Name: In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a formar trampas extracelulares de neutrófilos caninos in vitro mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite visualizar y cuantificar NETs y citH3 en tiempo real.

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El autor fue financiado por la Morris Animal Foundation (D15CA-907). El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, centro de salud equina y centro de salud de animales de compañía (2016-24-F). Los autores desean reconocer Geena Ng su asistencia con las figuras y Nghi Nguyen para su ayuda con el video.

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de California, Davis (protocolo número: 18338).
1. sangre
<ol><li>Extraer 10 mL de sangre desde la vena cefálica o yugular utilizando una aguja de 21 G por la aspiración de la jeringa.</li>
	<li>Para evitar excesiva tensión de esquileo, retire la aguja de la jeringa antes de transferir la sangre en tubos con heparina sódica (USP 75). Invertir suavemente los tubos varias veces para asegurar una mezcla adecuada de anticoagulante y sangre. Busque evidencia de coágulos o agregados de glóbulos rojos antes de colocar las muestras en hielo.</li>
</ol>2. neutrófilo aislamiento
<ol><li>Diluir la sangre con anticoagulante con un volumen igual de solución salina helada de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) (pH 7.4, sin cationes divalentes). Transferencia de 8 mL de sangre diluida en un tubo cónico de 50 mL polipropileno, que contiene 25 mL de dextrano de 3% (de Leuconostoc spp. disuelto en la solución de cloruro de sodio 0.9%). Coloque el tubo verticalmente en temperatura ambiente durante 30 min permitir la agregación y sedimentación de los eritrocitos.</li>
	<li>Capa con cuidado 5 mL de plasma rico en leucocitos (figura 1) en la parte superior 5 mL de medio gradiente de densidad en un tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Tenga cuidado de no mezclar los 2 soluciones11.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 400 x g con aceleración/desaceleración (A/D) set a 0 (sin freno) durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizando 5 mL pipeta serológica recoge la capa de células granulocitos puenteando el plasma y capas de células mononucleares (PBMC) de sangre periférica (figura 1). Utilizar una pipeta nueva cada vez para minimizar la contaminación.</li>
	<li>Lugar 4 a 6 mL de la capa de células polymorphnuclear (PMN) en un tubo cónico de polipropileno 50 mL. Puesto que una pequeña cantidad de agregados de eritrocitos puede ser aspirada junto con la capa PMN, utilizar una pipeta serológica de 1 mL para eliminar suavemente los agregados de eritrocitos que se colocan en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Lisar los eritrocitos restantes con 20 mL de agua ultrapura fría. Invierta suavemente el tubo varias veces para 30 a 60 s para lisis adecuado antes de agregar un volumen igual de solución de cloruro de sodio 1,8% helada.</li>
	<li>Centrifugue a 112 x g durante 10 min a 4 ° C, sistema de A/D 0.</li>
	<li>Repita el paso de lisis de eritrocitos si aparece roja esta pelotilla. Descartar el sobrenadante con una pipeta serológica y suavemente Resuspender el precipitado en 100 μl de DPBS (dextrosa de 5 mM, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 y albúmina de suero bovino 1%, pH 7.3). Combinar todas las celdas resuspendidas y coloque en hielo.</li>
	<li>Realizar un recuento de células usando un analizador automatizado de la célula y verificar la cuenta por un hemocitómetro. Si es necesario, PMNs se concentran sobre un portaobjetos de vidrio con una Citocentrifuga (1.000 rpm, 5 min) y determinar el porcentaje de neutrófilos contando el número de neutrófilos en el número total de células.</li>
	<li>Determinar la viabilidad de los neutrófilos mediante la realización de una prueba de exclusión del azul tripán señalados por Strober et al. 12 aislamiento exitoso debe generar una viabilidad del 95 al 100% y neutrófilos deben ser mayores a 95%.</li>
	<li>Determinar la concentración de neutrófilos multiplicando el recuento celular total y la viabilidad porcentaje porcentajes neutrófilos. Aislamiento exitoso debe generar una concentración de neutrófilos de 1,5 a 6 x 106/ml.</li>
	<li>Diluir neutrófilos a una concentración final de 1 x 106/ml con DPBS que contiene dextrosa 5 mM, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM de CaCl2y seroalbúmina bovina al 1% con pH ajustado a 7.3.</li>
</ol>3. fluorescente microscopia de neutrófilos energizados
<ol><li>Chapa de 12 bien cultura con lugar 200 a 400 μL de neutrófilos (1 x 106/ml) en cada pocillo de una poli-L-lisina. Permiten neutrófilos a adherirse al fondo de los pozos por incubación de las células a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Etiqueta de ácidos nucleicos con 1 μM de uno de los dos tintes de ácido nucleico, que las manchas en las células con las membranas intactas y que las manchas en las células con membranas permeables (véase Tabla de materiales), por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Activar neutrófilos con lipopolisacárido μg/mL 100 (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) como control positivo, o un volumen equivalente de DPBS como control negativo de 180 min a 37 ° C.</li>
	<li>Adquisición de imágenes con la GFP (excitación: 470/22 nm, emisión: 525/50 nm) y Texas Red canales (excitación: 585/29 nm, emisión: 628/32 nm) en una microscopía de fluorescencia a 40 aumentos en los siguientes puntos de tiempo: 30, 90, 120 y 180 min.</li>
</ol>4. red de cuantificación y detección de componentes netos mediante inmunofluorescencia
<ol><li>Coloque con cuidado el cubreobjetos de 18 mm de diámetro revestido Poly-D-lisina en los pocillos de una placa de cultivo de 12 pozos. Etiquetar adecuadamente los pozos.</li>
	<li>Semilla 100 a 200 μL de aislados neutrófilos (1 x 106/ml) directamente sobre el cubreobjetos y deje neutrófilos a adherirse al cubreobjetos por incubación de las células a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Activar neutrófilos, como se describe en 3.3. Inhibir la formación de la red por pretratamiento de neutrófilos con 200 µΜ Cl-Amidina (15 min, 37 º C) antes de su activación, como se ha descrito por Li et al. 13 asegurar que el control de vehículo apropiado (DMSO) se incluye en el experimento.</li>
	<li>Remueva cuidadosamente el cubreobjetos con pinzas finas. Capa de una hoja de película de parafina sobre un soporte de tubo de ensayo para crear pozos poco profundos y 2 ó 3 gotas 4% PFA en cada pozo10. Etiquetar adecuadamente los pozos y Coloque suavemente el cubreobjetos boca abajo en los pozos llenos de PFA. Permitir que las células para ser fijado a temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
	<li>Lavar las células 3 veces de DPBS durante 5 minutos, moviéndolos de un pozo a otro.</li>
	<li>Si immunolabelling no puede realizarse poco después de la fijación y activación de neutrófila, permiten cubreobjetos ser secado colocando el cubreobjetos hacia arriba en un trozo de papel de absorbancia. Cubreobjetos pueden conservarse hasta 1 semana boca arriba en una placa con 12 pozos cultura a 4 ° C hasta su análisis posterior. Lavar las células 3 veces de DPBS durante 1 min, utilizando la misma técnica como se describe en 4.4 antes de proceder al siguiente paso.</li>
	<li>Para permeabilizar las células, Coloque suavemente el cubreobjetos boca abajo sobre una caída de 1% NP-40 para 1 min, utilizando la técnica descrita en 4.4. Lavar 3 veces de DPBS durante 1 min en un eje de balancín.</li>
	<li>Al azar asignar cada muestra a un número y utilice un marcador de punto de diamantes para etiquetar el cubreobjetos por consiguiente.</li>
	<li>Preparar y etiqueta de Petri individuales alineados con la película de parafina y 100 a 200 μL de 5% de suero de cabra en la película (tampón de bloqueo). Coloque el cubreobjetos boca abajo sobre el amortiguador de bloqueo. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo primario (las histonas 1: 400 conejo policlonales anti-citrulinada H3 (citH3) en 5% de suero de cabra). Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37° C.</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín.</li>
	<li>Diluida de anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo (1: 200) en el suero de cabra 5%. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37 ° C en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.</li>
	<li>Para la detección simultánea de mieloperoxidasa (MPO) seguir los siguientes pasos para un protocolo modificado doble inmunomarcación descrito por Li et al. 13
</li>
	<li>Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Coloque cada cubreobjetos boca abajo sobre 100 a 200 μL de 10% conejo suero bajo suave balanceo (durante la noche, 4 ° C, en la oscuridad).</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.</li>
	<li>Incubar las células en cabra no conjugada de 50 μg/mL contra conejo Fab fragmentos por 2 h a temperatura ambiente en un eje de balancín en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo primario (1: 200 conejo policlonales anti-humano MPO anticuerpo) en suero de cabra 5%. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37° C en la oscuridad.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo en 5% de suero de cabra e incubar como se indica en 4.8</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.</li>
	<li>Controles de interferencia deben elaborarse mediante la exclusión de incubación con cualquiera de los dos anticuerpos primarios en el segundo paso etiquetado inmune.</li>
	<li>ADN de la mancha con 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, diclorhidrato (DAPI) por 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar 3 veces de DPBS durante 1 min en un eje de balancín en la oscuridad.</li>
	<li>Aplique una gota (50 μl) de antifade mountant sobre un portaobjetos de vidrio. Golpee suavemente el borde del cubreobjetos sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de tampón antes de colocar el cubreobjetos con las células boca abajo. El medio de montaje debe formar una capa delgada entre el cubreobjetos y el portaobjetos de cristal. Para quitar las burbujas de aire, presione muy suavemente sobre el cubreobjetos con pinzas finas.</li>
	<li>Muestras curar durante la noche en la oscuridad a 4 ° C. El medio de montaje debe endurecerse para el análisis microscópico con lentes de inmersión. Almacenar las muestras en 4 ° C en la oscuridad.</li>
</ol>5. neutrófilo trampa extracelular cuantificación
<ol><li>Ciega a los operadores adquirir y analizar las imágenes de microscopio para las condiciones experimentales.</li>
	<li>Usando un microscopio de fluorescencia a 40 aumentos, tomar 10 imágenes al azar de diferentes regiones de cada cubreobjetos en un experimento bajo los respectivos canales. Asegúrese de que el tiempo de exposición, brillo y contraste de cada canal se mantienen constantes a lo largo de la adquisición de imágenes.</li>
	<li>Analizar las imágenes utilizando el software disponible como ImageJ (NIH). Identificar redes basadas en la localización de cfDNA, citH3 y MPO (Figura 3A, B). Cuantificar el número de neutrófilos en 10 campos al azar para cada condición experimental y redes. Números de redes publicado puede expresarse como un cociente (número de redes: número total de neutrófilos) para cada condición experimental.</li>
	<li>Para evaluar los efectos del tratamiento sobre la expresión de citH3 intracelular, contar el número de neutrófilos con citH3 intracelular y el número de neutrófilos sin citH3 intracelular en 10 campos al azar en 40 aumentos bajo los respectivos canales ( Figura 3, flechas rojas). Expresión intracelular de la citH3 se puede expresar como el cociente del número de neutrófilos con citH3 intracelular para el número de neutrófilos sin citH3 intracelular.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
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<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142(2016).</li>
<li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151(2012).</li>
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<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
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<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos aquí un protocolo para observar los cambios en núcleos conformación y cfDNA comunicado en vida canina neutrófilos utilizando un colorante florescente de la célula y un tinte impermeant del celular. La principal ventaja de este ensayo es que permite para la detección en tiempo real de formación red por microscopía de alta resolución en vivo neutrófilos sin fijación de la célula, por lo tanto, proporciona una herramienta sencilla y valiosa para la observación en vitro de neta formación. Puesto que este...

Neutrófilos son de breve duración granulocitos responsables de la defensa inicial contra los patógenos invasores. Neutrófilos, reclutados en el sitio de la infección, eliminan microorganismos por fagocitosis, degranulación y generación de oxígeno reactivo (ROS) las especies1. En presencia de bacterias y endotoxinas, neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), compuestas de cromatina extracelular decoración con las histonas y las proteínas granulares como elastasa y mieloperoxidasa (MPO)2. Aunque redes tienen propiedades antimicrobianas indispensables, cada vez mayor evidencia experimental y clínica sugiere que entusiasta formación neta durante la sepsis puede llevar a múltiples órgano disfunción y muerte3,4, 5 , 6.
Porque las redes pueden desempeñar un papel patofisiológico similar en perros, las intervenciones terapéuticas que prevengan o disminuyen la formación de la red pueden servir como estrategias de tratamiento novedosas en animales sépticos. Por esta razón, hay una necesidad de una técnica confiable evaluar y cuantificar NETosis y componentes netos en perros. Componentes netos como nucleosomas ADN libre de células (cfDNA) han sido evaluados previamente en neutrófilos caninos y plasma de perros clínica7,8,9. Usando análisis de fluorescencia, Goggs y Letendre encontraron que perros sépticos tienen niveles más altos de cfDNA de perros sanos8. Aunque estas técnicas son altamente objetiva y cuantitativa, medición de la cfDNA y nucleosomas como marcadores de la NETosis no es específica ya que pueden derivar de células necróticas que no sean de NETosing neutrófilos. Aquí describimos una técnica que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar los comportamientos de los neutrófilos NETosing vivo. También detallamos un protocolo modificado usando doble inmunomarcación para cuantificar subjetivamente las redes y sus componentes como la MPO y citH3 en neutrófilos caninos10.

<table><tbody><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Peso molecular 450.000 &ndash; 650.000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific A1285801</td><td></td><td>con cationes divalentes</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific 14190136</td><td></td><td>Sin cationes divalentes</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Tinción fluorescente de ácido nucleico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM en DMSO; Tinciones en células con membranas permeables</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Tinción de ácido nucleico fluorescente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM en DMSO; tinciones en células con membranas intactas</td></tr><tr><td>Amperios de superficie NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihistona H3 anticitrulinado</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de Fab anti-conejo de cabra no conjugado</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Especificidad: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-mieloperoxidasa</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenilina (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

En respuesta a la invasión de patógenos, neutrófilos liberan trampas extracelulares neutrófilos (redes), que son redes extracelulares de ADN con las histonas y proteínas antimicrobianas. Formación de red excesiva (NETosis) citH3 liberación durante la sepsis se asocia con múltiples disfunción del órgano y la mortalidad en ratones y seres humanos y sus implicaciones en los perros son desconocidos. Aquí, describimos una técnica para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera para la observación y cuantificación de NETosis. Plasma rico en leucocitos, generado por sedimentación de dextrano, se separa por medios de separación gradiente de densidad disponible comercialmente y granulocitos recolectaron para la cuenta y las pruebas de viabilidad de la célula. Para observar en tiempo real NETosis en vivo neutrófilos, florescente de la célula y la célula impermeant ácido nucleico fluorescente manchas se agregan a neutrófilos activados por lipopolisacárido (LPS) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Con el tiempo se observan cambios en la morfología nuclear y formación de red por microscopía de fluorescencia. In vitro NETosis se caracteriza por co-colocalization sin células ADN de (cfDNA), mieloperoxidasa (MPO) y citrulinado histona H3 (citH3) utilizando un protocolo modificado de immunolabelling doble. Cuantificar objetivamente la neta formación y expresión de citH3 utilizando microscopía de fluorescencia, redes y células citH3-positivas se cuantifican de manera cegada utilizando software disponible. Esta técnica es un análisis específico para evaluar la capacidad en vitro de los neutrófilos caninos a NETosis.

Utilizando este protocolo de imágenes de células vivas, los investigadores pueden observar la morfología nuclear, la integridad de la membrana plasmática y la presencia de cfDNA en neutrófilos de vida. Un colorante nuclear impermeant celular tiñe ácidos núcleos rojo en células con membranas celulares dañadas. Otro tinte celular-permeant, etiquetas de los ácidos nucleicos intracelulares en células vivas con membranas intactas de plasma. Los neutrófilos intactas, independientemente de sus t...

Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Este método puede responder preguntas clave sobre la trampa extracelular de neutrófilos o la formación de NET en perros u otras especies. Las principales ventajas de estas técnicas incluyen la detección en vivo real de la formación de NET y la identificación de componentes de NET como la peroxidasa leve y la histona H3 citrulinada. Comience por obtener de 10 a 20 mililitros de sangre de la vena yugular de un donante canino sano, retirando la aguja de la jeringa antes de dispensar la sangre en tubos de heparina de sodio para evitar compartirla en exceso. Invierta suavemente los tubos unas cuantas veces para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y el anticoagulante, y compruebe si hay coágulos y agregados de glóbulos rojos antes de colocar las muestras en hielo.Diluir la sangre anticoagulada con un volumen igual de PBS de Dulbecco helado y transferir ocho mililitros de sangre diluida a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de Dextrano 3% filtrado. Coloque el tubo en posición vertical durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la agregación y sedimentación de los eritrocitos. A continuación, coloque cuidadosamente cinco mililitros de plasma rico en leucocitos sobre cinco mililitros de medio de gradiente de densidad en un tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 mililitros.Después de la centrifugación en gradiente de densidad, use una pipeta serológica de cinco mililitros para transferir la capa de células de granulocitos intermedios a una cónica de 50 mililitros y lise los eritrocitos coaspirados con las células polimorfonucleares con 20 mililitros de agua fría y ultrapura. Invierta suavemente el tubo durante 30 a 60 segundos para asegurar una lisis adecuada antes de lavar las células en un volumen igual de solución helada de cloruro de sodio al 1,8%. Después de invertir el tubo varias veces, centrifugar a cuatro grados centígrados.Utilice una pipeta serológica para eliminar cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet en 100 microlitros de tampón de cultivo celular. Contar y confirmar su viabilidad mediante la exclusión del azul tripano. A continuación, diluya los neutrófilos a una concentración de tampón de uno por diez a seis células por mililitro de tampón de cultivo celular.Es esencial utilizar una técnica estéril adecuada y manipular los neutrófilos con cuidado durante todo el proceso de aislamiento, ya que la contaminación y las fuerzas de cizallamiento pueden provocar necrosis in vitro y lisis celular. Para obtener imágenes de los neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia, agregue de 200 a 400 microlitros de células en cada pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos recubierta de poli-L-lisina para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius. Cuando los neutrófilos se hayan adherido al fondo de los pocillos, marque las células con un tinte de ácido nucleico fluorescente adecuado durante 10 minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, activar los neutrófilos con 100 microgramos por mililitro de LPS, 100 nanomolares de PMA como control positivo, o un volumen equivalente de tampón de cultivo celular como control negativo a 37 grados centígrados. A continuación, obtuve imágenes de los cultivos de neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 40 veces en los puntos de tiempo indicados. Para una cuantificación NET, coloque cuidadosamente cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina de 18 milímetros de diámetro en pocillos individuales de una placa de cultivo de 12 pocillos y etiquete los pocillos de acuerdo con el estímulo experimental.A continuación, siembre de 100 a 200 microlitros de los neutrófilos aislados directamente sobre los cubreobjetos para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados. Cuando los neutrófilos se hayan adherido a los cubreobjetos, active los neutrófilos en cada pocillo con LPS, PMA o DPBS durante 180 minutos como se acaba de demostrar. Durante los últimos 30 minutos de la incubación, coloque una lámina de película de parafina sobre un soporte de tubo de ensayo para crear pocillos poco profundos y agregue dos o tres gotas de paraformaldehído al 4% a cada pocillo.Etiquete los pocillos según sea apropiado experimentalmente y use pinzas finas para transferir suavemente los cubreobjetos de cada pocillo de la placa boca abajo al pocillo relleno de PFA correspondiente apropiado. Después de 20 minutos a temperatura ambiente, lave las células fijas tres veces durante cinco minutos en dos o tres gotas de solución salina tamponada por lavado moviendo las células de un pocillo de DPBS al siguiente. Para permeabilizar las células, coloque suavemente los cubreobjetos boca abajo sobre una gota de 1%NP-40 durante un minuto, seguido de tres lavados con solución salina tamponada de un minuto en un balancín.Después del último lavado, coloque los cubreobjetos boca abajo en 100 a 200 microlitros de suero de cabra al 5% en placas de Petri etiquetadas individualmente forradas con película de parafina plástica fresca para una incubación de una hora a 37 grados centígrados con balanceo. Al final de la incubación de bloqueo, lave los cubreobjetos tres veces en solución salina tamponada con balanceo como se acaba de demostrar. Transfiera los cubreobjetos a placas de Petri individuales revestidas con película de parafina de plástico en 50 a 100 microlitros del anticuerpo apropiado de interés para una incubación de una hora a 37 grados Celsius con balanceo.Después del lavado, incubar los cubreobjetos con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos adecuado durante una hora a 37 grados centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación secundaria de anticuerpos, lavar los cubreobjetos tres veces en solución salina tamponada en la oscuridad con balanceo seguido de tinción con colorante de ácido nucleico con DAPI durante cinco minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de tres lavados con solución salina tamponada de un minuto en la oscuridad con balanceo, aplique una gota de 50 microlitros de medio de montaje antidecoloración en un portaobjetos de vidrio por muestra, y monte con cuidado cada cubreobjetos secos boca abajo en una gota de medio de montaje.A continuación, deje que las muestras se curen durante la noche a cuatro grados centígrados, protegidas de la luz. A la mañana siguiente, obtenga 10 imágenes al azar de diferentes regiones de cada cubreobjetos con un aumento de 40 veces. Todos los neutrófilos intactos, independientemente del tratamiento, deben aparecer de color verde y exhibir los núcleos lobulados característicos de cero a 30 minutos después de la estimulación.Alrededor de los 90 minutos, los núcleos de los neutrófilos tratados con PMA comienzan a perder su apariencia lobulada y continúan descondensándose hasta la liberación de ADN libre de células. El LPS, un estimulante más lento y fisiológico de los neutrófilos caninos, normalmente no provoca la descondensación de la cromatina o la NETosis hasta 90 minutos después de la estimulación. A los 120 minutos, los neutrófilos activados por LPS y PMA se pueden ver rodeados de ADN libre de células.En comparación con las células estimuladas por LPS, más neutrófilos activados por PMA pierden la integridad de su membrana plasmática, como lo demuestra su tinción con colorante impermeabilado celular. Los neutrófilos no estimulados deben mantener sus núcleos lobulados y membranas plasmáticas intactas durante todo el período de incubación. Los neutrófilos estimulados por LPS durante 180 minutos, producen andamios NET discretos en forma de red muy cerca de los neutrófilos cercanos.Por el contrario, los neutrófilos activados por PMA producen grandes cantidades de NET que son notablemente más grandes en área. De hecho, PMA, un potente estimulante de una enzima que cataliza el componente esencial de NET, la histona citrulinada intracelular H3, induce un mayor número de células que expresan histona H3 citrulinada intracelular en comparación con los neutrófilos no estimulados y estimulados por LPS. Al realizar este ensayo, es extremadamente importante que el operador que adquiera y analice las imágenes del microscopio esté ciego a las condiciones experimentales para mantener una evaluación objetiva del ensayo.La mitad de estos procedimientos tienen sus ensayos, como el ELISA o la citometría de flujo, que se pueden realizar para cuantificar aún más la histona H3 citrulinada en las células. No olvide incluir controles negativos que consistan en neutrófilos no estimulados o neutrófilos tratados con el inhibidor del peptidil arginina, la cromida amidina. También recomendamos probar diferentes diluciones de anticuerpos primarios y secundarios para minimizar la unión inespecífica y las interferencias.

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Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Este protocolo describe un ensayo de neutrófilos trampa extracelular (red) altamente sensible y de alto rendimiento para la cuantificación semiautomática de ex vivo red formación por microscopia confocal tridimensional de la inmunofluorescencia. Este protocolo puede utilizarse para evaluar la red formación y degradación después de diferentes estímulos y se puede utilizar para estudiar terapias potenciales orientada en la red.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Describimos un método para identificar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en trombos arteriales cardiogénicas felinos finos fijos fijos fijos y con parafina incorporados de formaldehído mediante la recuperación de antígenos inducidos por calor y un protocolo de doble inmunoetiquetado.

Identificación de trampas extracelulares de neutrófilos en tromba arterial felino incrustada en parafina mediante microscopía de inmunofluorescencia

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Aprende a formar trampas extracelulares de neutrófilos caninos in vitro mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite visualizar y cuantificar NETs y citH3 en tiempo real.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

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