Name: Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende el perfilado de polisomas en corazones de ratón aislados mediante perfusión Langendorff. Este método permite analizar ARNm, miARN y proteínas para estudiar la síntesis proteica dinámica y las respuestas cardíacas al estrés.

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HL112730 NIH P01 (trapo, JVE), NIH R01 HL132075 (trapo, JVE), centro del corazón de la mujer de Barbra Streisand (trapo, JVE), Dorothy y Phillip Lyon E. Sillón en Cardiología Molecular (GAR), Erika Glazer dotado Cátedra salud del corazón de la mujer (JVE) y la Academia Checa de Ciencias Apoyo institucional RVO: 68081715 (MS).

<ol><li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750(2015).</li>
<li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303(2017).</li>
<li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li>
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<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li>
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<li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li>
<li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+%28palm%29+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li>
<li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Polysome perfil análisis permite el estudio de la traducción de proteínas mediante el análisis del estado traslacional de un mARN específico o el transcriptoma conjunto6,7. También es de gran ayuda cuando traducción local debe estudiarse como sinaptosomas8. Tradicionalmente, este método implica la separación de mono - y Polirribosomas y los mRNAs asociados a un gradiente de sacarosa que podría acoplarse con genómica o proteómica técnicas p...

El corazón responde a la lesión de isquemia (I) y (R) la reperfusión de manera dinámica. Sin embargo, hay poca penetración en cambios agudos en la síntesis de proteínas durante la respuesta. Para abordar esto, aprovechamos el método bien establecido de polysome perfiles1 para identificar los cambios en la abundancia de proteínas que reflejan la redistribución de los ribosomas y factores reguladores traslacionales de cytosol a polisomas, y la aumento de las proteínas recién sintetizadas (NSPs). En el marco de I / R, el aumento en la síntesis de proteínas nuevas se produce en un marco de tiempo que es inconsistente con la transcripción de mRNAs nuevo2; Además, la discordancia entre los niveles de expresión de mRNA y proteína abundancia ha sido reportado3. Por estas razones, hemos optado por analizar los cambios en el proteoma dinámico como se refleja por la traducción de proteínas. Para ello, cuantificar el mRNA en las fracciones polysome y analizar la composición de la proteína en las fracciones polysome. Por último, porque microRNAs (miRs) regulan la disponibilidad de los mRNAs para la traducción y puede interferir con la eficacia de la proteína traducción4,5, examinamos la distribución de miRs en las fracciones polysome, centrándose en la respuesta a me / r.
Optamos por utilizar el modelo de perfusión en ratones aislados Langendorff y tejido cosechada bajo condiciones basales de perfusión continua, después de isquemia caudal global de 30 minutos y después de 30 min de isquemia seguida de 30 minutos de la reperfusión. A continuación solubilizado el tejido del corazón y separa polisomas sobre un gradiente de sacarosa, seguido del análisis proteómico y detección selectiva de mRNAs y miRNAs mediante PCR y microarrays, respectivamente. Esta combinación de métodos representa un enfoque poderoso para entender el proteoma dinámico, que permite la detección simultánea de MARN, miRNA y NSPs, así como la redistribución de las proteínas reguladoras, miRNA y mRNA entre fracciones de nontranslating, baja eficiencia polisomas y polisomas de alta eficiencia (ver figura 1). Penetraciones en la regulación dinámica de este proceso se extenderá por más análisis de la fosforilación de factores reguladores claves eIF2α como mTOR. Continuación se describen estos pasos individuales en detalle.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>para eutansia</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>utilizado en la preparación de Langendorff</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>utilizado para colgar el corazón</td></tr><tr><td>Sistema Langendorff</td><td>Radnoti + hecho en casa</td><td>n/a</td><td>Un sistema de "cuatro corazones" que consta de vidrio soplado personalizado, tubos y baños de agua</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Tampón Krebs y gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Tampón Sigma</td><td>P5405</td><td>Krebs y tampón de lisis</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Tampón Krebs Tampón</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Tampón Krebs</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Búfer de Krebs</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Tampón Krebs</td></tr><tr><td>Polvo de sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Gradiente de sacarosa y tampón de lisis</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Gradiente de sacarosa y tampón de lisis</td></tr><tr><td>Xileno Cianol</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Gradiente de sacarosa</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Gradiente de sacarosa y tampón de lisis</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>Inhibidor de ARNasa para tampón de lisis</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Comprimidos de cóctel, sin EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo, Pared Delgada, Ultra-Transparente, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugación de los gradientes</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugación de los gradientes</td></tr><tr><td>Biologic LP (bomba)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fraccionamiento de los gradientes</td></tr><tr><td>BioFrac Biorad</td><td></td><td>741-0002</td><td>Fraccionamiento de los gradientes</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Eppendorf RNA/DNA LoBind, tubo de 2 mL</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Fracción de gradiente y extracción de ARN</td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol Tecnologías</td><td>de vida</td><td>AM9738</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>Luciferasa ARN de control</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>ARN extracción</td></tr><tr><td>Glucógeno de grado ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>Extracción de</td></tr><tr><td>ARN iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Transcripción inversa</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>PCR cuantitativa</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit para el aislamiento total de ARN</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit para transcripción inversa de miARN</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit para el análisis de la expresión de PCR en tiempo real de miRNAs</td></tr><tr><td>Centrífuga 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Para la centrifugación de tubos de 1,5 mL o 2,0 mL a diferentes temperaturas. Velocidad máxima - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Para la centrifugación de placas PCR en tiempo real a diferentes temperaturas. Velocidad máxima: 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Para transcripción inversa</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Para análisis de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Para el control de calidad del aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 pocillos de carcasa dura, de perfil bajo, pared delgada, con faldón, verde/transparente</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Para el análisis de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Película de sellado de placas de PCR, adhesivo, óptica</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Para el sellado de placas de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Research plus Pipeta monocanal, gris; 0.5-10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Para pipetear</td></tr><tr><td>Pipetas PIPETMAN Classic, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Para pipetear</td></tr><tr><td>Pipetas PIPETMAN Classic, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Para pipetear</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>para pipetear</td></tr><tr><td>Glucógeno, grado de ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Mejora la eficiencia del aislamiento total de ARN</td></tr><tr><td>Posi-Click 1,7 mL Tubos, color natural</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>Aislamiento y almacenamiento de ARN; mezcla de reactivos</td></tr><tr><td>Tubos de ciclo térmico -0,2 mL Tapas individuales, tubos estándar de 0,2 mL con óptica</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Reacción de transcripción inversa</td></tr><tr><td>Sharp 10 Puntas de barrera de precisión</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Para pipeteo</td></tr><tr><td>Sharp 20 Puntas de barrera de precisión</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Para pipeteo</td></tr><tr><td>Sharp 200 Puntas de barrera de precisión</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Para pipeteo</td></tr><tr><td>Puntas LTS 1 mL Filtro</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Para pipeteo</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay ( 200)</td><td>Qiagen</td><td>(cambia según el miRNA)Para el</td> <td>análisis de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>Para la preparación de gradientes de sacarosa</td></tr><tr><td>, ácido tricloroacético</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr>, <tr><td>acetona</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de Tris</td><td>, Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>yodoacetamida</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>grado de secuenciación tripsina modificada, porcino</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de amonio</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>metanol, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Tubos LoBind de proteína 0,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>tubos Protein LoBind de 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB y micro; Placa de elución 30 &micro; m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonicador</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Columna de trampa LC PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC columna de separación PepMap RSLC C18</td><td>Espectrómetro</td><td>de masas Thermo Scientific 164536</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite espectrómetro</td><td></td>de masas con trampa de iones</tr><tr><td>MSConvert software</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Sorcerer-SEQUEST</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

proteómicos y mirna análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de langendorff la perfusión

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Estudios en cambios dinámicos en la traducción de la proteína requieren métodos especializados. Aquí examinamos cambios en las proteínas recién sintetizadas en respuesta a la isquemia y reperfusión con el corazón de ratón perfundido aislado juntado con perfiles polysome. Para entender más los cambios dinámicos en la traducción de la proteína, caracteriza los mRNAs que fueron cargados con los ribosomas citosólicas (Polirribosomas o polisomas) mitocondriales polisomas se recuperó y en comparación con la distribución de mRNA y proteína en la fracciones de alta eficiencia (numerosos ribosomas ARNm), baja eficiencia (menos ribosomas) mitocondriales polisomas, y las fracciones no traducir. también puede asociar miRNAs mRNAs que se están traduciendo, reduciendo así la eficiencia de la traducción, examinamos la distribución de los miRNAs a través de las fracciones. La distribución de proteínas, mRNAs y miRNAs fue examinada bajo condiciones perfusión basals, al final de 30 minutos de isquemia global sin flujo y después de 30 minutos de la reperfusión. Aquí presentamos los métodos utilizados para llevar a cabo este análisis, en particular, el enfoque de optimización de la extracción de la proteína de la gradiente de sacarosa, ya que esto no se ha descrito antes y algunos resultados representativos.

Análisis del mRNA resultados de mRNA se pueden expresar como una distribución de un determinado mRNA en cada fracción (Figura 3A); para la cuantificación, combinar fracciones traducción polyribosomal y comparar a la fracción no traducir (figura 3B), presentando un cociente de abundancia del mRNA en la traducción de fracciones nontranslating. Información adicional es obtenida mediante el examen de las fracciones de alt...

Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la síntesis dinámica de proteínas y el proteoma involucrado en el proceso. Esta técnica permite la identificación de los ARNm que se seleccionan para la traducción, los microARN que pueden participar en el proceso e interferir con la traducción, y las proteínas que contribuyen a la traducción de proteínas o que se están traduciendo a su vez. Este método puede proporcionar información sobre las respuestas cardíacas al estrés, pero también se puede aplicar al estudio de las respuestas agudas al estrés en otros órganos.La demostración del procedimiento estará a cargo de Miroslava Stastna, científica del proyecto del laboratorio de Jennifer Van Eyk. El día del experimento, llene el compartimento izquierdo de un mezclador de gradiente con cinco mililitros de solución de gradiente de sacarosa al 15% y llene el compartimento derecho con cinco mililitros de solución de gradiente de sacarosa al 50%. Abra el grifo y encienda la bomba para agitar los dos compartimentos pequeños con un agitador magnético, y use un tubo conectado al segundo grifo para permitir que las soluciones de sacarosa mezcladas fluyan en un solo tubo de ultracentr

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Langendorff modo de perfusión cardiaca aislada, en conjunto...

Evaluación de la función cardiaca y Energética en los corazones de ratón aislado utilizando 31 P espectroscopía de RMN

Perfiles de expresión de células individuales permite el análisis detallado de la expresión génica de células individuales. Se describen los métodos para el aislamiento de los cardiomiocitos, y la preparación de los lisados ​​resultantes, ya sea para toda microarrays transcriptoma o qPCR de objetivos específicos.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Desarrollamos un método simple para aislar las células individuales de alta calidad del corazón del ratón por la técnica anterógrada de la perfusión. Este método está libre de Langendorff y es útil para aislar miocitos ventriculares y auriculares o células intersticiales, como fibroblastos cardíacos o progenitores.

Un Método De Perfusión Anterógrada Para El Aislamiento De Cardiomiocitos De Ratones

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Aquí, describimos un protocolo para aislar una cantidad suficiente de miomiocitos únicos no cardiomiocitos con alta viabilidad de un corazón de ratón post-infarto de miocardio (IM). Esto se puede utilizar para la secuenciación posterior de una sola célula, el análisis de citometría de flujo y el cultivo celular primario.

Preparación de una suspensión de células no cardiomiocitos para la secuenciación de ARN unicelular de un corazón de ratón adulto postinfarto de miocardio

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Aprende el perfilado de polisomas en corazones de ratón aislados mediante perfusión Langendorff. Este método permite analizar ARNm, miARN y proteínas para estudiar la síntesis proteica dinámica y las respuestas cardíacas al estrés.

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

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