Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano
November 16th, 2018
Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como donde las células madre de un folículo dental humano podrían ser genéticamente diseñadas para mejorar sus propiedades terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que las células madre pueden ser modificadas por la introducción del microRNA sin el peligro de una integración del genoma estable. Comience el procedimiento para la digestión enzimática de los dos folículos, precalentándolo a temperatura ambiente, células madre del folículo dental humano o medio de cultivo hDFSC y solución PBSPSG.
Descongelar una alícuota cada una de las soluciones de stock de Colágenonase tipo I y Dispase II. Preparar una solución de digestión añadiendo 500 microlitros de la solución de stock de colagenasa tipo I y 500 microlitros de la solución de stock Dispase II a 4 mililitros de basal Medium que contienen un 1% de agente antibiótico. Para evitar la contaminación del sitio durante el folículo dental humano, los tampones de lavado de células madre y los medios de cultivo utilizados deben contener agentes antibiótico.
Coloque un folículo dental extraído en un plato estéril de Petri. Añadir 10 mililitros de solución de PBSPSG para lavar el tejido extraído. Aspirar y desechar la solución y añadir la solución PBSPSG fresca para repetir el lavado.
Usando un escalón estéril picar el folículo extraído en pedazos si aproximadamente 1 por 1 milímetros. Transfiera el tejido picado y la solución PBSPSG de la placa Petri a un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros, lave el plato Petri con 10 mililitros de solución PBSPSG y transfiera la solución al mismo tubo. Centrifugar el tubo cónico a 353 x g a temperatura ambiente durante diez minutos.
Añadir 5 mililitros de solución digestiva al tejido paletizado, mezclar suavemente la solución y el tejido, incubar la mezcla a 37 grados centígrados y 5%CO2 en una incubadora de agitación durante dos horas. Después de dos horas, centrifugar la suspensión digerida de la célula y el tejido a 353 g durante diez minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet obtenido en 6 mililitros de medio de cultivo HDFSC.
Siembra la suspensión celular en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados, e incuba las células a 37 grados centígrados. Después de la recolección celular y la caracterización de HDFSC es como se describe en el protocolo de texto, hDFSC semilla en una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2 y 20%Oxígeno durante 24 horas.
Al día siguiente diluye 40 picomoles de microARN en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, y vórtice la solución. Diluir 0,67 microlitros de reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, vórtice la solución e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos añadir el microARN prediluido al reactivo de transfección prediluminado, mezclar la solución e incubar a temperatura ambiente durante quince minutos.
A continuación, agregue las complejidades de la transfección preparadas, por gota, directamente al medio de cultivo en las células. Mezcle suavemente balanceando la placa de cultivo celular de 24 pozos de ida y vuelta. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas.
24 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante de muestras en los respectivos tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros. Lavar las células con 1 mililitro de PBS y transferir el PBS al tubo centrífugo respectivo. Añadir 500 microlitros de goteos y EDTA a las células, e incubar la placa de 24 pozos a 37 grados centígrados, durante 3 minutos.
Detenga la tripsinación añadiendo 1 mililitro de medio de cultivo celular para las células y transfiriendo la solución al tubo de centrífuga respectivo. Centrifugar las células a 300 x g y 4 grados centígrados durante diez minutos. A partir de ahora, mantenga las células y los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario.
Deseche el sobrenadante, resuspendir las células en 100 microlitros de tampón de tinción y transferir la solución celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 0,5 mililitros de tinte reactivo de amina a cada muestra para distinguir entre células vivas y muertas. Mezclar suavemente la solución e incubar a 4 grados centígrados durante diez minutos.
Añadir 1 mililitro de PBS a las células, y centrífuga a 300 g y 4 grados celsius durante diez minutos Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 100 microlitros de PBS, agregue 33 microlitros de paraformaldehído, y mezcle las soluciones, almacene las muestras a 4 grados centígrados protegidos de la luz hasta la medición citométrica de flujo. Transfiera las muestras a tubos adecuados para mediciones citométricas de flujo y realice la citometría de flujo utilizando la estrategia de medición descrita en el protocolo de texto. Las células madre aisladas del folículo dental humano mostraron todas las características descritas para la definición de células estromales mesenquimales, las células eran de plástico adherente y mostraban una fibra de vidrio como morfología, en condiciones de cultivo estándar.
El análisis citométrico de flujo reveló que los hDFSC expresaban un panel de ciertos antígenos superficiales, incluidos CD29, CD44, CD73, CD90 y CD105. Mientras que CD45 y CD117 estaban ausentes. Los potenciales de diferenciación adipogénico, osteogénico y condrógeno de las células bajo condiciones específicas de cultivo in Vitro se confirmaron mediante inmunosu mancha, una proteína de unión a ácidos grasos para:Osteocalcin y Aggrecan.
La estrategia de medición utilizada para la cuantificación de la citotoxicidad y la eficiencia de absorción de microARNes etiquetada Cy3 24 horas después de la transfección, confirmó la absorción de microARN en el 100% de las células viables. Cantidades comparables de células muertas en muestras transinfectosas y no transinfectados indican que el microARN se introduce eficientemente sin efectos citotóxicos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transdiferenciación para responder a preguntas adicionales como plasticidad de Cytolab.
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Visión general
Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células madre dentales extraídas del folículo dental humano. El método permite la modificación de células madre mediante la introducción de microARN sin los riesgos asociados con la integración estable del genoma.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Medicina regenerativa
- Biología de células madre
Antecedentes
- Las células madre del folículo dental humano (hDFSC) tienen aplicaciones terapéuticas potenciales.
- La ingeniería genética puede mejorar las propiedades de estas células madre.
- Las estrategias de modificación no virales son alternativas más seguras a los métodos tradicionales.
Propósito del estudio
- Explorar la ingeniería genética de hDFSC para mejorar los resultados terapéuticos.
- Establecer un protocolo para la modificación transitoria de células madre dentales.
Métodos utilizados
- Digestión enzimática de folículos dentales.
- Preparación de solución de digestión con colagenasa tipo I y Dispase II.
- Uso de agentes antibióticos en tampones de lavado y medios de cultivo para prevenir la contaminación.
- Introducción de microARN para la modificación genética transitoria.
Resultados principales
- Se logró una modificación transitoria exitosa de hDFSC.
- El método demostró seguridad al evitar la integración estable del genoma.
- Se observaron propiedades terapéuticas mejoradas de las células madre.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona una base para mejorar las terapias con células madre.
- La ingeniería genética transitoria puede ser un enfoque viable en medicina regenerativa.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables transient genetic modification of human dental follicle stem cells using microRNA without stable genome integration, addressing a key safety concern in stem cell-based therapies. The approach supports preclinical de-risking by allowing functional validation of therapeutic enhancements prior to transplantation. It provides a scalable, non-viral method to optimize stem cell efficacy for regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of microRNA-mediated pathways in stem cell behavior and differentiation potential.
- Operational Value: Provides a reliable method to modulate stem cell phenotype without genomic alteration, supporting hypothesis-driven target validation.
- Predictive Value: Facilitates assessment of therapeutic mechanism through transient phenotypic changes, improving confidence in lead candidate selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, transfection-ready stem cell populations for consistent compound or modulator screening.
- Operational Value: Delivers quantifiable microRNA uptake and viability readouts via flow cytometry, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Uses cationic lipid transfection compatible with multi-well plate formats for medium-throughput screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from isolated stem cells to functionally modified cells for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of microRNA effects on stem cell function without insertional mutagenesis concerns.
- Disease-Relevant System: Utilizes postnatal dental follicle as an accessible source of multipotent stem cells with high proliferation potential for tissue repair modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a transient modification step after stem cell isolation and characterization, enabling functional optimization before downstream applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell fate and behavior through controlled microRNA introduction.
- Screening: Enables standardized preparation of stem cells for evaluating genetic or pharmacological modulators in multi-well formats.
- Analytics: Provides flow cytometry-based quantification of transfection efficiency and cytotoxicity, supporting objective comparison of conditions.
- Translational Research: Bridges stem cell isolation and preclinical validation by generating modified cells with enhanced therapeutic potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transfection platform applicable to multiple stem cell types and microRNA candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in stem cell therapeutics by enabling transient, reversible modulation of gene expression.
- Operational Value: Offers a safe, efficient, and reproducible non-viral transfection method with minimal cytotoxic effects.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by allowing preclinical assessment of mechanism without genomic integration hazards.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell candidates through functional validation prior to IND-enabling studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, enzymatic tissue dissociation, and transfection techniques.
- Needs access to shaking incubators, flow cytometers, and standard cell culture infrastructure.
- Demands standardization of transfection reagent ratios and incubation times across teams for reproducibility.
- Requires adaptation of microRNA dosage and transfection conditions for different stem cell sources or species.
- Limited to transient effects; not suitable for applications requiring stable genetic modification.
