Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano
16 de noviembre de 2018
Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como donde las células madre de un folículo dental humano podrían ser genéticamente diseñadas para mejorar sus propiedades terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que las células madre pueden ser modificadas por la introducción del microRNA sin el peligro de una integración del genoma estable. Comience el procedimiento para la digestión enzimática de los dos folículos, precalentándolo a temperatura ambiente, células madre del folículo dental humano o medio de cultivo hDFSC y solución PBSPSG.
Descongelar una alícuota cada una de las soluciones de stock de Colágenonase tipo I y Dispase II. Preparar una solución de digestión añadiendo 500 microlitros de la solución de stock de colagenasa tipo I y 500 microlitros de la solución de stock Dispase II a 4 mililitros de basal Medium que contienen un 1% de agente antibiótico. Para evitar la contaminación del sitio durante el folículo dental humano, los tampones de lavado de células madre y los medios de cultivo utilizados deben contener agentes antibiótico.
Coloque un folículo dental extraído en un plato estéril de Petri. Añadir 10 mililitros de solución de PBSPSG para lavar el tejido extraído. Aspirar y desechar la solución y añadir la solución PBSPSG fresca para repetir el lavado.
Usando un escalón estéril picar el folículo extraído en pedazos si aproximadamente 1 por 1 milímetros. Transfiera el tejido picado y la solución PBSPSG de la placa Petri a un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros, lave el plato Petri con 10 mililitros de solución PBSPSG y transfiera la solución al mismo tubo. Centrifugar el tubo cónico a 353 x g a temperatura ambiente durante diez minutos.
Añadir 5 mililitros de solución digestiva al tejido paletizado, mezclar suavemente la solución y el tejido, incubar la mezcla a 37 grados centígrados y 5%CO2 en una incubadora de agitación durante dos horas. Después de dos horas, centrifugar la suspensión digerida de la célula y el tejido a 353 g durante diez minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet obtenido en 6 mililitros de medio de cultivo HDFSC.
Siembra la suspensión celular en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados, e incuba las células a 37 grados centígrados. Después de la recolección celular y la caracterización de HDFSC es como se describe en el protocolo de texto, hDFSC semilla en una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2 y 20%Oxígeno durante 24 horas.
Al día siguiente diluye 40 picomoles de microARN en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, y vórtice la solución. Diluir 0,67 microlitros de reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, vórtice la solución e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos añadir el microARN prediluido al reactivo de transfección prediluminado, mezclar la solución e incubar a temperatura ambiente durante quince minutos.
A continuación, agregue las complejidades de la transfección preparadas, por gota, directamente al medio de cultivo en las células. Mezcle suavemente balanceando la placa de cultivo celular de 24 pozos de ida y vuelta. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas.
24 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante de muestras en los respectivos tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros. Lavar las células con 1 mililitro de PBS y transferir el PBS al tubo centrífugo respectivo. Añadir 500 microlitros de goteos y EDTA a las células, e incubar la placa de 24 pozos a 37 grados centígrados, durante 3 minutos.
Detenga la tripsinación añadiendo 1 mililitro de medio de cultivo celular para las células y transfiriendo la solución al tubo de centrífuga respectivo. Centrifugar las células a 300 x g y 4 grados centígrados durante diez minutos. A partir de ahora, mantenga las células y los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario.
Deseche el sobrenadante, resuspendir las células en 100 microlitros de tampón de tinción y transferir la solución celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 0,5 mililitros de tinte reactivo de amina a cada muestra para distinguir entre células vivas y muertas. Mezclar suavemente la solución e incubar a 4 grados centígrados durante diez minutos.
Añadir 1 mililitro de PBS a las células, y centrífuga a 300 g y 4 grados celsius durante diez minutos Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 100 microlitros de PBS, agregue 33 microlitros de paraformaldehído, y mezcle las soluciones, almacene las muestras a 4 grados centígrados protegidos de la luz hasta la medición citométrica de flujo. Transfiera las muestras a tubos adecuados para mediciones citométricas de flujo y realice la citometría de flujo utilizando la estrategia de medición descrita en el protocolo de texto. Las células madre aisladas del folículo dental humano mostraron todas las características descritas para la definición de células estromales mesenquimales, las células eran de plástico adherente y mostraban una fibra de vidrio como morfología, en condiciones de cultivo estándar.
El análisis citométrico de flujo reveló que los hDFSC expresaban un panel de ciertos antígenos superficiales, incluidos CD29, CD44, CD73, CD90 y CD105. Mientras que CD45 y CD117 estaban ausentes. Los potenciales de diferenciación adipogénico, osteogénico y condrógeno de las células bajo condiciones específicas de cultivo in Vitro se confirmaron mediante inmunosu mancha, una proteína de unión a ácidos grasos para:Osteocalcin y Aggrecan.
La estrategia de medición utilizada para la cuantificación de la citotoxicidad y la eficiencia de absorción de microARNes etiquetada Cy3 24 horas después de la transfección, confirmó la absorción de microARN en el 100% de las células viables. Cantidades comparables de células muertas en muestras transinfectosas y no transinfectados indican que el microARN se introduce eficientemente sin efectos citotóxicos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transdiferenciación para responder a preguntas adicionales como plasticidad de Cytolab.
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Descripción general
Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células madre dentales extraídas del folículo dental humano. El método permite la modificación de células madre mediante la introducción de microARN sin los riesgos asociados con la integración estable en el genoma.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Medicina Regenerativa
- Biología de Células Madre
Antecedentes
- Las células madre del folículo dental humano (hDFSC) tienen aplicaciones terapéuticas potenciales.
- La ingeniería genética puede mejorar las propiedades de estas células madre.
- Las estrategias de modificación no virales son alternativas más seguras frente a los métodos tradicionales.
Objetivo del estudio
- Explorar la ingeniería genética de hDFSC para mejorar los resultados terapéuticos.
- Establecer un protocolo para la modificación transitoria de células madre dentales.
Métodos Utilizados
- Digestión enzimática de folículos dentales.
- Preparación de la solución de digestión con colagenasa tipo I y dispasa II.
- Uso de agentes antibióticos en tampones de lavado y medios de cultivo para prevenir contaminación.
- Introducción de microARN para modificación genética transitoria.
Resultados principales
- Se logró una modificación transitoria exitosa de hDFSC.
- El método demostró seguridad al evitar la integración estable en el genoma.
- Se observaron propiedades terapéuticas mejoradas en las células madre.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona una base para mejorar las terapias con células madre.
- La ingeniería genética transitoria puede ser un enfoque viable en medicina regenerativa.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la modificación genética transitoria de células madre del folículo dental humano mediante microARN, sin integración estable en el genoma, abordando una preocupación clave de seguridad en las terapias basadas en células madre. El enfoque facilita la reducción de riesgos preclínicos al permitir la validación funcional de mejoras terapéuticas antes del trasplante. Proporciona un método escalable y no viral para optimizar la eficacia de las células madre en aplicaciones de medicina regenerativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de las vías mediadas por microARN en el comportamiento de las células madre y su potencial de diferenciación.
- Valor operativo: Proporciona un método confiable para modular el fenotipo de las células madre sin alteración genómica, apoyando la validación de objetivos basada en hipótesis.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación del mecanismo terapéutico mediante cambios fenotípicos transitorios, mejorando la confianza en la selección de candidatos principales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera poblaciones estandarizadas de células madre listas para transfección, para ensayos consistentes de compuestos o moduladores.
- Valor operativo: Proporciona mediciones cuantificables de la incorporación de microARN y la viabilidad mediante citometría de flujo, lo que permite la reproducibilidad del ensayo entre diferentes laboratorios.
- Escalabilidad: Utiliza transfección con lípidos catiónicos compatible con formatos de placas de múltiples pocillos para protocolos de cribado de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita la progresión desde células madre aisladas hasta células funcionalmente modificadas para pruebas preclínicas de eficacia.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite evaluar los efectos del microARN en la función de las células madre sin preocupaciones relacionadas con la mutagénesis por inserción.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Utiliza el folículo dental posnatal como fuente accesible de células madre pluripotentes con alto potencial de proliferación para la modelización de la reparación de tejidos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al proporcionar un paso de modificación transitoria tras el aislamiento y la caracterización de células madre, lo que permite una optimización funcional antes de las aplicaciones posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el destino y comportamiento de las células madre mediante la introducción controlada de microARN.
- Selección: Permite la preparación estandarizada de células madre para evaluar moduladores genéticos o farmacológicos en formatos de placas multipocillo.
- Análisis: Proporciona cuantificación basada en citometría de flujo de la eficiencia de transfección y citotoxicidad, facilitando la comparación objetiva de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el aislamiento de células madre con la validación preclínica mediante la generación de células modificadas con mayor potencial terapéutico.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de transfección reutilizable aplicable a múltiples tipos de células madre y candidatos de microARN.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en las terapias con células madre al permitir la modulación transitoria y reversible de la expresión génica.
- Valor operativo: Ofrece un método de transfección no viral seguro, eficiente y reproducible, con efectos citotóxicos mínimos.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases tardías al permitir la evaluación preclínica del mecanismo sin los peligros asociados a la integración genómica.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos de células madre mediante la validación funcional antes de los estudios habilitantes para IND.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, disociación enzimática de tejidos y técnicas de transfección.
- Necesita acceso a incubadoras con agitación, citómetros de flujo e infraestructura estándar para cultivo celular.
- Exige la estandarización de las proporciones de reactivos de transfección y los tiempos de incubación entre diferentes equipos para garantizar la reproducibilidad.
- Requiere adaptar la dosis de microARN y las condiciones de transfección según la fuente o especie de células madre.
- Limitado a efectos transitorios; no es adecuado para aplicaciones que requieran modificaciones genéticas estables.
