Name: Con 22 3 anticuerpos Anti-PD-L1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a evaluar la expresión de PD-L1 en cáncer de pulmón no microcítico usando el concentrado de anticuerpo 22C3 en biopsias y muestras citológicas. Este método inmunohistoquímico ofrece alta concordancia con el estándar de oro para seleccionar pacientes candidatos a inmunoterapia de manera fiable.

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Este estudio fue patrocinado por Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Los patrocinadores no desempeñó ningún papel en el diseño del estudio recolección de datos y análisis, publicación y preparación del manuscrito.

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética local (Comité de ética de investigación humana, Centre Hospitalier Universitaire de Niza/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo está ajustado específicamente para el uso del concentrado 22 3 anticuerpo en un stainer IHC automatizado disponible en el mercado (conocido como autostainer aquí, ver la Tabla de materiales) para muestras de citología y biopsias del tumor.
1. preparación de las muestras de tejido del Tumor
<ol><li>Fijar el tejido del tumor en 10% formalina neutra tamponada (NBF) en un cassette. Nota: Tejido tumoral de tumores pulmonares proximales generalmente es obtenido por broncoscopia, realizada bajo sedación moderada por un neumólogo o especialista del pulmón. Para las lesiones periféricas y enfermedad pulmonar difusa, se indica una biopsia transbronquial o una aguja. Estos procedimientos generalmente se realizan en un quirófano o unidad de cuidados intensivos.</li>
	<li>Insertar el cassette en parafina. Nota: Fijación puede lograrse mediante perfusión o inmersión inmediatamente después de la disección y requiere típicamente 8 a 10 h. El volumen de fijador debe ser superior al volumen de muestra de 15 – 20 x. No se recomienda para fijar el tejido de la biopsia por más de 10 horas, porque overfixation puede enmascarar el antígeno. La velocidad de fijación es cerca de 1 mm por hora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Infiltrarse en la muestra de tejido fijo con cera en el procesador de tejido (véase Tabla de materiales). Nota: La deshidratación se realiza en tres baños de alcohol con el aumento de las concentraciones de 70%, 85% y 90%. Finalmente se extrae el agua por tres baños de alcohol absoluto final. La limpieza se realiza en los tres baños de tolueno y la infiltración de cera en baños de cera caliente (44 a 60 ° C).</li>
	<li>Incrustar el tejido dentro de un molde con parafina fundida (véase Tabla de materiales) y espere hasta solidificación.</li>
	<li>Sección del tejido parafina-encajado en un grosor de 3 μm en un micrótomo.</li>
	<li>Transferencia de la cinta de parafina a un vidrio de microscopio positivamente cargado Deslice (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Seque el portaobjetos durante 1 h a 37 ° C. Nota: Almacenar las secciones de tejido a 2 – 8 ° C (preferidos) o a temperatura ambiente hasta 25 ° C para preservar la antigenicidad y la mancha dentro de 15 d de seccionamiento.</li>
</ol>2. preparación de muestras de citología
<ol><li>
Recoger bronquiales lavados en una solución conservante (véase tabla de materiales). Nota: Para esto, se utiliza técnica de broncoscopia estándar.<ol>
<li>Lavado la distribución del bronquio a ser muestreado. Recoger el lavado en un recipiente limpio. Etiqueta el recipiente con el paciente y de primer apellido, fecha de nacimiento y origen de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir el líquido de lavado bronquial de un tubo cónico de 50 mL y añadir 2 g de DL-Ditiotreitol polvo (véase Tabla de materiales), vortex el tubo durante 30 minutos y luego lo Centrifugue a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y añadir 10 mL de una solución de mucolítica (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Agitar la muestra durante 20 min a velocidad media (nivel 9) y centrifugar a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y el precipitado de células de depósito en tubos que contengan 10% NBF.</li>
	<li>Añadir 4 gotas de un reactivo de preparación del bloque de célula (véase Tabla de materiales) para el sedimento celulares.</li>
	<li>Transferir el precipitado de células en una casete, lo fija en el 10% NBF y parafina-embed para celular bloque preparación y seccionamiento (ver pasos 1.1 – 1.7).</li>
</ol>3. ensayo de tinción PD-L1
<ol><li>Encienda el autostainer y el ordenador.</li>
	<li>Haga doble clic en el icono del autostainer y elija el usuario.</li>
	<li>Haga clic en 'Crear etiqueta' y luego en 'Protocolo'.</li>
	<li>Haga doble clic en el protocolo de 22 3. Nota: El protocolo está instalado primero en computadora del autostainer haciendo clic en ' crear protocolo '. El protocolo completo se proporciona como archivo adicional 1.</li>
	<li>Escriba el ID del paciente en la etiqueta y haga clic en 'Imprimir'.</li>
	<li>Pegar la etiqueta de la diapositiva.</li>
	<li>Abra el cajón diapositiva pulsando en el botón de la gaveta que se ha elegido.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos rotulado en la almohadilla térmica con la etiqueta hacia arriba y hacia adentro.</li>
	<li>Cierre el cajón deslizante.</li>
	<li>Retire las tapas de los depósitos y los reactivos en los estantes de los reactivos de la carga.</li>
	<li>Abra el capó del filtro y coloque las parrillas en el carrusel de los reactivos, asegurándose de que ajuste y sostenga en posición.</li>
	<li>Cierre la cubierta.</li>
	<li>En el software, haga clic en el instrumento que se utilizará y haga clic en 'Ejecutar'.</li>
	<li>Al final del procedimiento IHC, enjuagar el portaobjetos durante varios segundos con agua y una gota de una solución de limpieza.</li>
	<li>Rehidratar la diapositiva con un baño de etanol 100% y un segundo baño de etanol 95% durante varios segundos.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos en la máquina de cubreobjetos para una carga automatizada del cubreobjetos.</li>
</ol>4. interpretación de la tinción de PD-L1
Nota: Un patólogo cualificado debe realizar la interpretación de la prueba IHC PD-L1.
<ol><li>Evaluar la calidad de la tinción de PD-L1 mediante el análisis de los controles positivos y negativos antes de la examinación del espécimen del paciente. Nota: Los resultados obtenidos en la muestra del paciente se consideran válidos si la tinción de los controles no es aceptable.</li>
	<li>Confirmar la presencia de un mínimo de 100 células viables del tumor bajo un microscopio. Nota: El informe cuando el espécimen del paciente tiene menos de 100 células del tumor.</li>
	<li>En una ampliación baja de 4 X, evaluar todas las áreas de tumor bien conservado de positivos y negativos. Nota: En una ampliación baja, membrana parcial la coloración o la coloración de la membrana de intensidad débil (1 +) puede ser difícil de reconocer.</li>
	<li>Puntuación parcial o completa de la célula tinción de membrana. Nota: La tinción citoplasmática tiene que excluirse de la interpretación.</li>
	<li>Calcular el TPS determinando la proporción de las células del tumor positivo PD-L1 en relación a todas las células del tumor presentes en las áreas de tumor bien conservado. Nota: Sólo las células del tumor viable deben ser examinadas. Otros elementos celulares, como las células inmunitarias, células necróticas, las células normales y artefactos, tienen que ser excluidas de la exploración.</li>
</ol>

<ol><li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Reck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+Chemotherapy+for+PD-L1-Positive+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).</li>
<li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced%2C+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+randomised%2C+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li>
<li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing%3A+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li>
<li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+diagnosis+and+staging+in+the+minimally+invasive+age+with+increasing+demands+for+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).</li>
<li>Padmanabhan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Adequacy+of+Small+Biopsy+and+Fine-Needle+Aspiration+Specimens+for+Molecular+Testing+by+Next-Generation+Sequencing+in+Patients+With+Lung+Cancer%3A+A+Quality+Improvement+Study+at+Dartmouth-Hitchcock+Medical+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).</li>
<li>Tsao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsao%2C+MS+%22IASLC+ATLAS+of+PD-L1+Immunohistochemistry+Testing+in+Lung+Cancer%22">IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer</a>. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).</li>
<li>Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+IHC+in+NSCLC+with+a+global+and+methodological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective.</a> Lung Cancer. , 102-105 (2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-PD-L1+antibody+to+determine+PD-L1+expression+in+multiple+automated+immunohistochemistry+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms.</a> PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-programmed+death+ligand+1+antibody+to+determine+programmed+death+ligand+1+expression+in+cytology+samples+obtained+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).</li>
<li>Skov, B. G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li>
<li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li>
<li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Comparison+among+cytology%2C+small+biopsy%2C+and+surgical+resection+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li>
<li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos validado una LDT optimizado usando el concentrado de anticuerpo 22 3 PD-L1, comparando con el validados clínicamente prueba comercial correspondiente10,11. 3 22 concentrados basados en anticuerpos LDT mostró una alta tasa de concordancia entre (~ 100%) la biopsia y muestras citológicas (~ 95%) en comparación con la expresión de PD-L1 IHC determinada usando el análisis de PD-L1 IHC 3 de 22 en ≥1% TPS y el ≥50% TPS puntos de corte. Como recientemente recomend...

Recientes ensayos clínicos han demostrado la eficacia de la pembrolizumab, un humanizado IgG4 kappa isotipo anticuerpo monoclonal que bloquea la interacción entre la muerte celular programada 1 (PD-1) y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, en el tratamiento de pacientes con 2,1,de avanzado NSCLC del3,4.
Actualmente, pembrolizumab está aprobada para el tratamiento de NSCLC PD-L1-expresión en ambos pacientes de tratamiento con una expresión de PD-L1 TPS de ≥50% y no del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o aberraciones de genomic tumor linfoma anaplásico kinasa (ALK)3 y para previamente tratado a pacientes con un TPS de PD-L1 de ≥1%1.
PD-L1 expresión de la proteína detectada por IHC ha sido ampliamente utilizada como un ensayo de biomarcadores predictivos para las terapias anti-PD-1/PD-L1. En ensayos clínicos de pembrolizumab, el TPS de PD-L1 obtenidos con muestras de tejido de formalina-fijo de parafina-encajado (FFPE) se determinó utilizando la PD-L1 IHC 3 22 compañero ensayo5. Este ensayo ha sido aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) y ha marcado CE en Europa para la determinación del tumor TPS PD-L15.
Adicionales opciones globales a través de las instituciones para las evaluaciones confiables y de alta calidad de los TPS de PD-L1 con LDTs que utilizan el concentrado 22 3 anticuerpo son esenciales para apoyar las decisiones clínicas sobre paciente elegibilidad para pembrolizumab tratamiento. Un gran número de laboratorios de patología no tienen acceso al ensayo de PD-L1 IHC 3 22 diagnóstico de compañero. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de LDTs confiables y coherentes compatibles con plataformas de reactivos autostainer IHC adicionales, ampliamente disponibles.
Por otra parte, es necesario establecer LDTs utilizando muestras citológicas que son el tipo de muestra sólo disponible con frecuencia en pacientes de CPCNP. El ensayo del compañero PD-L1 IHC 3 22 está validado para resecciones, biopsias de aguja de núcleo y estructura sólo si la broncoscopía rinde 100 células del tumor. Aunque con frecuencia se obtienen los tipos anteriores de la muestra, muestras citológicas son recogidas más fácilmente y el tipo de muestra más comúnmente disponibles en algunas instituciones6,7. Sin embargo, existe actualmente ningún ensayo diagnóstico validado para la evaluación de la expresión de PD-L1 en muestras de citología; confiables LDTs compatibles con muestras citológicas facilitaría aún más calidad PD-L1 prueba.
Además, al establecer la validación clínica de un LDT, la IHC debe realizarse de una manera similar a la correspondiente prueba comercial clínicamente validado8. Por ejemplo, varios pasos críticos deben ser verificadas para obtener la misma señal en secciones seriadas como titulación de anticuerpos, retrasos del tratamiento previo, tiempo de incubación y sistemas de amplificación9.
Recientemente desarrollamos un LDT optimizado que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpos para evaluar la expresión de PD-L1 en biopsias del tumor y las muestras de citología10,11. Se encontró una alta concordancia con la LDT versus el "gold standard" PD-L1 IHC 3 22 ensayo10,11. Este protocolo clínico validado apoyo confiable y de alta calidad PD-L1 prueba en todas las regiones a nivel mundial.

<table><tbody><tr><td>NovaPrep HQ1</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Solución conservante para muestras de citología</td></tr><tr><td>Novaprep&reg; HQ+ B</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Solución mucolítica</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6</td><td>Sakura</td><td>6042 VIP 6</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 Sistema de consola de inclusión de tejidos</td><td>Sakura</td><td>5229 TEC 5</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio para microscopio SuperFrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3801</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Multi Reax Agitador de vórtice</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-889-410</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytoblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7401150</td><td></td></tr><tr><td>22C3 anticuerpo concentrado anti-PD-L1</td><td>Agilent Dako</td><td>#M365329</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td><td>Agilent Dako</td><td>SK006</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Agilent Dako</td><td>AS480</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA autostainer</td><td>Ventana</td><td>#750-600</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HQ Enlazador universal</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HRP Multimer</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplification H2O2</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplifier</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Multímetro de Amplificación</td><td>Ventana</td><td>#760-100</td><td></td></tr><tr><td>OptiView DAB</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Cobre</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina II</td><td>Ventana</td><td>#790-2208</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Azulado</td><td>Ventana</td><td>#760-2037</td><td></td></tr><tr><td>Acondicionamiento Celular 1 (CC1)</td><td>Ventana</td><td>#950-124</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de película Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>4742</td><td></td></tr></tbody></table>

con 22 3 anticuerpos anti-pd-l1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monoterapia ha sido aprobado para el tratamiento de primera y segunda línea de pacientes con PD-L1-expresando avanzado cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). Pruebas para la expresión de PD-L1 con el ensayo diagnóstico PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22 3 acompañante, que da una proporción de tumor puntuación (TPS), ha sido validado en tejido tumoral. Hemos desarrollado una optimizado desarrollado por el laboratorio prueba (LDT) que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpo (Ab) en un autostainer IHC ampliamente disponible para las muestras de biopsia y citología. El TPS PD-L1 fue evaluado con 120 secciones de pares todo tumor del tejido y las muestras de biopsia y con 70 emparejado muestras de biopsia y citología (lavado bronquial, n = 40; derrames pleurales, n = 30). El 22 3 que LDT basada en concentrado mostró una alta tasa de concordancia entre (~ 100%) la biopsia y citología de muestras (~ 95%) en comparación con la expresión de PD-L1 IHC determinada mediante el ensayo del compañero 3 22 PD-L1 IHC en ambos TPS cortar puntos (≥1%, ≥ 50%). La LDT optimizada presentada aquí, usando el concentrado de Ab 22 3 para determinar la expresión de PD-L1 en tanto tejido del tumor y en muestras de citología, ampliará la capacidad de los laboratorios en todo el mundo para evaluar la elegibilidad de los pacientes con NSCLC para tratamiento con monoterapia de pembrolizumab de una manera confiable y reproducible.

Utilizando el procedimiento presentado aquí y como se describe en detalle en recientes publicaciones10,11 de este grupo, LDT optimizada fue validada clínicamente con 120 archivo FFPE NSCLC biopsia las muestras de pacientes sometidos a cirugía resección o una biopsia en el Hospital Universitario de Pasteur, Niza, entre marzo de 2007 y marzo de 2016. Por otra parte, para la evaluación de la expresión de PD-L1 de muestras citológicas...

Para ampliar la capacidad de los laboratorios en todo el mundo para evaluar la elegibilidad de los pacientes con cáncer de pulmón para el tratamiento con pembrolizumab, de una manera confiable y reproducible, hemos desarrollado un análisis que utiliza el concentrado 22 3 anticuerpo ampliamente disponible immunohistochemical autostainer, para muestras de biopsia y citología.

Con 22 3 anticuerpos Anti-PD-L1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Este método que utiliza el concentrado de anticuerpos 22C3 para determinar la expresión de PD-L1 tanto en el tejido tumoral como en la muestra de citología ampliará la capacidad de los laboratorios para evaluar la selección de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas para la inmunoterapia de una manera confiable y reproducible. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente concordante con el ensayo estándar de oro y apoyará pruebas PD-L1 confiables y de alta calidad en todas las regiones de todo el mundo. En general, los patólogos nuevos en este método lucharán debido a la tinción granular observada ocasionalmente.Además, la tinción de las células humanas es algo más intensa que la observada con el estándar de oro. Por lo tanto, la formación de los patólogos es necesaria para obtener una interpretación correcta de la tinción PD-L1 con el LDT 22C3. Demostrando el procedimiento será la Sra.Marame Hamila, un técnico de mi laboratorio. Para comenzar, fije el tejido tumoral en formalina 10%con búfer neutro en un cassette e incruste el casete en la parafina como se describe en el protocolo de texto. Incrustar el tejido infiltrado dentro de un molde que está lleno de parafina fundida.Deje que el tejido permanezca en el molde hasta que la parafina se haya solidificado. Después de esto, utilice un microtoma para secuestrando el tejido incrustado en parafina con un grosor de tres micrómetros. Transfiera la cinta de parafina a un portaobjetos de vidrio cargado positivamente.Luego, seque el portaobjetos durante una hora a 37 grados Centígrados. En primer lugar, recoger los lavados bronquiales en una solución conservante. Transfiera los lavados a un tubo cónico de 50 mililitros.Añadir dos gramos de DL-Ditiothreitol y vórtice el tubo durante 30 minutos, luego centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y agregue 10 mililitros de una solución mucolítica. Agitar la muestra a velocidad media durante 20 minutos y centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de esto, retire el sobrenadante y deposite el pellet celular en un tubo de recolección que contenga 10% de formalina neutra. Agregue cuatro gotas de un agente de preparación de bloques de celdas. Transfiera el pellet celular a un casete.Fijar el pellet celular para la incrustación y sección de parafina utilizando el proceso descrito anteriormente para la preparación de muestras de tejido tumoral. Para empezar, encienda el desatén automático y el ordenador. Haga doble clic en el icono de la opción de detección automática y elija el usuario.Haga clic en Crear etiqueta y, a continuación, en Protocolo. Haga doble clic en el protocolo 22C3. Rellene la identificación del paciente y haga clic en Imprimir.Después de esto, pegue la etiqueta en la diapositiva. Pulse el botón del cajón de diapositivas elegido para abrirlo y coloque la diapositiva etiquetada en la almohadilla térmica con la etiqueta hacia arriba y hacia adentro. Cierre el cajón de diapositivas.A continuación, retire las tapas de los dispensadores. Cargue los reactivos en el bastidor de reactivos. Abra la capucha de la trituradora y coloque los bastidores de reactivos en el carrusel de reactivos, asegurándose de que encajen correctamente y se mantengan en su posición, luego cierre la campana.En el software, haga clic en el instrumento que se utilizará y, a continuación, haga clic en Ejecutar. Al final del procedimiento IHC, utilice agua del grifo con una sola gota de solución de limpieza para enjuagar el portaobjetos durante varios segundos. Deshidrate la diapositiva sumergiéndola secuencialmente en dos baños de etanol durante varios segundos cada uno, luego coloque la diapositiva en una máquina de cobertura para cargar automáticamente el resbalón de la cubierta.Para comenzar a evaluar la calidad de la tinción PD-L1, analice los controles positivos y negativos antes de examinar la muestra del paciente. Con un microscopio, confirme la presencia de al menos 100 células tumorales viables. Con un aumento bajo de 4 veces, evalúe todas las áreas tumorales positivas y negativas bien conservadas.Después de esto, puntúe la tinción parcial o completa de la membrana celular y calcule la puntuación de la proporción tumoral evaluando la proporción de células tumorales PD-L1 positivas en relación con todas las células tumorales presentes en las áreas tumorales bien conservadas. En este estudio, la puntuación de la proporción tumoral o TPS se evalúa para muestras de biopsia de tejido emparejado en bloques de células preparados a partir de lavados bronquiales o derrames pleurales. Los patrones de tinción representativos con muestras de biopsia se utilizan para comparar el concentrado de anticuerpos 22C3 con el ensayo complementario PD-L1 IHC 22C3.El coeficiente de correlación intraclase, que se utiliza para medir la correlación de la puntuación TPS como una variable continua, es del 99% entre el LDT y el estándar de oro. Los patrones de tinción representativos con muestras de citología también se utilizan para comparar el concentrado de anticuerpos 22C3 con el ensayo complementario PD-L1 IHC 22C3. La tasa de concordancia de las muestras de biopsia y citología con el LDT es superior al 95% cuando se utiliza cualquiera de los puntos de corte del TPS.El coeficiente de correlación intraclase mientras se utiliza TPS como variable continua está entre 0,88 y 0,90. Una vez dominada, esta técnica proporciona una alta tasa de concordancia con el estándar de oro en la evaluación del límite de positividad o histología tumoral para muestras de tejido y citología. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras deben evaluarse con referencia a la diapositiva HE y en algunos casos difíciles se pueden realizar manchas complementarias para evaluar las células inmunitarias para excluir la interpretación errónea de la expresión PD-L1 solo en las células tumorales.Tras este procedimiento, se pueden evaluar otros especímenes como biopsias de aguja fina, EUS-FNA o cepillos bronquiales. Después de su establecimiento en las clínicas, la solidez del ensayo debe mantenerse a lo largo del tiempo buscando la acreditación, siguiendo los procedimientos operativos estándar y participando regularmente en esquemas externos de evaluación de la calidad. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo implementar el protocolo optimizado usando el 22C3 anti-PD-L1 concentrado en un autotainer IHC ampliamente disponible tanto muestras de biopsia como de citología de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.

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Este video describe el ensayo de inmunofluorescencia de células tumorales circulantes (CTC), una técnica para caracterizar los biomarcadores en células tumorales circulantes en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas. Este ensayo podría usarse para monitorear los cambios dinámicos del tumor y la respuesta inmunitaria, que pueden reflejar la respuesta a la quimioterapia, la radiación y los posibles tratamientos de inmunoterapia.

Ensayo de inmunofluorescencia CTC: una técnica para caracterizar las células tumorales circulantes

Este protocolo describe la preparación de muestras tumorales fijadas en formol e incluidas en parafina que se utilizan para preservar muestras de tejido y citología de cáncer de pulmón de células no pequeñas...

Preparación de muestras tumorales fijadas en formol e incluidas en parafina: un protocolo para preservar muestras de tejido y citología de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)

Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

La caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) es un tema popular en la investigación traslacional. Este protocolo describe un ensayo de inmunofluorescencia semiautomática (IF) para la caracterización y enumeración de CTCs en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Este protocolo experimental describe y optimiza un método de tinción de inmunohistoquímica múltiple (IHQ), principalmente mediante la optimización de las condiciones de incubación de anticuerpos de un solo canal y el ajuste de la configuración de anticuerpos y canales para resolver los problemas de autofluorescencia y diafonía de canales en tejidos de cáncer de pulmón de origen clínico.

Tinción inmunohistoquímica multiplex para tejido de cáncer de pulmón incluido en parafina

Este artículo tiene como objetivo describir un enfoque escalonado para realizar broncoscopia asistida por robot combinada con fluoroscopia, ultrasonido endobronquial radial y tomografía computarizada de haz cónico para obtener criobiopsias pulmonares transbronquiales dirigidas.

Broncoscopia asistida por robot combinada con imágenes multimodales para criobiopsias pulmonares dirigidas

Este manuscrito describe los procedimientos operativos y las precauciones para investigar los posibles mecanismos patogénicos comunes que vinculan el síndrome de Sjögren primario y el adenocarcinoma de pulmón a través del análisis bioinformático y la verificación experimental.

Síndrome de Sjögren primario asociado con adenocarcinoma de pulmón: sondeo de los posibles mecanismos patogénicos comunes y verificación experimental

Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

Aquí, presentamos el protocolo detallado en la BioMILD cribado prueba para realizar la prueba de clasificador circulación de microARN firma para detección temprana de cáncer de pulmón.

MicroARN basado biopsia líquida: La experiencia de lo miRNA de Plasma firma clasificador (MSC) para la detección de cáncer de pulmón

Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

Aprende a evaluar la expresión de PD-L1 en cáncer de pulmón no microcítico usando el concentrado de anticuerpo 22C3 en biopsias y muestras citológicas. Este método inmunohistoquímico ofrece alta concordancia con el estándar de oro para seleccionar pacientes candidatos a inmunoterapia de manera fiable.

Con 22 3 anticuerpos Anti-PD-L1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas (Video) | JoVE Journal

Con 22 3 anticuerpos Anti-PD-L1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas

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