td>Homogeneizador&nbsp;</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio macizo</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU</td>. <td>Z273627</td><td>Perlas de vidrio de diámetro 2&nbsp; mm</td></tr><tr><td>CPA225D-0CE</td><td>Sartorius AG, G&ouml; ttingen, Alemania</td><td>SECURA225D-1OBR</td><td>Balanzas analíticas</td></tr><tr><td>C-Ficocianina de Spirulina sp.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.</td><td>P2172</td><td>Estándar de ficocianina</td></tr><tr><td>Aloficocianina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.</td><td>A7472</td> Kit de ácido bicinconínico <td>estándar de aloficocianina</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.</td><td>BCA1, B9643</td><td>Kit completo para la determinación de proteínas totales</td></tr><tr><td>AlgaeTron&nbsp;</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, República Checa</td><td>AG 130-ECO&nbsp;</td><td>Cámara de cultivo de matraces E., con luz y atmósfera controlables</td></tr><tr><td>Fotobiorreactor</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, República Checa</td><td>FMT-150</td><td>Equipo de cultivo para cianobacterias y algas con entorno completamente controlable</td></tr><tr><td>Celómetro&nbsp;</td><td>Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, EE. UU.</td><td>Auto M10</td><td>Contador de celdas</td></tr><tr><td>Corning Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU</td><td>. CLS430791&nbsp;</td><td>Tubo de centrífuga de 15 ml para la toma de muestras de peso seco</td></tr><tr><td>Herasafe KS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.</td><td>51024579</td><td>Campana de flujo laminar</td></tr></tbody></table>

determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Esto es un protocolo simple para la determinación cuantitativa del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Ficobiliproteínas son los componentes más importantes de phycobilisomes, las antenas principales de recolección de luz en cianobacterias y varios taxones de algas. Phycobilisomes de Synechocystis contienen dos ficobiliproteínas: ficocianina y allophycocyanin. Este protocolo describe un simple, eficiente y confiable método para la determinación cuantitativa de ficocianina y allophycocyanin en esta cianobacteria modelo. Se compararon varios métodos de extracción de ficobiliproteína y cuantificación espectrofotométrica. El procedimiento de extracción como se describe en este protocolo se aplicó con éxito a otras cepas de cianobacterias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., y Nostoc SP., así como las algas rojas Porphyridium cruentum. Sin embargo, los coeficientes de extinción de ficobiliproteínas específicos de distintos taxones pueden variar y por lo tanto, se recomienda validar el método de cuantificación espectrofotométrica para cada cepa individual. El protocolo requiere poco tiempo y puede realizarse en cualquier laboratorio de Ciencias de la vida estándar ya que requiere equipos estándar.

Para las pruebas del método inicial, Synechocystis fue cultivado como culturas lote en matraces Erlenmeyer en una coctelera en BG11 cultivo medio20 (complementado con 17 mM HEPES) a 25 ° C, bajo una luz blanca cálida de una intensidad de 50 μmol (fotones) / (m 2·s) y con 1% de CO2 en la atmósfera de cultivo. Durante el cultivo, los cultivos fueron muestreados a los tubos safe-lock y centrifugaron (15.000 x g a temperatura de ...

Aquí, presentamos un protocolo para determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystis mediante un método espectrofotométrico. El procedimiento de extracción fue aplicado con éxito a otras cepas de cianobacterias y algas; sin embargo, debido a variaciones en los espectros de absorción del pigmento, es necesario probar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.

Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

El objetivo general de este protocolo es determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteínas en la cianobacteria modelo Synechocystis utilizando un método espectrofotométrico. Las ficobiliproteínas son complejos pigmento-proteína solubles en agua que representan los componentes principales de las antenas recolectoras de luz en cianobacterias procariotas y varios grupos de algas eucariotas. Dado que son los principales complejos recolectores de luz, las ficobiliproteínas representan uno de los factores cruciales que determinan la productividad de las algas y las cianobacterias.Synechocystis es una cianobacteria modelo que se utiliza en cientos de laboratorios en todo el mundo. Synechocystis contiene dos ficobiliproteínas, ficocianina y aloficocianina. Este protocolo describe un método simple, eficiente y confiable para la determinación cuantitativa de ambas ficobiliproteínas en esta cepa de moho.Se compararon varios métodos, extracción de ficobiliproteínas y cuantificación espectrofotométrica. El método de cuantificación debe probarse para cada cepa, ya que los espectros de absorción de ficobiliproteínas pueden variar entre diferentes cepas. Al comienzo de la extracción de ficobiliproteínas, transfiera un mililitro de cultivo de cianobacterias a un tubo con cierre seguro.Si decide determinar el peso seco de las muestras, pese los tubos vacíos antes de la toma de muestras de cultivo. Asegúrese de que el cultivo no esté sedimentado. Centrifugar las células a 15.000 g a temperatura de laboratorio durante cinco minutos.Deseche con cuidado el sobrenadante. Asegúrese de no alterar el pellet. Coloque las muestras en el congelador.Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las muestras a 80 grados centígrados. Esto es necesario para evitar la degradación de las ficobiliproteínas. Una vez que las muestras estén congeladas, insértelas en el liofilizador.Una vez que haya comenzado la liofilización, verifique la temperatura y la presión en el liofilizador. La temperatura tiene que estar por debajo de los 60 grados centígrados y la presión tiene que ser de alrededor de una hectárea Pascal. Liofiliza las muestras durante la noche.Después de terminar el ciclo de liofilización, cierre los tubos lo antes posible para evitar la reabsorción de agua del aire. Agregue cuatro piezas de perlas de vidrio de dos mililitros a cada tubo de muestra. Homogeneizar las muestras con las perlas de vidrio durante 15 segundos.La muestra correctamente homogeneizada se distribuye por toda la superficie interna de los tubos de cierre seguro. Después de la homogeneización de las células, agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato a las muestras para extraer las ficobiliproteínas. El pH óptimo del PBS es de alrededor de 7,4.Mezcle las celdas con el PBS durante cinco segundos en el homogeneizador. Esto asegurará una mezcla óptima de la muestra para una extracción eficiente de ficobiliproteínas. Después de mezclar, las muestras son verdosas.Mantenga las muestras en hielo durante 60 minutos para la extracción más eficiente de ficobiliproteínas. Después de la extracción, centrifugar las muestras a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante tiene un color azul cian.Antes de la medición espectrofotométrica, calibre el espectrofotómetro utilizando el PBS como blanco. Una vez calibrado el espectrofotómetro, se desecha el PBS de una cubeta de espectrofotómetro y se pipetea el sobrenadante con las ficobiliproteínas extraídas en lugar del tampón desechado. Para la cuantificación de ficocianinas y aloficocianinas, el sobrenadante con ficobiliproteínas extraídas se mide a 615, 652 y 720 nanómetros.Como se describe en el texto, existen varias ecuaciones para la cuantificación de ficobilisomas conocidas en la literatura. La ecuación utilizada en este protocolo resultó ser la que mejor correlaciona las concentraciones de ficocianina y aloficocianina como los pigmentos y los puntos. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización y extracción de células, que deben proporcionar tanto un alto rendimiento como una alta especificidad.Probamos varios procedimientos de extracción, como la disrupción celular por sonicación, la homogeneización con perlas de circonio o la congelación del enlace celular. El método de este protocolo proporcionó el mayor rendimiento de ficobilisomas. Dado que incluso una pequeña contaminación del extracto proteico por clorofila puede llevar a una sobreestimación del contenido de ficobiliproteínas, es necesario evitar cualquier extracción de clorofila de las células.Detectamos clorofila en el extracto crudo y, a continuación, utilizamos la sonicación para la disrupción celular. Con la repetición de los ciclos de sonicación, la concentración de clorofila aumentó. El tiempo de homogeneización se optimizó a 15 segundos.La homogeneización durante cinco segundos y 20 segundos proporcionó rendimientos ligeramente inferiores. La adición de cloruro de sodio o potasio al tampón PBS o al agua, no aumentó la eficiencia de la extracción de ficobiliproteínas, al igual que la extracción en tampón de acetato de sodio. El tiempo de extracción de ficobiliproteínas se optimizó para 60 minutos, ya que después de 120 e incluso 240 minutos, la concentración de ficobiliproteínas no cambió significativamente.Asegúrese de que la absorbancia a 615, 652 y 720 nanómetros se ajuste al rango de absorbancia cercana del espectrofotómetro. El espectrofotómetro utilizado en este protocolo muestra el rango de absorbancia cercana entre 0,1 y tres. Se compararon varias ecuaciones de cuantificación espectrofotométrica de ficobiliproteínas conocidas en la literatura.La ecuación de Bennett y Bogorad proporcionó la mejor reconstrucción del contenido de ficocianina y aloficocianina en los patrones de pigmentos con concentraciones de proteínas conocidas. Las diferencias entre las ecuaciones individuales están relacionadas con las variaciones en los coeficientes de extinción de las ficobiliproteínas del organismo específico. El uso de sulfato de estreptomicina no condujo a la reducción de la clorofila A en las muestras en las que se aplicó o evitó la sonicación.Como dato representativo, se determinó el contenido de ficobiliproteínas en células de Synechocystis. El contenido de ficobiliproteínas disminuyó con el aumento de la luz. El protocolo se estableció para minimizar los requisitos de tiempo y equipo para el análisis escrito de pigmentos que se puede realizar en cualquier laboratorio estándar de ciencias en vivo.Además, el protocolo contiene otros dos pasos, como la liofilización del pellet celular y la extracción de proteínas. El tiempo total de trabajo para la cuantificación de los ficobilisomas no es superior a dos horas.

spectrophotometric-determination-phycobiliprotein-content

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fuente: Weber, N. et. al., Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra un ensayo basado en LED enfocado para estudiar la fototaxis en cianobacterias filamentosas. Las bacterias migran hacia la fuente de luz, formando una densa acumulación en el centro iluminado, que se visualiza y cuantifica mediante el análisis de intensidad de píxeles de la imagen capturada.

Ensayo de fototaxis de cianobacterias filamentosas utilizando iluminación de luz focalizada

Fuente: Jiang, H., Ho, M. Aislamiento y caracterización de ficobilisomas intactos en cianobacterias. J. Vis. Exp.(2021).Este video demuestra el procedimiento para cultivar cianobacterias para obtener biomasa mediante el cultivo de células bajo iluminación continua con suministro de dióxido de carbono y condiciones ricas en nutrientes, seguido de la recolección mediante centrifugación.

Preparación de cultivos de cianobacterias para la producción de biomasa

Fuente: Zhan, Y., et al. El fotoblanqueo permite la obtención de imágenes de superresolución del anillo FtsZ en el cianobacterio Prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra el procedimiento para el fotoblanqueo de pigmentos en células cianobacterianas utilizando luz de xenón en condiciones de frío para mejorar la imagen de fluorescencia de proteínas reguladoras del crecimiento.

Fotoblanqueo de pigmentos cianobacterianos para la obtención de imágenes de proteínas reguladoras del crecimiento

Aquí, presentamos un ensayo fiable y fácil para medir el contenido de glucógeno en células de cianobacterias. El procedimiento implica precipitación, despolimerización seleccionable y la detección de residuos de glucosa. Este método es adecuado para cepas de tipo salvaje y genéticamente modificadas y puede facilitar la ingeniería metabólica de las cianobacterias.

Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Aquí se describe un método de fotoblanqueo para reducir la autofluorescencia de las cianobacterias. Después de photobleaching, microscopia óptica estocástica de la reconstrucción se utiliza para obtener imágenes de resolución súper tridimensional del anillo de FtsZ cianobacterias.

Fotoblanqueo permite proyección de imagen de súper-resolución del anillo de FtsZ en la cianobacteria Prochlorococcus

Aquí, se describen los protocolos para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados por cianobacterias y el aislamiento de sus exoproteomes. Ambos procedimientos incorporan pasos clave para obtener polímeros o proteínas con grados de alta pureza que se pueden utilizar para análisis o aplicaciones adicionales. También se pueden adaptar fácilmente según las necesidades específicas del usuario.

Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

El presente protocolo describe imágenes de autofluorescencia paso a paso y la evaluación de los cambios de ficobiliproteína en algas rojas basadas en análisis espectral. Este es un método no destructivo y sin etiquetas para evaluar la adaptación celular a hábitats extremos, cuando solo hay material escaso disponible y las células crecen lentamente, o no crecen en absoluto, en condiciones de laboratorio.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar la fisiología de las algas rojas

La adsorción de péptidos a los materiales de plástico durante las diluciones en serie tradicionales basadas en puntas puede afectar significativamente la determinación de la potencia y confundir la comprensión de las relaciones estructura-actividad utilizadas para las fases de identificación y optimización de pistas del descubrimiento de fármacos. Aquí se describen los métodos para la dilución en serie acústica automatizada sin contacto de muestras de péptidos.

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

Los ensayos de competición de péptidos se usan ampliamente en una variedad de experimentos moleculares e inmunológicos. Este documento describe un método detallado para un ensayo de quinasa que compite con oligopéptido in vitro y los procedimientos de validación asociados, que pueden ser útiles para encontrar sitios de fosforilación específicos.

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Aprende a determinar el contenido de ficobiliproteínas en la cianobacteria Synechocystis mediante espectrofotometría. Este método permite cuantificar ficocianina y aloficocianina de forma eficiente y confiable.

Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

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