Name: Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a expresar proteínas fluorescentes de fusión en células dendríticas y macrófagos de médula ósea murina mediante transducción retroviral. Este protocolo eficiente permite visualizar la localización subcelular de proteínas en células inmunitarias.

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Este trabajo fue apoyado por Checa ciencia Fundación (GACR) (proyecto número 16-07425S), por Charles University Grant agencia (poesías) (número de proyecto 923116) y por fondos institucionales desde el Instituto de Genética Molecular de la Academia de Ciencias de la República Checa República (RVO 68378050).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de expertos sobre bienestar de animales de experimentación del Instituto de Genética Molecular y por la Academia de Ciencias de la República Checa.
1. preparación del reactivo
<ol><li>Preparar el tampón amonio cloruro de potasio (ACK). Añadir 4,145 g de NH4Cl y 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de ddH2O, añada 100 μl de 0.5m ácido etilendiaminotetracético (EDTA) y esterilizar filtro.</li>
	<li>Preparar solución de polietilenimina (PEI). Añadir 0.1 g de PEI a 90 mL de ddH2O. Mientras que revuelve, agregue 1 M HCl gota a gota hasta que el pH es inferior a 2.0. Remover durante 3 h hasta que se disuelva el PEI y luego ajustar el pH a 7.2 con 1 M NaOH. Ajustar el volumen a 100 mL con ddH2O y esterilizar por el filtro. Hacer alícuotas de 1 a 2 mL y almacenar a-20 ° C. Nota: Después de descongelar, PEI puede almacenarse a 4 ° C hasta por 2 semanas pero no debe volver a congelarse.</li>
	<li>Preparación de sobrenadantes de cultivo celular que contiene M-CSF o GM-CSF. Estos sobrenadantes pueden ser adelantados y almacenados a-80 ° C. Para hacer estos sobrenadantes, crecen las células productoras de citoquinas (células J558 para GM-CSF 18 ) o CMG 14-12 para el M-CSF 19en una placa de Petri en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) de 10 cm a confluencia. Luego se transfieren todas las células a 200 mL de medio en frasco de cultivo de tejidos T150 y cultura durante 4 días adicionales en el 5% CO237 ° C. Recoger el sobrenadante y el filtro sobre 0,2 μm filtro de esterilización. Hacer alícuotas y almacenar a-80 ° C.</li>
	<li>Preparar 100 mL de medio de cultivo celular: DMEM suplementado con 10% SFB inactivado de calor y sobrenadantes de cultivo de células secretoras de GM-CSF (por diferenciación de BMDC) o el M-CSF (para la diferenciación de BMDM) de la célula. Nota: Puede variar la cantidad de citoquinas en los sobrenadantes y la concentración del trabajo debe determinarse empíricamente. Normalmente, se utiliza el sobrenadante 2 – 3% de líneas celulares de producción de GM-CSF (la concentración inicial recomendada es de 2%) o 5-10% de sobrenadante de CMG 14 – 12 células productoras M-CSF (la recomendada concentración inicial es 10%). Por otra parte, purificada comercialmente disponible M-CSF 10 ng/ml y GM-CSF a 20 ng/mL pueden utilizarse con resultados prácticamente idénticos a los sobrenadantes del cytokine-que contienen, es decir., sin ningún efecto sobre la tasa de diferenciación, la eficiencia de la infección y localización subcelular de construcciones EGFP-marcados con etiqueta. Antibióticos, incluyendo penicilina G (100 UI/mL) y estreptomicina (100 μg/mL), gentamicina (40 μg/mL), pueden utilizarse para el cultivo celular en cualquier paso del Protocolo a menos que se indique lo contrario.</li>
</ol>2. producción de Retrovirus
PRECAUCIÓN: Aunque los vectores retrovirales son relativamente seguros comparado con otros tipos de vectores virales, ellos todavía plantean un peligro de seguridad potencial. Por lo tanto, es fundamental trabajar con el máximo cuidado y equipo de protección adecuado y cumplir con todas las normativas y requisitos legales para trabajar con partículas virales.
<ol><li>Una suspensión unicelular de células de platino-Eco (Plat-E) envasado en una caja de Petri de 10 cm de la placa y cultivar en 15 mL de DMEM con 10% FBS hasta 50-60% confluente (24 h). Las células deben crecer en una monocapa y no deben formar grumos en la cultura.</li>
	<li>Pipeta 20 μg de construcción retroviral (e.g., la construcción, expresando la proteína fluorescente etiquetada de interés en el vector de pMSCV) y 10 μg de pCL-Eco packaging vector20 en 1 mL de DMEM (sin suero y antibióticos) y mezclar suavemente.</li>
	<li>A un segundo tubo, agregar 75 μl de PEI en 1 mL de DMEM (sin suero y antibióticos). Incubar 5 min a temperatura ambiente (RT) y luego mezclar el contenido de ambos tubos e incubar adicional 10 min a TA. Nota: Además de pCL-Eco es opcional. Codificación para el receptor viral ecotropic y puede aumentar la concentración de virus.</li>
	<li>Vuelva a colocar cuidadosamente el medio en las células de Plat-E con 8 mL de DMEMsupplemented fresco con 2% FBS. Pre-calentar el medio a 37 ° C antes de usar. No utilice antibióticos durante la transfección, puesto que los antibióticos pueden reducir la eficacia de transfección.</li>
	<li>Cuidadosamente Añadir (en gotas) la mezcla preparada en el paso 2.3 sobre las células de Plat-E e incubar durante 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Después de la incubación, cambio medio en las células de Plat-E para 10 mL de DMEM precalentado que contiene 10% FBS y cultivar las células durante 24 h a 37 ° C. Durante la incubación, las células de Plat-E producirán virus en los medios de comunicación.</li>
	<li>Después de 24 h, recoger el medio que contiene partículas retrovirales de platino Eco las células usando una pipeta de 5 mL y transferir a un tubo de centrífuga de 15 mL (= "sobrenadante 1" que contiene las partículas retrovirales ecotropic).</li>
	<li>Para evitar la contaminación por células Plat-E en sobrenadante viral, girar el virus recogido en 1250 × g por 5 min a 4 ° C. Para mejores resultados, el virus debe utilizarse inmediatamente para la infección. Nota: Alícuotas de virus también pueden almacenarse a-80 ° C para su uso posterior. Sin embargo, dará lugar a cierta reducción en la eficiencia de la transducción de señales. Evitar la congelación/descongelación repetido del virus, puesto que conduce a la degradación del virus.</li>
	<li>Añadir 10 mL de DMEM con 10% FBS Plat-e células y cultivar por otro 24 h a 37 ° C.</li>
	<li>Repita los pasos del 2.7. y 2.8. para obtener "sobrenadante 2".</li>
</ol>3. aislamiento de células de médula ósea murino
<ol><li>Sacrificar el ratón mediante dislocación cervical u otros métodos aprobados. Rocíe el ratón con etanol al 70%.</li>
	<li>Utilizando pinzas y tijeras, quite la piel así como parte de los músculos de las patas traseras. Con cuidado sacar el acetábulo de la articulación de la cadera sin romper el fémur. Corte la pata en la articulación del tobillo. Rociar los huesos (fémur conectado a tibia) con etanol al 70% y eliminar el resto de los músculos usando una toalla de papel.</li>
	<li>Colocar los huesos en un plato de Petri de 5 cm que contiene tamponada de fosfato estéril salino (PBS) con 2% FBS (PBS-FBS).  Si preparando más huesos, mantener la caja Petri sobre hielo hasta procesado.</li>
	<li>Para asegurar la esterilidad del cultivo, realizar los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Separar el fémur la tibia sin romper los extremos del hueso (curva en la rodilla conjunta y cuidadosamente cortada con las tijeras).</li>
	<li>Proceso los huesos uno por uno. Corte una parte muy pequeña de las epífisis (aproximadamente 1-2 mm) con unas tijeras mientras mantiene el hueso en pinzas.</li>
	<li>Utilizar una aguja de 30 G y un 2 o jeringa de 5 mL con PBS-FBS para eliminar las células de la médula ósea de ambos extremos del hueso en un tubo de centrífuga de 15 mL. Mover la aguja dentro del hueso durante el lavado para eliminar todas las células. Si la aguja se atasca, cambiarlo. Nota: Deben girar los huesos de rojo a blanco durante el lavado. Esto indica que la mayoría de las células fueron quitada del hueso. Utilice aproximadamente 2 – 3 mL de PBS-FBS por hueso.</li>
	<li>Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por Resuspender el pellet en 2,5 mL de tampón ACK para 2 a 3 minutos a temperatura ambiente. Durante la lisis, filtrar las células de la médula ósea a través de un tamiz celular de 100 μm en un nuevo tubo 15 mL centrifug. Restaurar la tonicidad añadir 12 mL de PBS-FBS. Nota: No exceda 5 min de lisis hipotónica con tampón de ACK para evitar la muerte celular.</li>
	<li>Centrifugar inmediatamente a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
</ol>4. médula diferenciación celular en la médula ósea derivados de macrófagos
<ol><li>Resuspender el precipitado de células de médula ósea en DMEM suplementado con 10% FBS y antibióticos (ver la nota después del paso 1.4. para la concentración del antibiótico) y contar las células. Para la diferenciación en BM derivados macrófagos, placa 5-10 x 106 células de médula ósea en una 10 cm no-cultivo de tejidos tratados (bacteriana) placa de Petri con 10 mL de preparados medios DMEM con suero y M-CSF de paso 1.4. Nota: El rendimiento de las células de la médula ósea es de aproximadamente 4 x 107 por 6 – 8 semanas-viejo ratón C57BL/6J.</li>
	<li>Incubar las células en la incubadora de la célula cultura días 3 a 5% CO2, 37 ° C. Nota: Durante los primeros 2 días, las células no se ven muy vitales, como un gran número de células apoptóticas es presente (células capaces de diferenciarse en células mieloides y las células terminalmente diferenciadas).</li>
	<li>Después de 3 días, el cultivo de células de la médula ósea empieza a ver vital y se forman grupos de división de las células. Ya se observan las primeras células adherentes. Suplemento en este punto, las células con medios frescos del cytokine.</li>
	<li>Añadir 10 mL de precalentado medio DMEM con suero y M-CSF (de paso 1.4) en cada placa de Petri de 10 cm y vuelva a colocarla en la incubadora de la cultura de célula. No hay ninguna necesidad de quitar los viejos medios de comunicación durante este paso. Nota: los macrófagos de la médula ósea se diferencian completamente después de 5 – 7 días en la cultura. El mejor momento para la cosecha es en el día 6-8, donde la mayoría de las células son adherentes y la placa de Petri se cubre totalmente.</li>
	<li>En el día 5, tomar la caja Petri en la campana de la cultura de célula y incline el plato hasta que los medios de comunicación casi está alcanzando el borde del plato. Cuidadosamente saque 15 mL del medio de la superficie cerca del borde, y las células tienden a permanecer en el centro del plato. Añadir el mismo volumen de medios precalentados con el M-CSF y coloque el plato en la incubadora. Nota: Si los medios de comunicación se aspiración lentamente y con cuidado, casi ninguna célula se pierden. Sin embargo, también es posible para los medios aspirados de centrífuga y añadir las células a la cultura, para no asegurarse de que no adherente (es decir., incompletamente diferenciado) las células se pierden.</li>
	<li>Para los experimentos, se utilizan solamente las células adherentes (macrófagos). Para cosechar las células, el día 6 o 7, quite todos los medios y las células flotantes. Lavar el plato una vez con PBS precalentada sin suero.</li>
	<li>Añadir 5 mL de EDTA 0,02% en PBS e incubar durante 3 – 5 min a 37 ° C en incubadora de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Con una pipeta de 5 mL, saque el plato por una corriente de PBS-EDTA a las células y colocarlos en un tubo de centrífuga de 50 mL con 25 mL de PBS. Si es necesario, la piscina más platos juntos.</li>
	<li>Centrifugar inmediatamente a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de macrófagos en medio DMEM y contar las células. Verificar la expresión de marcadores de diferenciación superficial del macrófago (CD11b y F4/80) por citometría de flujo.</li>
	<li>Para los experimentos que requieren las células en suspensión, por ej., flujo cytometry experimentos, qPCR o análisis de western blot, los macrófagos se pueden utilizar directamente. Para experimentos con macrófagos adherentes, las células en la placa de cultivo de tejidos según la configuración experimental de la placa.</li>
	<li>Distinguen a las células ya completamente. Mantenerlos en los medios de comunicación adecuados para el experimento previsto o en el medio original de crecimiento y la diferenciación con el M-CSF. Nota: Para trabajar con los macrófagos adherentes, transferirlos en una nueva placa de al menos 6 h antes de utilizar (idealmente durante la noche) para permitir la adhesión completa a la nueva superficie. La pequeña fracción de células de flotación puede eliminarse antes de experimento.</li>
</ol>5. médula diferenciación celular en la médula ósea derivados de células dendríticas
<ol><li>Seguir el protocolo de BMDMs con ajustes específicos para BMDCs se describe a continuación en pasos 5.2-5.4.</li>
	<li>Resuspender el precipitado obtenido de células de médula ósea en DMEMsupplemented con 10% FBS y antibióticos y cuente las células (por siguiente paso 4.1 del Protocolo de macrófagos). Para la diferenciación en células dendríticas, placa 1 – 1,5 x 107 células de médula ósea en un 10 cm no-cultivo de tejidos tratados de Petri (bacteriana) en 10 mL de preparados medios DMEM con suero y GM-CSF (de paso 1.4.).</li>
	<li>Siga los mismos pasos de cultivo como en protocolo BMDM (pasos de 4.3 – 4.5. Protocolo de macrófagos). Utilizar medios DMEM con suero y GM-CSF en lugar de M-CSF. Puesto que para BMDCs el tiempo de cultivo es más largo (típicamente 10-12 días), agregar 1 – 2 alimentaciones adicionales en intervalos de 3 días (retirar el sobrenadante y agregar un nuevo medio de cultivo como se describe en el paso 4.5).</li>
	<li>Esta parte del protocolo es prácticamente igual a la parte correspondiente del protocolo macrófago (pasos 4.6 – 4.12. Protocolo de macrófagos). Experimentos Utilice solamente las células adherentes. Día 10-12, recoger las células utilizando EDTA, contar y placa sobre una superficie nueva. Verificar la expresión de marcadores de diferenciación superficial de las células dendríticas (CD11c +, CD11b + F4/80-) por citometría de flujo.</li>
</ol>6. producción de BMDMs y BMDCs expresan la proteína EGFP-marcados con etiqueta de interés
<ol><li>Resuspender el precipitado de células de médula ósea obtenidos en paso 3.10. en DMEM suplementado con 10% FBS y antibióticos y contar las células. Para la infección, use de 2 a 5 x 106 células BM por pozo de una cultura de tejido bien 6 lámina tratada.</li>
	<li>Placa las células en 1 mL del medio DMEM preparado por, complementadas con el M-CSF para la diferenciación en BMDMs o con GM-CSF para la diferenciación en BMDCs. mantener las células de 4 – 6 h en una incubadora de cultivo de tejidos con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 2 mL de virus recién recogidas ("sobrenadante 1) complementado con polibreno (12 μg/mL, concentración final 8 μg/mL después de la adición a las células). Nota: Alícuota congelada del sobrenadante que contiene el virus puede también utilizarse, pero la eficacia será menor.</li>
	<li>Centrifugar la placa a 1.250 x g durante 90 minutos a 30 ° C (con lenta aceleración y desaceleración). A continuación, incubar durante 4 h con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Opcional: Vuelva a colocar 2 mL de los medios de cultivo con citoquinas respectivas con medio fresco (M-CSF o GM-CSF) y de la cultura con 5% CO2 a 37 ° C. En el segundo día, retirar 2 mL del medio de cultivo y repetir el procedimiento toda infección (paso 6.3-6.4) con 2 mL de virus recién recogidas ("sobrenadante 2"). Nota: Este paso puede aumentar la eficacia de la infección. Mejora después de la segunda infección es dependiente en el tipo y objetivo de la proteína de la célula y en nuestra experiencia puede variar de 30% de aumento en eficiencia a ninguna mejora en absoluto.</li>
	<li>Recoger las células no adherentes, transferir a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos (4 ° C). Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo M-CSF o GM-CSF, colocar las células en un plato de Petri de 10 cm cultura del tejido tratado y la cultura a 37 ° C, 5% CO2. Número óptimo de células para un plato de 10 cm es de 5 – 10 x 106 por macrófagos derivados de BM y 10 – 15 x 106 células dendríticas BM. Nota: Pequeños platos o placas se pueden utilizar, pero un número de células debe modificarse en consecuencia.</li>
	<li>Siga el macrófago y Protocolo de cultivo y diferenciación de células dendríticas describe en el paso 4 y 5.</li>
</ol>

<ol><li>Moghaddam, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2018).</li>
<li>Qian, C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+the+regulation+of+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation.</a> Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).</li>
<li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function%3A+from+mechanisms+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+and+myeloid+lineage+commitment+in+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors.</a> Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).</li>
<li>Andrews, T., Sullivan, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+in+patients+with+inherited+defects+in+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Infections in patients with inherited defects in phagocytic function.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Scheicher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+GM-CSF+induces+in+vitro+differentiation+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+colony-stimulating+factor%2C+CSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+non-equivalence+of+murine+%28monocyte-%29+macrophage+cells+in+biomaterial+and+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).</li>
<li>Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+In+Vivo+Imaging+Using+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).</li>
<li>Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of fluorescent proteins.</a> Methods. 57 (3), 318-330 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+exogenous+genes+in+macrophages%3A+obstacles+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).</li>
<li>Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+tolerance+induction+in+major+histocompatibility+complex+class+II-restricted+T+cells+specific+for+a+blood-borne+self-antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).</li>
<li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+the+New+Osteoclast+Progenitor+with+Macrophage+Phenotypes+Being+Able+to+Differentiate+into+Mature+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Janssen, E., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptor+proteins+in+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adaptor proteins in lymphocyte activation.</a> Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).</li>
<li>Ferguson, P. J., Laxer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+discoveries+in+CRMO%3A+IL-1beta%2C+the+neutrophil%2C+and+the+microbiome+implicated+in+disease+pathogenesis+in+Pstpip2-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).</li>
<li>Holleman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+outcome+predictor+in+acute+leukemia+1+%28OPAL1%29+gene+is+not+an+independent+prognostic+factor+in+patients+treated+according+to+COALL+or+St+Jude+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols.</a> Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).</li>
<li>Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+Differentiation+of+Murine+Myeloid+Precursor+32D%2FG-CSF-R+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).</li>
<li>Kralova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transmembrane+Adaptor+Protein+SCIMP+Facilitates+Sustained+Dectin-1+Signaling+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).</li>
<li>Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+efficient+transfection+of+dendritic+cells+without+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).</li>
<li>Siegert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+siRNA+into+mouse+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+gene+delivery+technology+based+on+chemical+methods+and+nano-carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers.</a> Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li>
<li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).</li>
<li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+adenovirus+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A mouse model for adenovirus gene delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>McTaggart, S., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vectors+for+human+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Retroviral vectors for human gene delivery.</a> Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).</li>
<li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transience+of+transient+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La expresión de la proteína de interés en las células Diana es un paso clave en muchos tipos de estudios biológicos. Diferenciados de los macrófagos y las células dendríticas son difíciles de transfectar, transfección estándar y técnicas de transducción retroviral. Pasando por alto la transfección de las células diferenciadas con transducción retroviral de progenitores de médula ósea, seguido por la diferenciación cuando ya llevan la construcción deseada, es un paso crítico que permite la expresión de los cDNAs ectópico ...

Las células mieloides representan una parte imprescindible de nuestros mecanismos de defensa contra patógenos. Son capaces de rápidamente eliminar microbios, así como las células moribundas. Además, también están involucrados en la regulación de la reparación y desarrollo de tejido y en el mantenimiento de la homeostasis1,2,3. Todas las células mieloides se diferencian de la común progenitores mieloides de la médula ósea. Su diferenciación en muchos subconjuntos funcionalmente y morfológicamente distintos es en gran parte controlada por citoquinas y sus diversas combinaciones4. Los subconjuntos de células mieloides más intensamente estudiadas son granulocitos, macrófagos y células dendríticas. Defectos en cualquiera de estas poblaciones llevan a consecuencias potencialmente peligrosas para la vida y causa graves disfunciones del sistema inmunitario en humanos y ratones1,2,3,5, 6.
A diferencia de los granulocitos, macrófagos y células dendríticas son células residentes del tejido y su abundancia en los órganos inmunes es relativamente baja. Como resultado, el aislamiento y purificación de primarias células dendríticas y macrófagos para experimentos que requieren un gran número de estas células es costoso y a menudo imposible. Para resolver este problema, se han desarrollado protocolos para obtener grandes cantidades de homogéneos macrófagos o células dendríticas in vitro. Estos enfoques se basan en la diferenciación de células de médula ósea murina en presencia de citoquinas: factor de estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) de macrófagos y el factor colonia-estimulante del granulocyte-macrófago (GM-CSF) o el ligando Flt3 para 8,7,9,10,de las células dendríticas de11,12. Células generadas por este método comúnmente se describen en la literatura como la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs) y la médula ósea derivados de células dendríticas (BMDCs). Tienen propiedades fisiológicas más en común con primarios macrófagos o células dendríticas que con líneas celulares correspondientes. Otra gran ventaja es la posibilidad de obtener estos forman células genéticamente modificados ratones13. Estudios comparativos entre las células de tipo salvaje y las células derivadas de ratones genéticamente modificados son a menudo críticas para descubrir nuevas funciones de genes o proteínas de interés.
Análisis de la localización subcelular de las proteínas en las células vivas requiere el acoplamiento de una etiqueta fluorescente de la proteína de interés en vivo. Esto comúnmente se logra expresando construcción genéticamente codificados fusión compuesta por una proteína analizada juntada (a menudo vía un enlazador corto) a una proteína fluorescente (por ej., proteína fluorescente (GFP) de verde)14,15 , 16. la expresión de fluorescencia etiquetas proteínas en las células dendríticas o macrófagos es un reto. Estas células son generalmente difíciles de transfectar por procedimientos estándar de la transfección y la eficiencia tiende a ser muy baja. Por otra parte, la transfección es transitoria, genera estrés celular y alcanzado intensidad de la fluorescencia puede no ser suficiente para microscopia17. Para obtener una fracción razonable de estas células con un suficiente nivel de expresión de transgenes, la infección de células progenitoras de médula ósea con retroviral vectores y su posterior diferenciación en BMDMs o BMDCs se ha convertido en un muy eficiente enfoque. Ha permitido el análisis de las proteínas de origen mieloide en su entorno celular nativo, en un estado estacionario o en procesos que son críticos para la respuesta inmune tales como fagocitosis, formación de la sinapsis inmunológica o migración. Aquí, describimos un protocolo que permite la expresión estable de fluorescencia etiquetas proteínas de interés en murinos la médula ósea derivado de macrófagos y células dendríticas.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>10270</td><td>Para la suplementación</td></tr><tr><td>de medios KHCO3</td><td>Lachema, Brno, República Checa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>BB Pharma AS, Praga, República Checa</td><td>N/A</td><td>PENICILINA G 1,0 DRASELN&Aacute; SOL' BIOTIKA</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td> <td>S9137</td><td>Polvo de sal de sulfato de estreptomicina</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&aacute; lov&eacute;, República Checa</td><td>N/A Polietilemina</td><td></td></tr><tr><td>, lineal, MW 25,000</td><td>Polyscience, Warrington, PA, EE. UU</td><td>. 23966</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.)</td> <td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Preparado internamente por el centro de prensa de IMG ASCR, Praga, República Checa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD11b anti-ratón/humano de APC, clon M1/70</td><td>BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.</td><td>)101212</td><td>análisis de citometría</td></tr> de <tr><td>flujo PE anti-ratón F4/80 Anticuerpo, clon BM8</td><td>BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.)</td><td>123110</td><td>análisis de citometría</td></tr> de <tr><td>flujo APC anticuerpo CD11c de ratón APC, clon N418</td><td>BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.)</td><td>117310</td><td>análisis de citometría de flujo</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, EE. UU.)</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, EE. UU.</td><td>)315-03</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>H1398</td><td>uso de análisis de citometría de flujo en 1-2 y micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Macrófagos y células dendríticas son células cruciales que forman la primera línea de defensa contra patógenos. También juegan papeles importantes en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa. Trabajo experimental con estas células es más bien un desafío. Su abundancia en órganos y tejidos es relativamente baja. Como resultado, no puede ser aislados en grandes cantidades. También son difíciles de transfectar con construcciones de cDNA. En el modelo murino, estos problemas pueden superarse parcialmente por en vitro la diferenciación de progenitores de médula ósea en presencia de M-CSF para macrófagos GM-CSF de las células dendríticas. De esta manera, es posible obtener grandes cantidades de estas células de muy pocos animales. Por otra parte, progenitores de médula ósea pueden ser transduced con vectores retrovirales que construcciones de cDNA durante etapas tempranas del cultivo antes de su diferenciación en la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos. Por lo tanto, transducción retroviral seguida de diferenciación en vitro puede utilizarse para expresar diversas construcciones de cDNA en estas células. La habilidad de expresar proteínas ectópicas substancialmente amplía la gama de experimentos que se pueden realizar en estas células, incluyendo células vivas imágenes de proteínas fluorescentes, purificaciones de tándem para interactoma análisis, análisis de la estructura y función, seguimiento de las funciones celulares con biosensores y muchos otros. En este artículo, describimos un protocolo detallado para la transducción retroviral de murino la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos con vectores que codifica para las proteínas con etiqueta fluorescente. En el ejemplo de dos proteínas, OPAL1 y PSTPIP2, demostramos su aplicación práctica en microscopia y citometría de flujo. También discutimos las ventajas y limitaciones de este enfoque.

Proteínas señales son proteínas generalmente pequeñas sin ninguna actividad enzimática. Poseen varios dominios de interacción o motivos, que median la Unión a otras proteínas involucradas en transducción de señales, incluyendo tirosina quinasas, fosfatasas, ligasas de ubiquitina y otros21. Para la demostración de la funcionalidad de este protocolo se seleccionaron adaptadores de células mieloides PSTPIP2 y OPAL1. PSTPIP2 es una proteína bien caracterizada en la reg...

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de los macrófagos y las células dendríticas sobre la localización subcelular y la dinámica de varias proteínas en estos tipos celulares. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente simple, económica y demuestra una mejor eficiencia y estabilidad de expresión que la mayoría de los otros métodos disponibles. Demostrando el procedimiento estará Jarmila Kralova, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.Para producir el retrovirus, vajilla una suspensión monocelular de células de Platinum Eco-packaging en un plato petri de 10 centímetros y cultive las células en 15 mililitros de DMEM, complementado con un 10% de suero bovino fetal, o FBS, hasta que el cultivo sea de 50 a 60% confluente. Al día siguiente, añadir 20 microgramos de la construcción retroviral de interés y 10 microgramos de vector de eco-envasado PCL a 1 mililitro de DMEM sin suero, con mezcla suave. Añadir 75 microlitros de PEI en 1 mililitro de DMEM sin suero y antibióticos a un segundo tubo para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, y mezclar el contenido de ambos tubos para una incubación adicional de 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, reemplace cuidadosamente el medio en las células Platinum Eco con 8 mililitros de DMEM fresco de 37 grados Celsius complementados con 2%FBS y agregue cuidadosamente la mezcla de transfección en gotas a la placa. Después de una incubación de 4 horas a 37 grados centígrados, reemplace el sobrenadante con 10 mililitros de DMEM de 37 grados Celsius, complementado con 10%FBS para una incubación de 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice una pipeta de 5 mililitros para transferir el sobrenadante retroviral retroviral que contiene partículas ecotrópica a un tubo centrífugo de 15 mililitros y eliminar los desechos y las células que contienen por centrifugación.Mientras tanto, añadir 10 mililitros de 37 grados Celsius DMEM más 10%FBS al plato de cultivo para otra incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y recoger una segunda ronda de partículas virales como acaba de demostrar. Para cosechar la médula ósea, en una capucha de cultivo de tejido, utilice pinzas y tijeras para eliminar la piel y parte de los músculos de las extremidades posteriores y desalojar cuidadosamente el acetábulo de la articulación de la cadera sin romper el fémur. Cortar las patas en las articulaciones del tobillo y rociar los huesos con 70%etanol.Luego retire el resto del músculo con una toalla de papel y coloque los huesos en un plato petri de 5 centímetros de PBS complementado con 2%FBS. A continuación, dobla la articulación de la rodilla de cada conjunto óseo y separa cuidadosamente los huesos con tijeras. Utilice las tijeras para extraer de uno a dos milímetros de cada epifísis de un hueso y utilice una jeringa de dos o cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 30 cargada con PBS fresco más FBS para vaciar la médula ósea de ambos extremos del hueso en un tubo centrífugo de 15 mililitros.Cuando la médula se ha recogido de cada uno de los huesos, pele el gestion de las células óseas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos durante dos a tres minutos a temperatura ambiente. Después de la lesión, filtre las células a través de un colador celular de 100 micrómetros en un nuevo tubo centrífuga de 15 mililitros y restaure la tenacidad con 12 mililitros de PBS más FBS. Re-suspender el pellet en DMEM, complementado con 10%FBS y antibióticos para el conteo y placa de cinco a 10 veces 10 a la sexta célula de médula ósea en un 10 centímetros, cultivo no tejido tratado petri en 10 mililitros de DMEM complementado con suero y factor estimulante de colonia de macrófagos, o MCSF.En el quinto día de cultivo, incline cuidadosamente el plato de cultivo celular y retire todos los mililitros de medio, excepto aproximadamente, de la superficie cerca del borde del plato. Luego agregue 20 mililitros de medio fresco de 37 grados Celsius complementados con FBS y MCSF al plato y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Para cosechar las células, en el día seis a siete, retire todas las células medianas y flotantes y lave el cultivo con 37 grados Celsius PBS.Separe las células adherentes con cinco mililitros de 0.02%EDTA y PBS durante tres a cinco minutos a 37 grados Celsius en la incubadora de cultivo de tejido y use una pipeta de cinco mililitros para lavar suavemente las células disociadas del fondo de la placa. Luego transfiera las células a un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de PBS fresco. Para inducir la expresión de proteínas etiquetadas por EGFP en células que presentan antígenos derivados de la médula ósea, al principio del protocolo de diferenciación celular, diluir las células de la médula ósea a una de dos a cinco veces 10 a las sextas células por mililitros de DMEM más FBS y la coninación de antibióticos y placar las células de un mililitro de medio por pozo, complementadas con la citoquina de diferenciación adecuada.Después de cuatro a seis horas en la incubadora de cultivo celular, añadir dos mililitros de la primera ronda de virus recogidos complementados con polibreno y transducir los cultivos celulares por centrifugación y una incubación de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular. Al final del período de transducción, transfiera las células no adherentes de cada pozo a tubos centrífugos individuales de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Si se necesita una mayor cantidad de células, las células pueden ser infectadas con el mismo constituido en múltiples pozos y agrupados antes de la diferenciación.Luego re-suspende los pellets en 10 mililitros de medio de cultivo complementados con la citoquina de diferenciación apropiada y placar las células en un 10 centímetros no tejido cultivo tratado petri plato por tubo, para su cultivo de seis a ocho días, como acaba de demostrar. La evaluación de la eficacia de la transfección Platinum Eco por citometría de flujo después de la recogida del segundo virus que contiene sobrenadato revela una eficiencia media de transfección del 62% para PSTPIP2-EGFP y del 53% para OPAL1-EGFP. La transducción retroviral no afecta al estado de diferenciación de las células derivadas de la médula ósea con más del 90% de las células en ambos cultivos que demuestran positividad para sus respectivos marcadores después de la transducción con cualquiera de los dos virus.Y con los cambios morfológicos apropiados y característicos observados para ambos tipos de células diferenciadas. Cabe destacar que la expresión general de EGFP fue menor en los cultivos celulares dendríticos derivados de la médula ósea en comparación con la expresión de EGFP de macrófagos derivados de la médula ósea, independientemente del tipo de retrovirus. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de platos plásticos no tejidos, tratados con cultivos que se utilizan normalmente para el cultivo de bacterias si planea eliminar las células del plato para el experimento.Después de este procedimiento, se pueden emplear otros métodos de imágenes de células vivas, microscopía de superrescía u otros tipos de microscopía para responder preguntas adicionales sobre la localización subcelular y la dinámica de las proteínas de celda dendrítica y macrófagos de interés. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la distribución y las relaciones espaciales de las proteínas expresadas por macrófagos y células dendríticas y en promover nuestra comprensión de la función de estas proteínas durante las respuestas inmunitarias. No olvide que trabajar con partículas virales puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones, como la minimización de la generación de aerosoles, el uso de equipos de protección y el uso de una capucha de flujo laminar, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Dendríticas las células de captación de antígenos y migran hacia los órganos inmunes para presentar antígenos procesados ​​a los linfocitos T. Qdot nanocristales etiquetado proporciona una señal fluorescente de larga duración y estables. Esto permite el seguimiento de las células dendríticas a los diferentes órganos por microscopía de fluorescencia.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Se presenta un protocolo mediante el uso de células activadas por fluorescencia para aislar las células dendríticas plasmacitoides (PDC) con alta pureza a partir de la médula ósea de ratones propensos al lupus para los estudios funcionales de PDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.

Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Este protocolo describe el aislamiento de timocitos doble negativos del timo de ratón seguido de transducción retroviral y cocultivo en el sistema de cocultivo de líneas celulares del estroma del estroma de médula ósea que expresa 4 en forma delta (OP9-DL4) para un análisis funcional adicional.

Cocultivo y transducción de timocitos murinos en células estromales que expresan 4 similares a Delta para estudiar oncogenes en leucemia de células T

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Aprende a expresar proteínas fluorescentes de fusión en células dendríticas y macrófagos de médula ósea murina mediante transducción retroviral. Este protocolo eficiente permite visualizar la localización subcelular de proteínas en células inmunitarias.

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

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