Name: Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a modificar genéticamente células madre del folículo dental humano mediante introducción de microRNA sin integración estable del genoma. Este protocolo mejora las propiedades terapéuticas para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Este trabajo fue apoyado por el programa de Cajamarca del centro médico de la Universidad de Rostock (889018) y la Fundación húmeda (2016-11). Además, P.M. y R.D. son apoyados por el BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs están aisladas de los folículos dentales de los dientes extraídos de la sabiduría proporcionados por el Departamento de Cirugía Oral y maxilofacial plástico de Rostock University Medical Center. Se obtuvo consentimiento informado y autorización por escrito de todos los pacientes. Este estudio fue autorizado por el Comité de ética local de la Universidad de Rostock (permiso No. A 2017-0158).
1. aislamiento de hDFSCs
Nota: Para evitar la contaminación bacteriana, dientes de la sabiduría no debe ser estalló antes de la extracción
<ol><li>
Preparación de soluciones requiere
	<ol>
<li>Preparar una solución salina tamponada con fosfato (PBS) / solución de penicilina-estreptomicina-glutamina (P-S-G): mezclar 495 mL de PBS con 5 mL de solución de P-S-G. Almacenar en alícuotas de 50 mL a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar medio de cultivo de hDFSC: 445 ml de medio basal con 5 mL de agente antibiótico y 50 mL de suero bovino fetal (FBS). Almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar colagenasa tipo stock solución (30 mg/mL): diluir 300 mg del tipo de colagenasa en 10 mL de medio basal suplementado con 1% de agente antibiótico. Mezcle la solución con energía. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm. Tienda alícuotas de 500 μl de colagenasa tipo I solución a-20 ° C.</li>
		<li>Prepare solución Dispase II (40 mg/mL): diluir 40 mg del Dispase II en 10 mL de medio basal suplementado con 1% antibiótico agente. Mezcle la solución con energía. Filtrar la solución con un filtro de 0.2 μm. Almacenar en alícuotas de 500 μl de solución stock Dispase II a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento quirúrgico
	<ol>
<li>Inyectar una cantidad suficiente (máximo: 2 mL) del anestésico local.</li>
		<li>Crear y levantar un colgajo mucoperióstico de tres lados. No es necesario levantar un colgajo lingual.</li>
		<li>Proteger el aspecto lingual con un elevador perióstico.</li>
		<li>Suavemente molino bucal y distal del hueso con una fresa redonda de metal duro.</li>
		<li>Aflojar el tejido del folículo con un elevador perióstico. Retire con cuidado el diente completo (germen) y folículo tirando de la corona (y folículo) con posterior (tercer molar) fórceps.</li>
		<li>Desbridar y regar la toma bien con solución de NaCl.</li>
		<li>Vuelva a colocar la aleta mucoperióstica con suturas de vicryl (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Sacar el folículo dental de la cavidad oral y en una alícuota de 50 mL de solución de PBS/P-S-G. Nota: La muestra puede guardarse a 4 ° C hasta el procesamiento posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestión enzimática del folículo dental
	<ol>
<li>Caliente previamente el medio de cultivo de hDFSC y solución de PBS/P-S-G a la temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Descongelar una alícuota de cada tipo de colagenasa I y II Dispase soluciones stock. Preparar una solución de digestión de 3 mg/mL tipo de colagenasa y 4 mg/mL Dispase II agregar 500 μl de cada colagenasa tipo I y solución a 4 mL de basal medio que contiene 1% agente antibiótico Dispase II.</li>
		<li>Lugar del folículo extraído en una placa Petri estéril y añadir 10 mL de solución de PBS/P-S-G para lavar el tejido extraído. Repita este paso de lavado dos veces.</li>
		<li>Pique el folículo extraído a los pedazos de aproximadamente 1 mm x 1 mm con un bisturí estéril dentro de la caja Petri con 10 mL de solución de PBS/P-S-G.</li>
		<li>Transferencia de tejido picadito y solución de PBS/P-S-G de la placa de Petri en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Lave la placa de Petri con 10 mL de solución de PBS/P-S-G y transferir la solución al mismo tubo.</li>
		<li>Centrifugar el tubo de centrífuga cónico de 10 min a 353 x g a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 5 mL de solución de digestión a los tejidos concentrados. Mezclar suavemente la solución y el tejido. Incubar la mezcla a 37 ° C y 5% de CO2 por 2 h en un incubador de agitación.</li>
		<li>Centrífuga digerido suspensión de células y tejidos en 353 x g durante 10 min a RT. descartar el sobrenadante y Resuspenda el sedimento obtenido en 6 mL de medio de cultivo hDFSC.</li>
		<li>Suspensión de células de la semilla en una de 25 cm2 matraz de cultivo de células e incubar las células a 37 ° C, 5% CO2 y 20% O2. Nota: Si el tejido no es totalmente digerido, transferir el tejido restante en el matraz de cultivo celular así.</li>
		<li>Cambiar el medio cuidadosamente 24 horas después de la siembra de la célula. Luego cambiar el medio cada tres días hasta confluencia. Nota: HDFSCs debe ser adherente de plástico 24 h después de la siembra de células y se puede separar de las células no adherentes y componentes de la sangre simplemente cambiando el medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de células
	<ol>
<li>Caliente previamente el medio de cultivo hDFSC, solución de PBS/P-S-G y solución de ácido (EDTA) tripsina/etilendiaminotetracético a RT.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante del frasco de cultivo y lavado las células confluentes con 5 mL de solución de PBS/P-S-G.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución de tripsina/EDTA al matraz de cultivo e incubar 3 min a 37 ° C. Detener el proceso de digestión mediante la adición de 3 mL de medio de cultivo de hDFSC en el matraz de la cultura.</li>
		<li>Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL y centrifugar la suspensión durante 10 min a 353 x g en RT. descartar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en una cantidad apropiada hDFSC de medio de cultivo.</li>
		<li>Contar celdas: suavemente mezclar 10 μl de suspensión celular con 10 μl de solución de azul tripán. Aplique 10 μL en una cámara de recuento y calcular la cantidad de células hDFSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Caracterización de hDFSCs
<ol><li>
Immunophenotyping
	<ol>
<li>Preparación de las células para análisis cytometric del flujo<ol>
<li>Preparación de soluciones requiere<ol>
<li>PBS/EDTA (2 mM) de preparar: Mezcle 996 mL de PBS con 4 mL de EDTA (0.5 M).</li>
				<li>Preparar el tampón de tinción: mezcla de 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) con 5 g de BSA. Filtrar la solución utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C hasta uso.</li>
				<li>Preparar la solución stock de paraformaldehido (PFA) (4%): diluir 4 g PFA en 100 mL de PBS y calentar la solución a 80 ° C. Mezclar la solución y ajustar el pH a 7.3. Parte alícuota obtuvo solución de la PFA en cantidades respectivas (1.5 mL) y almacenar a-20 ° C hasta uso. PRECAUCIÓN: Debido a los humos PFA son tóxicos, preparar la solución PFA en una campana de ventilación.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Después de la cosecha (1.4) de la célula, transferir 14 muestras de 5 x 104 células en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células y los reactivos en el hielo a menos que se indique lo contrario.</li>
			<li>Resuspenda las células en ciertas cantidades de tampón de tinción (4 ° C) y añadir FcR bloqueo reactivo (4 ° C) como se indica en la tabla 1.</li>
			<li>Añadir los siguientes anticuerpos hacia el lado interno de la respectiva muestra como se indica en la tabla 1: Allophycocyanin (APC) ratón humana CD29; Ratón APC control de isotipo κ IgG1; Proteína Peridinin-clorofila (PerCP)-Cyanine5.5 ratón humana CD44; PerCP-Cyanine5.5 mouse IgG2b control de isotipo κ; V500 ratón humana CD45; V500 mouse IgG1 control de isotipo κ; Ficoeritrina (PE) ratón humana CD73; Ratón de PE control de isotipo κ IgG1; PerCP-Cyanine5.5 ratón humana CD90; Ratón de PerCP-Cyanine5.5 control de isotipo κ IgG1; ratón contra CD105: Alexa Fluor (AF) 488; control negativo de IgG1 de ratón: AF488; PE-Cyanine7 ratón humana CD117; PE-Cyanine7 mouse IgG1, control de isotipo κ. Después de que los anticuerpos se han añadido a cada muestra, girar por anticuerpos y mezclar suavemente. Incubar las soluciones durante 10 min a 4 ° C.</li>
			<li>Añadir 1 mL de PBS (4 ° C) y centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
			<li>Resuspenda las células en 100 μl de PBS (4 ° C) y agregar 33 μl de PFA (4%). Mezclar las soluciones y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Medición de citometría de flujo de células Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células en hielo hasta la medición.<ol>
<li>Para examinar la expresión de antígenos de superficie, transferir muestras en tubos adecuados para mediciones de citometría de flujo.</li>
			<li>Medir por lo menos 2 x 104 eventos usando un citómetro de flujo. Analizar como se muestra en la figura 2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Potencial de diferenciación multipotentes de hDFSCs
	<ol>
<li>Utilice un disponible en el mercado humano mesenquimales células madre funcional Kit de identificación para confirmar adipogenic osteogénica y condrogénica diferenciación potencial de hDFSCs. Aplicar burro anti-cabra AF488 de anticuerpo secundario para la coloración de la proteína de unión a ácidos grasos 4 (FABP4) y aggrecan así como burro anti-ratón AF488 de anticuerpo secundario para la tinción de la osteocalcina. Para la tinción de núcleos, uso de medio de montaje con 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI). Nota: Preparar muestras sin anticuerpo primario como controles negativos para análisis microscópicos.</li>
		<li>Analizar la expresión de proteínas por microscopía confocal de barrido láser. Configuración de microscopía: objetivo de 40 x con inmersión en aceite; la excitación láser de 488 nm (para AF488) y 405 nm (para DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. transfección de hDFSCs
<ol><li>Después de la célula (1.4) la cosecha, la semilla hDFSCs en una placa de cultivo celular de 24 pozos 24 h antes de la transfección. Nota: A partir de la densidad celular es aproximadamente de 4 x 104 células por pocillo. Células deben llegar a confluencia de ~ 80% en el día de la transfección. Nota: La semilla una muestra adicional de la célula como control para el análisis cytometric del flujo.</li>
	<li>Preparación de complejos de transfección Nota: Para evitar contaminación por RNasas, limpie el área de trabajo directamente antes de la preparación de complejos de transfección con solución de descontaminación de Rnasa. Utilizar sólo material libre de ARNasas y soluciones. Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada.<ol>
<li>Preparar la solución stock de miR (50 μm): resuspender miR precursor marcado con Cy3 (5 nmol) en 100 μl de agua libre de nucleasa. Solución madre de alícuota miR obtenidos en la tienda en la oscuridad a-20 ° C hasta uso y cantidades respectivas (5 μl).</li>
		<li>Diluir 40 pmol de miR (0,8 μl de la solución madre de miR de 50 μm) en 66,7 μl de medio de suero reducido. Mezclar suavemente la solución</li>
		<li>Diluir 0.67 μl de reactivo de transfección basada en lípidos catiónicos en 66,7 μl de medio de suero reducido. Mezcle la solución suavemente e incubar 5 min a TA.</li>
		<li>Después de la incubación, añadir el reactivo de transfección previamente diluido a la miR previamente diluida. Mezcle la solución suavemente e incubar por 15 min a TA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir gota a gota los complejos preparados transfección directamente al medio de cultivo en las células. Mezclar suavemente, meciendo la placa de cultivo celular de 24 pozos y hacia atrás.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C, 5% CO2y 20% O2 durante 24 h.</li>
</ol>4. Análisis de la transfección
Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada.
<ol><li>
Cosecha después de la transfección de la célula Nota: Recopilar todas las soluciones de células de una muestra en el mismo tubo de centrífuga cónico de 15 mL.<ol>
<li>24 h después de la transfección, recoger el sobrenadante de las muestras en tubos de centrífuga correspondiente.</li>
		<li>Lavar las células con 1 mL de PBS, PBS de transferencia en el tubo de centrifugadora respectivos y agregar 500 μl tripsina/EDTA (RT) a las células. Incubar las soluciones por 3 min a 37 ° C.</li>
		<li>Parar la tripsinización añadiendo 1 mL de medio de cultivo (RT) a las células y la transferencia de la solución en el tubo de centrifugadora respectivos. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Nota: De este tiempo, mantener las células y los reactivos en el hielo a menos que se indique lo contrario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de las células para análisis cytometric del flujo
	<ol>
<li>Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células en 100 μl de tampón de tinción (4 ° C) y solución de transferencia celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 0,5 μl de colorante reactivo amina a las muestras para distinguir entre células vivas y muertas. Suavemente mezcle la solución e incubar 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Añadir 1 mL de PBS (4 ° C) a las células y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda las células en 100 μl de PBS (4 ° C) y agregar 33 μl de PFA (4%). Mezclar las soluciones y almacenar en hielo o a 4 ° C hasta el análisis cytometric del flujo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medición de citometría de flujo de células Nota: Realizar el siguiente trabajo en una sala más bien sombreada. Mantener las células en hielo hasta la medición.<ol>
<li>Transferir las muestras a tubos adecuados para mediciones de citometría de flujo.</li>
		<li>Examinar la viabilidad celular y la eficiencia de absorción de miR utilizando un citómetro de flujo. Medir por lo menos 2 x 104 eventos. Utilice la estrategia bloquea representada en la figura 4. Nota: Utilice las células untransfected como control negativo para arreglar la compuerta el uso de las células positivas Cy3 y calcular la muerte celular causada por transfección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las células madre adultas están en foco para el tratamiento de varias enfermedades degenerativas. En particular, ósea la médula (BM)-derivado de las células madre, incluyendo las células madre hematopoyéticas (HSCs) y MSCs, están bajo intensa investigación clínica47. Sin embargo, BM la cosecha es un procedimiento invasivo que causa dolor en el sitio de la donación y puede conducir a eventos adversos48. Recientemente, el tejido dental postnatal ha emergido como una nueva y a...

El folículo dental humano es un flojo Tejido fino conectivo de derivados de ectomesenchymally que rodea el diente en desarrollo1,2. Al lado de su función de coordinar la osteoclastogénesis y osteogénesis para el proceso de erupción del diente, este tejido presenta células madre y progenitoras especialmente para el desarrollo del periodonto3,4,5. Por lo tanto, el folículo dental se considera como una fuente alternativa para cosechar las células madre adultas humanas6,7.
Varios estudios demostraron que las células madre del folículo dental humana (hDFSCs) son capaces de diferenciarse en el linaje periodontal incluyendo osteoblastos, fibroblastos del ligamento y cementoblastos8,9,10 . Además, estas células fueron demostradas para que coincida con todas las características de las células estromales mesenquimales (MSCs) incluyendo la capacidad de auto renovación, adhesión plástica, expresión de marcadores de superficie específicos (por ejemplo,, CD73, CD90, CD105) así como osteogénico, adipogenic y condrogénica diferenciación potencial11,12,13. Otros estudios también revelaron un potencial de diferenciación de los nervios de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Debido a sus prometedoras propiedades y fácil acceso, hDFSCs se convirtió recientemente relevantes para tejido ingeniería19,20,21. Los primeros estudios se concentraron en el potencial de DFSCs para regenerar hueso periodontal y dientes raíces19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde el conocimiento de la capacidad neurogénica de hDFSCs, su aplicación como tratamiento potencial para las enfermedades neurodegenerativas ha sido investigado31,32,33. HDFSCs también han cobrado importancia con respecto a la regeneración de otros tejidos (p. ej., epitelio corneal)34,35. El potencial terapéutico de hDFSC no se basa sólo en su potencial de diferenciación directa sino también en su actividad paracrina. Recientemente, hDFSCs se han demostrado para secretar una gran cantidad de factores bioactivos, como las metaloproteinasas de matriz (MMPs), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF) y el crecimiento de hepatocito factor (HGF), que desempeñan un papel crucial de la angiogénesis, inmunomodulación, remodelación de la matriz extra celular y procesos reparativos36.
Sin embargo, amplia traducción clínica de la terapia de células madre se deteriora aún por varios desafíos, como la muerte masiva de células iniciales y células beneficioso bajo efectos37,38. Ingeniería genética proporciona una estrategia prometedora para abordar estos desafíos y por lo tanto, puede realzar grandemente la eficacia terapéutica de células madre38,39,40. Para la manipulación de celda transitoria, microRNAs (miRs) son los candidatos idóneos, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de las células madre sin el peligro de genoma estable integración41,42, 43. hasta la fecha, se han identificado varios miRs beneficiosos promover la proliferación de la célula de vástago, supervivencia, homing, actividad paracrina, así como su diferenciación en varios linajes44. Por ejemplo, miR-133a ingeniería MSCs mostraron un aumento de la supervivencia y el engraftment en corazones de rata infartado, dando por resultado una función cardíaca mejorada en comparación con MSCs45. Además, miR-146a MSCs expresando mostraron secretan mayores cantidades de VEGF, que a su vez condujo a una mayor eficacia terapéutica en el tejido isquémico46.
Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la extracción selectiva y la ingeniería genética de hDFSCs. Para ello, describimos la digestión enzimática y cosecha de los folículos dentales humanas, así como el aislamiento posterior de hDFSCs. Para caracterizar las células aisladas, instrucciones importantes para la verificación de propiedades MSC se han incluido siguiendo las directrices de la sociedad internacional de terapia celular13. Además, ofrecemos una descripción detallada para la generación de hDFSCs miR-modificado por aplicación de una estrategia de transfección basada en lípidos catiónicos y la evaluación de la eficiencia de transfección y citotoxicidad.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti CD105 humano de ratón: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clon SN6, monoclonal</td></tr><tr><td>IgG1 de ratón Anticuerpo de control negativo: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>APC Anticuerpo anti-CD29 de ratón</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Clon MAR4, monoclonal</td></tr><tr><td>APC Mouse IgG1, &kappa; Anticuerpo de control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>clon MOPC-21, monoclonal</td></tr> PE <tr><td>Ratón Anti-humano Anticuerpo CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>clon AD2, monoclonal</td></tr><tr><td>PE Ratón IgG1, &kappa; Anticuerpo de control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>clon MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Anticuerpo CD117 de ratón BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td>339217 Clon 104D2, monoclonal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 IgG1 de ratón monoclonal, &kappa; Anticuerpo de control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>557872 clon MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Anticuerpo CD44 de ratón antihumano</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>clon G44-26, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 IgG2b de ratón, &kappa; Anticuerpo de control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clon 27-35, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Ratón Anti-humano CD90&nbsp; Anticuerpo</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Clon 5E10, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 IgG1 de ratón, &kappa; Anticuerpo de control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Clon MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>V500 Anticuerpo CD45 de ratón BD</td><td>Biosciences</td><td>560777</td><td>Clon HI30, monoclonal</td></tr><tr><td>V500 IgG1 de ratón, &kappa; Anticuerpo de control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>560787 Clon X40, reactivo de bloqueo monoclonal</td></tr><tr><td>FcR, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0.5M, pH 8.0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0.22 &micro; m, radioesterilizado, polietersulfona</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de identificación funcional de células madre mesenquimales humanas</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descontaminación de RNasa; Solución de descontaminación de ARNasa RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Precursor marcado con Cy3 miR; Control negativo de Pre-miR marcado con colorante Cy3 #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Control negativo de precursores de miARN Pre-miR #1</td><td>Reactivo</td><td></td> de <td></td></tr><tr><td>transfección a base de lípidos catiónicos de Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol; Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Medio sérico reducido; Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>policlonal</td></tr><tr><td>Medio de montaje; Fluoroshield con</td><td>medio de montaje para histología</td>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td></tr><tr><td>Microscopio confocal ELYRA PS.1 LSM 780</td><td>Citómetro de flujo Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ZEN2011</td> Solución <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%)</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>en PBS, sin: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>Colorante reactivo amina; VIVOS/MUERTOS&comercio; Kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano reparable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7,4; w/o: Ca y Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>medio basal; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filtro, filtro de jeringa Sterifix 0.2 y micro; m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; mL tubo de centrífuga cónico</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo de centrífuga cónico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833.910.002</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833.911.002</td><td></td></tr><tr><td>Medio de congelación, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Criotubos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Solución azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>Cámara de recuento</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestésico local, xilocitina (clorhidrato de lidocaína) 2% con epinefrina (adrenalina) 0,001%</td><td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución de NaCl</td><td>Braun</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

aislamiento, caracterización y microrna basado en la modificación genética de las células madre del folículo dental humano

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Hasta la fecha, varios tipos de células madre en diferentes etapas de desarrollo están en el foco para el tratamiento de enfermedades degenerativas. Sin embargo, ciertos aspectos, como la muerte celular masiva inicial y bajos efectos terapéuticos, problemas de su traducción clínica amplia. Ingeniería genética de células antes del trasplante surgió como un método prometedor para optimizar los efectos terapéuticos de células madre. Sin embargo, todavía carecen de sistemas de entrega de genes seguros y eficientes. Por lo tanto, el desarrollo de métodos adecuados puede proporcionar un enfoque para resolver los retos actuales en terapias basadas en células madre.
El presente Protocolo describe la extracción y caracterización de células madre de folículo dental humana (hDFSCs) así como su modificación genética no-virales. El folículo dental postnatal dio a conocer como una fuente prometedora y de fácil acceso para la recolección de las células madre adultas multipotentes que poseen potencial de proliferación alta. El procedimiento de aislamiento descrito presenta un método simple y confiable para cosechar hDFSCs de cordales. Este protocolo incluye también métodos para definir las características de células madre de células aisladas. Para la ingeniería genética de hDFSCs, una estrategia optimizada transfección catiónico base de lípidos se presenta introducción de microARN altamente eficiente que permite sin producir efectos citotóxicos. MicroRNAs son candidatos adecuados para la manipulación de celda transitoria, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de células madre sin el peligro de la integración del genoma estable. Así, este protocolo representa un procedimiento seguro y eficaz para la ingeniería de hDFSCs que puede llegar a ser importante para la optimización de su eficacia terapéutica.

Aquí, presentamos una instrucción detallada aislamiento cosecha hDFSCs del tejido del folículo dental humana. Por el fácil acceso del folículo dental durante la cirugía de rutina, es una fuente prometedora para la extracción de células madre adultas.
El hDFSCs aislado demostró todas las características descritas para la definición de MSCs13. De hecho, las células eran de plástico adherente debajo se descr...

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como donde las células madre de un folículo dental humano podrían ser genéticamente diseñadas para mejorar sus propiedades terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que las células madre pueden ser modificadas por la introducción del microRNA sin el peligro de una integración del genoma estable. Comience el procedimiento para la digestión enzimática de los dos folículos, precalentándolo a temperatura ambiente, células madre del folículo dental humano o medio de cultivo hDFSC y solución PBSPSG.Descongelar una alícuota cada una de las soluciones de stock de Colágenonase tipo I y Dispase II. Preparar una solución de digestión añadiendo 500 microlitros de la solución de stock de colagenasa tipo I y 500 microlitros de la solución de stock Dispase II a 4 mililitros de basal Medium que contienen un 1% de agente antibiótico. Para evitar la contaminación del sitio durante el folículo dental humano, los tampones de lavado de células madre y los medios de cultivo utilizados deben contener agentes antibiótico.Coloque un folículo dental extraído en un plato estéril de Petri. Añadir 10 milil

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los...

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

El continuo crecimiento de los incisivos ratón proporciona un modelo para el estudio de la renovación de los tejidos dentales a partir de células madre epiteliales dentales (DESCs). Un sistema sólido para la obtención de manera consistente y confiable de estas células de la incisivo y expandir in vitro se informó aquí.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Hemos establecido una técnica para el aislamiento, la caracterización fenotípica y análisis funcional de células inmunes de encía murino.

El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

Un modelo ideal para estudiar la biología de las células madre adultas es el folículo piloso del ratón. En este trabajo se presenta un protocolo para aislar diferentes poblaciones de células madre de folículos pilosos y queratinocitos epidérmicos, empleando la digestión enzimática de la piel dorsal del ratón seguida de un análisis FACS.

El aislamiento de células madre del folículo piloso y queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratón

Aquí presentamos un protocolo para aislamiento de células de la pulpa Dental humana y propagación con el fin de evaluar la expresión de la proteína del prión durante el proceso de diferenciación neuronal.

Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

El folículo dental contiene una población epitelial y células mesenquimales. La población epitelial se seleccionó de la población heterogénea de células del folículo dental proporcionando un medio de cultivo distinto. Las células epiteliales sobrevivieron y formaron colonias en un medio libre de suero.

Aislamiento de células epiteliales del folículo dental humano

Este artículo proporciona una guía paso a paso para establecer un cultivo primario de células madre de pulpas dentales utilizando el método de cultivo de explantes y la caracterización de estas células basada en las directrices del ICSCRT. Las células aisladas por este protocolo pueden considerarse como células madre mesenquimales para aplicaciones posteriores.

Cultivo primario de células madre de pulpa dental

Este protocolo enfatiza la extracción, el cultivo y la preservación de células madre multipotentes de la pulpa dental a través de la digestión enzimática. Además, demuestra su potencial para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos, lo que pone de manifiesto la importancia de la precisión y la consistencia en el proceso.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de pulpa dental a partir de dientes humanos deciduos y permanentes

El aislamiento delas MSCsBAMBI altasen MFGE8, uno de los tres subgrupos principales que constituyen las UC-MSCs humanas heterogéneas, es útil para comprender completamente las características y funciones de este subtipo para su futura aplicación para mejorar la eficacia clínica en enfermedades específicas. Aquí, presentamos un método para clasificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical BAMBIhumano con altocontenido de MFGE8

Aprende a modificar genéticamente células madre del folículo dental humano mediante introducción de microRNA sin integración estable del genoma. Este protocolo mejora las propiedades terapéuticas para aplicaciones en medicina regenerativa.

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

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