Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

El objetivo general de este protocolo es determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteínas en la cianobacteria modelo Synechocystis utilizando un método espectrofotométrico. Las ficobiliproteínas son complejos pigmento-proteína solubles en agua que representan los componentes principales de las antenas recolectoras de luz en cianobacterias procariotas y varios grupos de algas eucariotas. Dado que son los principales complejos recolectores de luz, las ficobiliproteínas representan uno de los factores cruciales que determinan la productividad de las algas y las cianobacterias.

Synechocystis es una cianobacteria modelo que se utiliza en cientos de laboratorios en todo el mundo. Synechocystis contiene dos ficobiliproteínas, ficocianina y aloficocianina. Este protocolo describe un método simple, eficiente y confiable para la determinación cuantitativa de ambas ficobiliproteínas en esta cepa de moho.

Se compararon varios métodos, extracción de ficobiliproteínas y cuantificación espectrofotométrica. El método de cuantificación debe probarse para cada cepa, ya que los espectros de absorción de ficobiliproteínas pueden variar entre diferentes cepas. Al comienzo de la extracción de ficobiliproteínas, transfiera un mililitro de cultivo de cianobacterias a un tubo con cierre seguro.

Si decide determinar el peso seco de las muestras, pese los tubos vacíos antes de la toma de muestras de cultivo. Asegúrese de que el cultivo no esté sedimentado. Centrifugar las células a 15.000 g a temperatura de laboratorio durante cinco minutos.

Deseche con cuidado el sobrenadante. Asegúrese de no alterar el pellet. Coloque las muestras en el congelador.

Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las muestras a 80 grados centígrados. Esto es necesario para evitar la degradación de las ficobiliproteínas. Una vez que las muestras estén congeladas, insértelas en el liofilizador.

Una vez que haya comenzado la liofilización, verifique la temperatura y la presión en el liofilizador. La temperatura tiene que estar por debajo de los 60 grados centígrados y la presión tiene que ser de alrededor de una hectárea Pascal. Liofiliza las muestras durante la noche.

Después de terminar el ciclo de liofilización, cierre los tubos lo antes posible para evitar la reabsorción de agua del aire. Agregue cuatro piezas de perlas de vidrio de dos mililitros a cada tubo de muestra. Homogeneizar las muestras con las perlas de vidrio durante 15 segundos.

La muestra correctamente homogeneizada se distribuye por toda la superficie interna de los tubos de cierre seguro. Después de la homogeneización de las células, agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato a las muestras para extraer las ficobiliproteínas. El pH óptimo del PBS es de alrededor de 7,4.

Mezcle las celdas con el PBS durante cinco segundos en el homogeneizador. Esto asegurará una mezcla óptima de la muestra para una extracción eficiente de ficobiliproteínas. Después de mezclar, las muestras son verdosas.

Mantenga las muestras en hielo durante 60 minutos para la extracción más eficiente de ficobiliproteínas. Después de la extracción, centrifugar las muestras a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante tiene un color azul cian.

Antes de la medición espectrofotométrica, calibre el espectrofotómetro utilizando el PBS como blanco. Una vez calibrado el espectrofotómetro, se desecha el PBS de una cubeta de espectrofotómetro y se pipetea el sobrenadante con las ficobiliproteínas extraídas en lugar del tampón desechado. Para la cuantificación de ficocianinas y aloficocianinas, el sobrenadante con ficobiliproteínas extraídas se mide a 615, 652 y 720 nanómetros.

Como se describe en el texto, existen varias ecuaciones para la cuantificación de ficobilisomas conocidas en la literatura. La ecuación utilizada en este protocolo resultó ser la que mejor correlaciona las concentraciones de ficocianina y aloficocianina como los pigmentos y los puntos. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización y extracción de células, que deben proporcionar tanto un alto rendimiento como una alta especificidad.

Probamos varios procedimientos de extracción, como la disrupción celular por sonicación, la homogeneización con perlas de circonio o la congelación del enlace celular. El método de este protocolo proporcionó el mayor rendimiento de ficobilisomas. Dado que incluso una pequeña contaminación del extracto proteico por clorofila puede llevar a una sobreestimación del contenido de ficobiliproteínas, es necesario evitar cualquier extracción de clorofila de las células.

Detectamos clorofila en el extracto crudo y, a continuación, utilizamos la sonicación para la disrupción celular. Con la repetición de los ciclos de sonicación, la concentración de clorofila aumentó. El tiempo de homogeneización se optimizó a 15 segundos.

La homogeneización durante cinco segundos y 20 segundos proporcionó rendimientos ligeramente inferiores. La adición de cloruro de sodio o potasio al tampón PBS o al agua, no aumentó la eficiencia de la extracción de ficobiliproteínas, al igual que la extracción en tampón de acetato de sodio. El tiempo de extracción de ficobiliproteínas se optimizó para 60 minutos, ya que después de 120 e incluso 240 minutos, la concentración de ficobiliproteínas no cambió significativamente.

Asegúrese de que la absorbancia a 615, 652 y 720 nanómetros se ajuste al rango de absorbancia cercana del espectrofotómetro. El espectrofotómetro utilizado en este protocolo muestra el rango de absorbancia cercana entre 0,1 y tres. Se compararon varias ecuaciones de cuantificación espectrofotométrica de ficobiliproteínas conocidas en la literatura.

La ecuación de Bennett y Bogorad proporcionó la mejor reconstrucción del contenido de ficocianina y aloficocianina en los patrones de pigmentos con concentraciones de proteínas conocidas. Las diferencias entre las ecuaciones individuales están relacionadas con las variaciones en los coeficientes de extinción de las ficobiliproteínas del organismo específico. El uso de sulfato de estreptomicina no condujo a la reducción de la clorofila A en las muestras en las que se aplicó o evitó la sonicación.

Como dato representativo, se determinó el contenido de ficobiliproteínas en células de Synechocystis. El contenido de ficobiliproteínas disminuyó con el aumento de la luz. El protocolo se estableció para minimizar los requisitos de tiempo y equipo para el análisis escrito de pigmentos que se puede realizar en cualquier laboratorio estándar de ciencias en vivo.

Además, el protocolo contiene otros dos pasos, como la liofilización del pellet celular y la extracción de proteínas. El tiempo total de trabajo para la cuantificación de los ficobilisomas no es superior a dos horas.