Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la síntesis dinámica de proteínas y el proteoma involucrado en el proceso. Esta técnica permite la identificación de los ARNm que se seleccionan para la traducción, los microARN que pueden participar en el proceso e interferir con la traducción, y las proteínas que contribuyen a la traducción de proteínas o que se están traduciendo a su vez. Este método puede proporcionar información sobre las respuestas cardíacas al estrés, pero también se puede aplicar al estudio de las respuestas agudas al estrés en otros órganos.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Miroslava Stastna, científica del proyecto del laboratorio de Jennifer Van Eyk. El día del experimento, llene el compartimento izquierdo de un mezclador de gradiente con cinco mililitros de solución de gradiente de sacarosa al 15% y llene el compartimento derecho con cinco mililitros de solución de gradiente de sacarosa al 50%. Abra el grifo y encienda la bomba para agitar los dos compartimentos pequeños con un agitador magnético, y use un tubo conectado al segundo grifo para permitir que las soluciones de sacarosa mezcladas fluyan en un solo tubo de ultracentrífuga con paredes delgadas sobre hielo.

A continuación, homogeneizar el tejido cardíaco fresco o congelado con un POLYTRON en tampón de lisis filtrado durante 15 segundos en hielo. Al final de la incubación, centrifugar el lisado para eliminar el material insoluble y cosechar el sobrenadante. Reserve 50 microlitros del sobrenadante para la determinación de proteínas, el aislamiento del ARN y el análisis de la integridad del ARN, y coloque una capa de 100 a 500 microlitros del sobrenadante restante sobre la solución de gradiente.

Utilice un tampón de lisis nuevo para equilibrar los volúmenes entre los dos tubos de gradiente y ultracentrífugo las muestras en una ultracentrífuga con un rotor de cangilón oscilante. Tenga mucho cuidado de no alterar el gradiente de sacarosa antes o después de la centrifugación. Para recoger los gradientes, programe el colector de fracciones para que deseche los tres primeros minutos de recogida y para que recoja las fracciones pesadas, ligeras y no traducibles a la velocidad de un mililitro por minuto en 17 fracciones de cuatro a 19 minutos con control continuo de la absorbancia a 254 nanómetros.

Coloque cada fracción en hielo tan pronto como se recoja. A continuación, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados, si no se procesan inmediatamente. Para extraer proteínas de las fracciones de polisomas, combine las fracciones de sacarosa recolectadas en tres fracciones finales y marque las fracciones como pesadas, ligeras y no traducibles.

Mezcle 0,5 mililitros de cada muestra con 60 microlitros de ácido tricloroacético al 100% o TCA. Incuba las fracciones durante la noche a menos 20 grados centígrados en la oscuridad. A la mañana siguiente, descongele las muestras en hielo antes de peletizar las proteínas por centrifugación.

Deseche los sobrenadantes y lave los gránulos dos veces con 0,5 mililitros de acetona fría de menos 20 grados centígrados por centrifugación. Asegúrese de que el pellet, después de la precipitación de TCA, se disuelva por completo, utilizando la sonicación por pulsos para garantizar una solubilización completa, según sea necesario. Secar al aire los pellets después del último lavado antes de la resuspensión en 360 microlitros de tampón Tris-HCl.

Luego agregue 40 microlitros de ditiotreitol para una incubación de 45 minutos a 55 grados centígrados con agitación. Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de yodoacetamida a las muestras para una incubación de 30 minutos en el agitador a temperatura ambiente, protegida de la luz, seguida de la digestión de las muestras con una proporción de tripsina a proteína de uno a 50 peso para una incubación agitada durante la noche a 37 grados Celsius. A la mañana siguiente, después de enfriar, centrifugar brevemente las muestras y ajustar el pH a dos o tres con ácido fórmico al 10% para apagar la actividad de la tripsina.

Para desalinizar las muestras, primero se acondicionó el sorbente en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 200 microlitros de metanol tres veces, seguido de un acondicionamiento con 200 microlitros de ácido fórmico al 0,1% por pocillo tres veces. A continuación, cargue las muestras en cada pocillo y lave las muestras tres veces con 200 microlitros de ácido fórmico al 0,1% por lavado. Usando gravitación, seguida de bajo vacío, eluir las muestras con 100 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo al 50 % dos veces en un tubo de 0,5 mililitros de baja retención de proteínas por muestra.

A continuación, utilice un concentrador para evaporar los eluidos de la muestra hasta la sequedad y reconstituya cada pellet de péptido tríptico en 50 a 100 microlitros de ácido fórmico al 0,1% para el análisis de espectrometría de masas. El análisis de ARNm se puede realizar para evaluar la distribución de un ARNm particular de interés en cada fracción o para la cuantificación y comparación de las fracciones de traducción polirribosómicas combinadas con la fracción no traductora como una relación de la abundancia de ARNm en cada fracción. Por ejemplo, aquí, se muestran los cambios en la distribución del ARNm a través de las fracciones traducentes y no traducentes después de la sometimiento del corazón del ratón a isquemia o reperfusión de isquemia, en comparación con el tratamiento cardíaco simulado.

En este experimento representativo, el análisis de un subconjunto de microARN en las fracciones pesadas agrupadas reveló que 22 microARN se asociaron con polisomas durante la isquemia, nueve se asociaron durante la isquemia y la reperfusión, y siete fueron comunes a ambas condiciones, lo que demuestra que la asociación de microARN es dinámica en respuesta a las tensiones de la isquemia y la reperfusión. Además, la mayoría de las proteínas ribosómicas mitocondriales se identificaron en la fracción ligera, y la mayoría de las proteínas ribosómicas citosólicas se identificaron comúnmente tanto en la fracción pesada como en la ligera. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay que tener mucho cuidado con el gradiente de sacarosa.

La precipitación de TCA para la extracción de proteínas a partir de fracciones de polisomas se seleccionó en nuestro flujo de trabajo en función de la capacidad de procesar la fracción con alta concentración de sacarosa y el número de proteínas identificadas por espectrometría de masas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a los desafíos asociados con la reproducibilidad del gradiente de sacarosa. La precipitación de TCA es ventajosa ya que solo se necesitan pequeños volúmenes para precipitar las proteínas, la pellet es visible en el fondo del tubo y no hay acumulación de sacarosa durante la precipitación.