Name: Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprende a detectar variantes de empalme y mutaciones puntuales en ARN corto mediante hibridación in situ con alta sensibilidad a nivel de célula única en tejidos de neurociencia y oncología.

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Las muestras de tumores humanos utilizadas en este estudio fueron deidentified y adquiridas de fuentes comerciales con arreglo a las normas éticas locales para la investigación en humanos.
1. muestra, equipo y preparación de los reactivos
<ol><li>
Preparación de la muestra FFPE
	<ol>
<li>Tejidos<ol>
<li>Inmediatamente después de la disección, fijar el tejido (cortado en bloques de 3 – 4 mm de espesor) en tampón neutro formalina al 10% (NBF) de 16-32 h a temperatura ambiente (RT). Nota: Tiempo de fijación varía dependiendo del tamaño y tipo de tejido.</li>
			<li>Lavar la muestra con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y deshidratar mediante una serie estándar de etanol (EtOH) (70% EtOH durante 30 – 60 min, 80% EtOH durante 30-60 min., 90% EtOH durante 30 – 60 min, 95% EtOH durante 30 – 60 min, 3 x 100% de EtOH 30-60 min) seguido de xileno.</li>
			<li>Embeber la muestra en parafina utilizando procedimientos estándar6 y cortar los bloques de parafina según sea necesario para eliminar la parafina sobrante. Nota: Tamaño de bloque variará dependiendo del tamaño de la muestra de tejido, pero un tamaño típico es de 0.75 x 0.75 pulgadas2 o más pequeño.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Líneas celulares<ol>
<li>Recoger y pelotilla células según los métodos recomendados para la línea celular específica.</li>
			<li>Fijar las células en formol 10% a temperatura ambiente por 24 h en un rotador.</li>
			<li>Preparar las células como una pelotilla en gel procesamiento de precalentado (por ej., Histogel). Permite la pelotilla a solidificar colocando el precipitado de células de gel en un trozo de parafilm en hielo y dejar reposar 2-3 min sumerja el precipitado de células de gel en PBS 1 x.</li>
			<li>Deshidratar e incrustar los pellets de células como se describe en el paso 1.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sección Preparación<ol>
<li>Cortar las células del tejido/incrustadas en 5 secciones de 1 μm ± usando un micrótomo, Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio adhesivo electrostático y les deje secar al aire durante la noche a TA. Nota: Las diapositivas pueden almacenarse a temperatura ambiente bajo desecación hasta 3 meses.</li>
			<li>Colocar los portaobjetos en una parrilla y hornee los portaobjetos de tejido montado en un horno de aire circulante a 60 ° C por 1 h antes de realizar el ensayo. Nota: Utilice las diapositivas inmediatamente o almacenar a temperatura ambiente con desecantes hasta 1 semana. Un almacenamiento prolongado puede resultar en la degradación del RNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de equipo
	<ol>
<li>Programar el horno de hibridación a 40 ° C. Completamente moje el papel humidificación quitar cualquier residual de dH2O. Inserte el papel en la bandeja de control de humedad e Introduzca la bandeja en el horno de hibridación se precaliente durante al menos 30 minutos antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del reactivo
	<ol>
<li>Llenar dos claro platos agente con 200 mL de xileno y llenar dos platos tinción con 200 mL de 100% EtOH, que se utilizará para parafina secciones.</li>
		<li>Preparar 200 mL de reactivo de recuperación 1 x disponible en el mercado objetivo mediante la adición de 180 mL de dH2O 20 ml de reactivo de recuperación de destino de x 10. Colocar dos soportes de diapositivas en un vapor. Llenar un sostenedor de la diapositiva con 200 mL de 1 x reactivo de recuperación de destino y llenar el otro soporte de diapositiva con 200 mL de dH2calor o ambas soluciones a hervir con el vapor.</li>
		<li>Precalentado de tampón de lavado x 50 caliente a 40 ° C durante 10-20 minutos preparar 3 L 1 x de tampón de lavado diluyendo 60 mL de tampón de lavado x 50 con 2,94 L de dH2O.</li>
		<li>En una campana de humos, preparar hematoxilina de Gill 50% solución de contratinción añadiendo 100 mL de hematoxilina de Gill y 100 mL de dH2O. En la capilla del humo, preparar el reactivo de azulado (agua de amoníaco 0,02% (p/v)) agregando 1,43 mL de hidróxido de amonio 28-30% a 250 mL de dH2O.</li>
		<li>Precaliente sondas blanco a 40 ° C durante 10 minutos antes de la hibridación de la sonda y traer los reactivos de amplificación (AMP 0-6) a RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ARN In Situ ensayo de hibridación
<ol><li>
Parafina y deshidratación
	<ol>
<li>Después de la cocción tal como se describe en el paso 1.1.3.2 (opcional punto 1), Desparafinizar las secciones en xileno durante 5 minutos con agitación. Desparafinizar otra vez en xileno fresco por 5 min deshidratar en 100% EtOH por 2 min con agitación y repita otra vez en fresco 100% EtOH por 2 min.</li>
		<li>Aire seco el portaobjetos durante 5 minutos a 60 ° C en un horno de aire circulante o a temperatura ambiente hasta que estén completamente secos (parada opcional punto 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pretratamientos de la muestra
	<ol>
<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de peróxido de hidrógeno listo para su uso por 10 min a temperatura ambiente para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Decantar la solución de las correderas y enjuague dos veces con dH2O.</li>
		<li>Incubar las secciones con 200 mL del reactivo de recuperación objetivo para 15-30 min a 100 ° C en un vapor. Nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de tejido. En este protocolo, recuperación del destino se realizó durante 15 min para muestras tumorales y gránulos de la célula.</li>
		<li>Decantar la solución de las diapositivas, enjuagar dos veces con dH2O, la inmersión en un 100% EtOH por 3 minutos y seca las diapositivas a 60 ° C en un horno de aire circulante o a temperatura ambiente hasta totalmente seco.</li>
		<li>Dibujar una barrera hidrofóbica alrededor de la sección utilizando un lápiz hidrofóbico, aproximadamente 0.75 x 0.75 pulgadas2. Nota: No se recomienda establecer una barrera más pequeña. Para secciones más grandes, una barrera más grande tendrá que ser dibujado.</li>
		<li>Deje que la barrera secar completamente durante 1 min, o dejar toda la noche a temperatura ambiente (punto opcional 3).</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en un porta diapositivas y coloque el soporte de la diapositiva en la bandeja de control de humedad. Añadir ~ 4 gotas de proteasa III a cada diapositiva e Incube por 15-30 min a 40 ° C en el horno de hibridación para la digestión de proteínas. Nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de tejido. En este protocolo, digestión de proteasa fue realizada por 30 minutos para las muestras del tumor y 15 min para las pelotillas de la célula.</li>
		<li>Decantar la solución de las correderas y enjuague dos veces con dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonda de hibridación
	<ol>
<li>Añadir ~ 4 gotas de la solución de sonda listo para su uso adecuado para cubrir toda la sección. Si usando secciones más grandes, añadir ~ 5-6 gotas.</li>
		<li>Hibridar las sondas por 2 h a 40 ° C en el horno de hibridación. Decantar la solución de las correderas y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado en este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificación de la señal
	<ol>
<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de AMP 0 por diapositiva a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado en este paso.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 1 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 2 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 3 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 4 amperios por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 5 AMP por porta a temperatura ambiente durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 6 AMP por porta a temperatura ambiente por 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de señal
	<ol>
<li>Preparar el tinte rojo rápido de la solución. Para una diapositiva con una barrera de2 de 0.75 x 0.75 pulgadas, añadir 2 μL de colorante rápido rojo B a 120 μL de rápido rojo-A en un tubo y mezcle bien. Nota: Dependiendo del tamaño de la barrera hidrofóbica y el número de diapositivas, volúmenes de la solución de trabajo Fast Red variará.</li>
		<li>Decantar el exceso de líquido de las diapositivas y añadir el colorante Fast Red solución a las diapositivas. Incube los portaobjetos durante 10 min a temperatura ambiente en la bandeja con una cubierta para evitar la exposición a la luz. Nota: Use el Fast Red solución dentro de 5 minutos de preparación y no lo exponga a luz solar directa o luz ultravioleta.</li>
		<li>Decantar la solución Fast Red y enjuague los portaobjetos dos veces con agua del grifo. Vuelva a colocar los portaobjetos en una parrilla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contratinción
	<ol>
<li>Contratinción las secciones de tejido con solución de hematoxilina de Gill 50% por 2 min en RT. Wash los portaobjetos con agua y repetir este proceso varias veces hasta que las diapositivas son claras, mientras que las secciones permanecen púrpura. Sumerja los portaobjetos en agua de amoníaco 0,02% para azulado (dip 2 a 3 veces). Reemplace el agua de amoníaco con agua del grifo y lavar las diapositivas 3 a 5 veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deslice el montaje
	<ol>
<li>Seco el portaobjetos en un horno de aire circulante a 60 ° C durante 15 minutos o a temperatura ambiente hasta totalmente seco. Coloque 1-2 gotas de reactivo de montaje en cada cubreobjetos portaobjetos y coloque sobre cada sección. Evitar cualquier captura de burbujas de aire. Secar los portaobjetos durante al menos 5 minutos. Nota: El substrato de Fast Red es sensible al alcohol. Deshidratar el portaobjetos en el alcohol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Visualización
	<ol>
<li>Observe los portaobjetos en un microscopio de campo luminoso estándar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bolha, L., Ravnik-Glavač, M., Glavač, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs%3A+Biogenesis%2C+Function%2C+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Genomics%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353(2017).</li>
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<li>Baker, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+RNA-based+in+situ+mutation+detection+delineates+colorectal+cancer+subclonal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution.</a> Nature Communications. 8 (1), 1998(2017).</li>
</ol>

Todos los autores son empleados por la célula de Advanced Diagnostics, Inc.

En este informe, el protocolo de ensayo novela de ISH y sus aplicaciones fueron discutidos en detalle. El ensayo permite la visualización directa de uniones exón, short blanco y altamente homólogas secuencias y mutaciones puntuales en el contexto del tejido. El ensayo se basa en la tecnología de RNAscope5 y por lo tanto es capaz de detectar la molécula sola. Sin embargo, debido a un sistema de amplificación avanzados, la señal puede ser detectada con sondas que contienen tan poco como un par de doble-Z o con una longitud de plantilla de destino de sólo 50 nucleótidos. Porque las puntas de prueba pueden ser tan cortos como un único doble-Z de longitud, esto permite la detección de uniones exón, poco objetivo y altamente homólogas secuencias y mutaciones de punto (tabla 1).
Para el desempeño exitoso de la prueba, hay varias recomendaciones técnicas. En primer lugar, se deben fijar los tejidos en fresco 10% formol tamponado neutro (NBF) a temperatura ambiente durante 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) o overfixation (> 32 h) afectará el rendimiento de la prueba y puede requerir optimización adicional. En segundo lugar, para asegurar un control óptimo de temperatura y humedad, que son necesarios para la amplificación de hibridación y la señal de sonda robusta, la diapositiva procesamiento horno sistema e hibridación se debe utilizar para pasos de protocolo 2.3 a 5 (proteasa tratamiento previo, punta de prueba hibridación, amplificación de la señal y detección de señales). Búferes residual de tercera, el exceso deben ser decantados correctamente antes de cada paso en el protocolo (pero no tanto para que las secciones de tejido se sequen). Si el portaobjetos se sequen, desarrollará importante señal no específica. En cuarto lugar, dependiendo del tipo de tejido, optimización tratamiento previo puede ser necesario. Usando la proteasa mal o realizar subóptima durante un tiempo puede resultar en bajo - o sobre - digestion y afectará negativamente a la señal. Por último, es importante para que funcione siempre controles positivos y negativos con las puntas de prueba. Sondas de control negativo aseguran de que no hay ninguna señal de fondo, sondas de control positivo garantizar que el ensayo se ha realizado correctamente y que la calidad del RNA de la muestra es óptima para interpretar los resultados de la sonda de prueba. Si no hay señal con la sonda de control positivo, entonces es probable que la calidad del RNA de la muestra subóptima y una señal no puede ser vista con la sonda de prueba.
Además el análisis manual, la capacidad para realizar el ensayo en teñidores automáticos también fue demostrada (figura 6). Este ensayo automatizado de ISH rinde un alto cociente signal-to-noise y es aplicable para las mismas aplicaciones como se muestra en la tabla 1; sin embargo, beneficios de un análisis automatizado incluyen la estandarización de las condiciones analíticas, minimización de la variabilidad inter-usuario y tiempo de práctica y permiso para el cribado de alto rendimiento de las muestras de tejido de forma fiable.
Inmunohistoquímica (IHQ) y qRT-PCR permiten la detección de variantes de empalme (particularmente EGFRvIII), en las muestras clínicas FFPE, estas técnicas pueden carecer de la especificidad necesaria y no ofrece una visión en la resolución espacial del empalme expresión variante, respectivamente11,12. Una ventaja clave del análisis de este protocolo es su visualización altamente sensible y específico de uniones de empalme preservando el contexto morfológico del tejido. Aquí, capacidad de análisis objetivo precisamente uniones exón único para diversas variantes de empalme, incluyendo EGFRvIII y METΔ14, fue demostrada (figuras 3 y 6). Además, el ensayo se ha demostrado para detectar la variante de empalme AR V7 en el cáncer de próstata, múltiples isoformas de ErbB4 en el cerebro y la confirmación de octavos de final de la circular Cdr1as de ARN en el ratón cerebro3,13,14.
Detección de secuencia destino corto por este ensayo ISH permite visualización de secuencias de ARN tan cortas como 50 nucleótidos de longitud, según lo demostrado por la detección de secuencias CDR3 derivado de células Jurkat (figura 3). El ensayo también puede detectar secuencias de genes son altamente homólogas a otros miembros de la familia o especie, como se muestra por Revêchon et al., que utiliza el ensayo corto blanco para detectar progerina humana expresada en ratón subcutáneo tejido adiposo blanco15. Además, ARN nucleolar pequeño (snoRNA) edición de genes mediada por CRISPR y microRNA precursor pueden ser detectado en situ con el ensayo corto destino. Más recientemente, Fu et al. combinado este ensayo ISH con IHC para identificar células precisa en la retina expresando el pre-miRNA mir125b16.
Mutación de perfiles en los tumores es fundamental para estudiar la progresión de tumores y para el desarrollo de terapias dirigidas. Mientras que la mutación de perfiles pueden lograrse mediante secuenciación de alto rendimiento, esta tecnología no puede enfrentar completamente intratumoral heterogeneidad o enlace de alteraciones genéticas con morfología celular17,18. La detección de mutaciones puntuales mediante este ensayo ISH permite la distinción de secuencias de RNA Diana con una resolución de la solo-base, como validada por la detección de variaciones de un solo nucleótido L858R de EGFR y KRAS G12A en líneas celulares (figura 5). Por otra parte, Baker et al. usaron el ensayo de mutación de punto a múltiples mutaciones en los oncogenes PIK3CA, BRAF y KRAS en cáncer colorrectal18. Fueron capaces de identificar y mapa espacial raras subclones mutantes de células del tumor, en última instancia mostrando cómo contribuyen a la heterogeneidad intra-tumor.
En Resumen, se ha desarrollado un ensayo de ARN ISH especializado. Esta metodología permite la detección de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en situ. Es sensible, específico, cuantificable y adaptable desempeño por métodos manuales y en teñidores automáticos.

Tecnologías de alto rendimiento transcriptómicos como microarrays y la secuenciación de próxima generación RNA (RNAseq) han mejorado exponencialmente el descubrimiento de biomarcadores de RNA con valor clínico diagnóstico, pronóstico y predictivo de varias enfermedades incluyendo cáncer1,2. Para avanzar en el uso de estos biomarcadores en la medicina de precisión, hay una alta necesidad de tecnologías estandarizadas y robustas que puede medir biomarcadores de RNA en el contexto del tejido de las muestras clínicas. Mientras que ampliamente establecido ensayos de rutina y atar como RNAseq y RT-PCR cuantitativa permiten mediciones de expresión génica altamente sensible, la homogeneización del tejido requerido y el aislamiento de RNA implican la pérdida de en vivo especificidad de tipo celular y información morfológica3. Metodologías de detección convencional en situ RNA carecen de la sensibilidad y especificidad necesaria para medir fiablemente biomarcadores RNA raras o baja expresión dentro del contexto de tejido4.
Un ensayo comercial en situ hibridación (ISH) (e.g., el ensayo de RNAscope) es una tecnología que ha abordado estos retos y también permite la visualización altamente sensible y específica de solo moléculas de ARN superiores a 300 nucleótidos en el contexto morfológico del tejido. Este tipo de análisis utiliza un diseño de la sonda de oligonucleótidos única de aproximadamente 6 – 20 pares de doble Z sonda combinada con una amplificación de señal avanzada basada en hibridación5.
Este estudio describe un análisis especializado de ARN ISH, BaseScope, complementaria a la tecnología comercial previamente diseñada que permite detectar secuencias de RNA Diana tan cortos como 50 nucleótidos en la resolución de un solo nucleótido. Este ensayo aborda las intrincadas complejidades del transcriptoma y es aplicable para la detección exacta de uniones exón, secuencias diana corta y mutaciones puntuales en el contexto del tejido (tabla 1) utilizando una sonda doble Z. Este informe demuestra el protocolo completo y su uso en la detección de variantes de empalme, secuencias CDR3 de clones de células T del receptor, y mutaciones del solo-nucleótido en FFPE líneas y tejidos de tumor de la célula.

<table><tbody><tr><td>Horno HybEZ (110 o 220 VCA) u Horno HybEZ II (110 o 220V)</td><td>ACD</td><td>310010 o 310013 (HybEZ&trade;), 321710 o 321720 (HybEZ&trade; II)</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de control de humedad HybEZ (con tapa)</td><td>Estante deslizante ACD</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>ACD EZ-Batch (capacidad para 20 portaobjetos) 1 estante 310017</td> Papel humidificador <td>ACD</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Bolígrafo</td><td></td> de barrera <td>hidrofóbica ACD</td> 310015 <td></td></tr><tr><td>ImmEdge (obligatorio)&nbsp;</td><td>Laboratorio de Vectores&nbsp;</td><td>Portaobjetos H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus (obligatorio)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina tamponada neutra (NBF)&nbsp;</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Branquia' s Hematoxilina I&nbsp;</td><td>Maestría Científica Americana/MLS&</td><td>nbsp; HXGHE1LT</td><td>principal proveedor de laboratorio de MLS en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Xileno&nbsp;</td><td>Fisher Scientific/MLS</td><td>X3P-1GAL</td><td>MLS Proveedor principal de laboratorios en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Bastidor deslizante vertical Tissue-Tek 24 &nbsp;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>LWSRA24</td><td>principal proveedor de laboratorio de MLS en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Placas de tinción Tissue-Tek&nbsp;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>LWT4457EA</td><td>principal proveedor de laboratorio de MLS en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Platos de agente limpiador Tissue-Tek, resistentes al xileno&nbsp;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>LWT4456EA</td><td>principal proveedor de laboratorio de MLS en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>100% alcohol (EtOH)&nbsp;</td><td>American Master Tech Scientific/MLS</td><td>ALREACS</td><td>MLS Proveedor principal de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Medio de montaje permanente VectaMount (obligatorio)</td><td>Vector Labs&nbsp;</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific/MLS&nbsp;</td><td>12-545-F</td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio, 28&ndash; 30%</td><td>Sigma-Aldrich/MLS</td><td>320145-500mL</td><td>MLS Proveedor principal de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Carboy (>3L)</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>el vaporizador Oster modelo 5712, el vaporizador HS3000 negro y decker, o el vaporizador Braun Multiquick FS 20/</td><td></td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro digital</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Proveedor principal de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Baño de agua o incubadora, capaz de mantener la temperatura a 40 +/&ndash; 1 &deg; C</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Pipettores y puntas, 1&ndash; 1.000 &mu; l</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Tubos (varios tamaños)</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Campana extractora</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Cilindro graduado</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Importante proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Toalla de papel o papel absorbente</td><td>MLS</td><td>/</td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Microscopio y accesorios</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Horno de secado, capaz de mantener la temperatura a 60 +/&ndash; 1 &deg; C</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>MLS/</td><td></td><td>MLS Principal proveedor de laboratorio en América del Norte. Para otras regiones, consulte los números de catálogo con su proveedor de laboratorio local.</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Fisher Scientific/MLS</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos BaseScope - RED</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>322900</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701701</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701711</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701721</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701731</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-MET-E14E15</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701811</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-MET-E13E15</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>701801</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-KRAS-G12A</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>705491</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>705531</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-L858R</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>705451</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td><td>Diagnóstico Celular Avanzado</td><td>705461</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Paquete de Sondas de Control Diagnóstico Celular Avanzado Humano</td><td></td><td>322975</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de arn in situ hibridación

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Porque medicina de precisión depende de la precisa detección de biomarcadores, existe una creciente necesidad de tecnologías estandarizadas y robustas que miden RNA biomarcadores en situ en las muestras clínicas. Mientras los ensayos de rutina y atar como RNAseq y RT-PCR cuantitativa permiten mediciones de expresión génica altamente sensibles, también requieren extracción de RNA y así evitar análisis valiosa expresión dentro del contexto morfológico del tejido. El ensayo de hibridación (ISH) en situ descrito aquí puede detectar secuencias de RNA Diana tan cortos como 50 nucleótidos en resolución del solo-nucleótido y en el nivel unicelular. Este ensayo es complementario para el análisis comercial previamente desarrollado y permite la detección sensible y específica en situ de variantes de empalme, metas cortas y mutaciones puntuales dentro del tejido. En este protocolo, las puntas de prueba fueron diseñadas para uniones exón único para dos variantes de empalme clínicamente importantes, EGFRvIII y METΔ14 de destino. La detección de secuencias diana pocos fue demostrada por la detección específica de secuencias CDR3 del T-cell los receptores α y β en la línea de células Jurkat T. También se muestra es la utilidad de este análisis de la ISH para la distinción de secuencias de ARN Diana en la resolución del solo-nucleótido (mutaciones puntuales) a través de la visualización de L858R de EGFR y KRAS G12A variaciones del solo-nucleótido en líneas celulares usando tinción automatizada plataformas. En Resumen, el protocolo muestra un ensayo de ARN ISH especializado que permite la detección de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en situ para funcionamiento manual y en teñidores automáticos.

En situ hibridación análisis flujo de trabajo: El flujo de trabajo se representa en la figura 1 y consiste en cuatro partes: permeabilización de células o tejidos con destino recuperación y soluciones de la proteasa, hibridación de las sondas en el destino del RNA, señal de amplificación y la visualización de la señal. La señal también puede ser cuantificada usando sistemas de software de imagen digital o de manera semicuantitativa basado en el número de puntos por la célula. El procedimiento manual que se describe en la figura 2 también ha sido totalmente automática en sistemas comerciales de tinción automática.
Representante de tinción para la detección de empalme del exón (EGFRvIII empalme variante): EGFRvIII es una variante del receptor del factor de crecimiento epidérmico que surge de una canceladura genomic en el marco de los exones 2 a 7, constitutivamente activa señalización oncogénica7 . El análisis fue utilizado para identificar estado de EGFRvIII en muestras tumorales FFPE glioblastoma (GBM). Sondas de doble Z solo fueron diseñadas para abarcar las uniones exón con el fin de detectar cualquier peso, mutante, o ambas transcripciones (Figura 3A). Las sondas de EGFR WT abarcan a las uniones de exones 1 y 2 (E1/E2) o de los exones 7 y 8 (E7/E8), mientras que las sondas específicas de la EGFRvIII abarcan al empalme de los exones 1 y 8 (E1/E8). Una punta de prueba común que se extiende por la Unión de los exones 8 y 9 (E8/E9) también fue utilizado para detectar EGFR total (WT y EGFRvIII transcripciones). Todas las sondas entonces fueron utilizadas para determinar el estado EGFR en muestras de FFPE GBM. Los dos ejemplos representativos que se muestra en la figura 3B se tomaron de un estudio más amplio. Estado EGFR fue confirmada por un método independiente, RT-PCR. Ambas sondas WT detectan señal en ambas muestras, lo que indica que las dos muestras expresan EGFR WT (figura 3B). Sin embargo, la sonda mutante mostró sólo detección de señal en la EGFRvIII + muestra, confirmando que esta muestra es de hecho positiva para la variante de EGFRvIII (figura 3B, paneles de la izquierda). Por el contrario, la sonda mutante no detecta señal de la EGFRvIII-muestra (figura 3B, paneles de la derecha). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el análisis de empalme del exón puede identificar EGFRvIII estado en muestras tumorales de GBM FFPE.
Representante de coloración para metas corto: Los CDR3, o región determinante complementario 3, es un dominio altamente variable en receptores de célula T. Por lo general, la secuencia de CDR3 son bastante corto; por ejemplo, las secuencias CDR3 α y β de la línea de células Jurkat T son 51 y 48 nucleótidos de longitud, respectivamente (Figura 4A). Para identificar las secuencias específicas de CDR expresadas en células Jurkat, sondas antisentidas para CDR3 se generaron α y β que se expresan en la línea de células Jurkat T, además de sentido sondas para CDR3 α y β para servir como control negativo sondas. Todas las sondas entonces fueron probadas en células Jurkat FFPE-preparado con el ensayo. Se observó coloración robusta con sondas anti-sentido para ambos CDR3 α y β en las células de Jurkat, mientras que las sondas sentido no detecta poca a ninguna señal (Figura 4B). Estos resultados demuestran la capacidad de discernir entre secuencias de CDR altamente variable, pero corto para los clones de células T del receptor del ensayo corto blanco.
Representante para punto de mutación L858R de EGFR: Puntas de prueba de mutación de punto fueron desarrollados para detectar variaciones de un solo nucleótido y pequeñas inserciones o deleciones (INDELs) dentro del tumor. Figura 5A se muestra la capacidad para en situ detección de la mutación de punto L858R de EGFR (2573T &gt; G). Dos puntas de prueba fueron diseñados: uno para detectar la L858R transformado secuencia EGFR y otro para detectar la secuencia de EGFR L858 WT. Ambas sondas fueron probados en dos líneas celulares FFPE-preparado: H2229, que sólo expresa EGFR L858 WT; y H1975, que es heterozigótico para la mutación L858R de EGFR. La sonda mutante L858R detectado señal sólo en la línea celular de H1975 pero no en la línea celular de H2229. Sin embargo, la sonda WT había detectado señal en ambas líneas celulares. Asimismo, figura 5B visualiza en situ detección de la mutación de punto G12A KRAS (35 G &gt; C). Dos puntas de prueba fueron diseñados para detectar las secuencias KRAS G12A MT y KRAS WT de G12 y entonces probados en la línea celular de HuT78 (que sólo expresa KRAS WT de G12) y la línea de celular SW116 (que es heterozigótica para la mutación KRAS G12A). Mientras que la punta de prueba de KRAS WT de G12 detecta señal en ambas líneas celulares, la punta de prueba de KRAS G12A solo detectó señal en la línea de celular SW116. Tomados en conjunto, estos datos demuestran la capacidad técnica de la prueba de mutación de punto en la detección de polimorfismos de nucleótido único en el contexto de la célula y tejido.
Representante para el análisis automatizado en situ : Ensayos automatizados permiten un mayor número de muestras a ejecutar más confiablemente, minimizando la variabilidad inter-usuario y tiempo de práctica y generar resultados consistentemente reproducibles. Por lo tanto, se desarrolló una versión automatizada de la prueba. Para demostrar de tinción automatizado con este análisis, la detección de la variante de empalme METΔ14 fue examinada. Esta variante es el resultado del exón 14 en el gen MET ser omitido durante el pre-ARNm splicing, que conduce a la activación constitutiva y transformación oncogénica de la MET del receptor8,9. Para detectar específicamente la variante de METΔ14, se diseñaron dos sondas de empalme del exón: uno que abarca la Unión de los exones 13 y 15 (E13/E15) para detectar la transcripción de la variante de METΔ14 y otro que abarca la Unión de los exones 14 y 15 (E14/E15) para detectar la WT se reunió transcripción (figura 6A). Ambas sondas fueron probados entonces en 2 líneas celulares FFPE-preparado: H596, que expresa la variante METΔ14, y A549, que expresa el gen WT se reunió. Ambas sondas mostraron patrones de expresión mutuamente exclusiva, con la sonda E13/E15 sólo detección de señal en las células H596 y la sonda de E14/E15 sólo detección de señal en las células A549 (figuras 6B y 6C). Por último, la sonda para dapB no demostró ninguna señal, ninguna señal de fondo (figuras 6B y 6C). En general, estos datos muestra la detección específica de la MET variante METΔ14 en situ utilizando el ensayo automatizado de BaseScope.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> Figura 1 : El flujo de trabajo de análisis. El flujo de trabajo consta de 4 pasos principales: pretratamiento para permeabilizar las células o tejido, hibridación de la sonda a destino RNA, la amplificación de la señal y detección de la señal de visualización bajo el microscopio de campo luminoso o fluorescentes. Puntos que se pueden cuantificar utilizando una plataforma de análisis de imagen digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> Figura 2 : Ilustración del Protocolo de ensayo manual. El ensayo completo puede completarse en 9 h. pretratamiento los tiempos pueden variar dependiendo del tipo de tejido, por lo que se recomienda consultar el Apéndice A del manual de usuario para recomendaciones de tratamiento previo del tejido en cuanto a tiempo de incubación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> Figura 3 : Imágenes representativas de la detección de empalme exón. (A) se muestra aquí son la organización de exón para EGFR WT y EGFRvIII transcripciones y un esquema con doble Z exón cruce las puntas de prueba que unen el cruce para detectar el peso de EGFR o EGFRvIII. (B) el exón cruce análisis fue realizado en dos muestras de glioblastoma FFPE usando las puntas de prueba listados en (A), así como un dapB sonda control POLR2A y sonda de control negativo, positivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> Figura 4 : Detección de la secuencia de imágenes representativas del objetivo corto. (A) se muestra aquí son secuencias CDR3 en células Jurkat. La secuencia de negro es una secuencia común de flanquea y la secuencia en rojo es única a CDR3α o a CDR3β. Sondas de secuencia de doble Z corto destino fueron diseñadas contra estas secuencias. (B) el ensayo corto blanco fue realizado en células Jurkat preparadas como un precipitado de células FFPE usando sondas anti-sentido o sentido a las secuencias de (A), y dapB fue utilizado como control negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> Figura 5 : Imágenes representativas de la detección de la mutación de punto de. (A) el ensayo fue realizado en H2229 células (homocigóticas para EGFR L858) y H1975 (heterocigotos para la mutación L858R de EGFR) preparado como un precipitado de células FFPE usando puntas de prueba de una mutación de punto doble-Z a la secuencia de EGFR L858 WT o L858R de EGFR secuencia mutada. (B) el ensayo de mutación de punto fue realizada en HuT78 células (homocigóticas para G12A KRAS) y SW116 (heterozigótico para la mutación KRAS G12A) preparado como un precipitado de células FFPE usando puntas de prueba de una mutación de punto doble-Z a la secuencia de KRAS WT de G12 o Secuencia de G12A KRAS mutado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> Figura 6 : Imágenes representativas de tinción automatizado con el ensayo de empalme exón. (A) se muestra aquí es la organización de exón para transcripciones de WT se reunieron y METΔ14 y un esquema que representa el único exón Z doble cruce las puntas de prueba que unen la ensambladura para la detección de peso conocido o METΔ14. (B) y (C) el análisis de empalme del exón automatizado fue realizado en células A549 (expresando el peso conocido) preparadas como un precipitado de células FFPE usando las puntas de prueba listados en (A) y H596 las células (METΔ14) así como control negativo sonda dapB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Empalme del exón</td>
			<td>Secuencia corta</td>
			<td>Mutación de punto</td>
		</tr>
<tr>
<td>Empalme variante/isoforma</td>
			<td>Secuencias de entre 50 y 300 nt</td>
			<td>Mutación de punto</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA circular (circRNA)</td>
			<td>Secuencias altamente homólogas</td>
			<td>Indel corto</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fusión génica</td>
			<td>Secuencia de CDR3 para clones TCR</td>
			<td>Gen de edición</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nocaut (KO) en el gen</td>
			<td>Pre-miRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ARN nucleolar pequeño (snoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gen de edición</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: aplicaciones de la en situ análisis. Existen 3 categorías principales para las aplicaciones de este ensayo: ensambladura de exón, secuencia de destino corto y mutación de punto. En cada columna son algunos ejemplos de aplicación específica para cada categoría.

Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Este método puede abordar preguntas de investigación clave en neurociencia, oncología y más, como la expresión específica del tipo de célula y el mapeo espacial de variantes de empalme dentro del cerebro y los microambientes tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar uniones de exones, secuencias cortas y mutaciones puntuales en el contexto tisular con una sensibilidad y especificidad muy altas en células individuales. La demostración del procedimiento estará a cargo de Hell Pimentel, científico asociado de nuestro laboratorio.Para preparar el tejido, fíjelo inmediatamente después de la disección en formol tamponado neutro al 10% a temperatura ambiente durante 16 a 32 horas. Posteriormente, la muestra se procesa y se incrusta en parafina utilizando procedimientos estándar. Corta el tejido incrustado en cinco secciones de más o menos una micra con un micrótomo.Monte las secciones en portaobjetos de vidrio electrostáticamente adhesivos y séquelas al aire a temperatura ambiente durante la noche. Una hora antes de realizar el ensayo de hibridación de ARN NC2, coloque los portaobjetos de tejido montados en una rejilla de portaobjetos y hornee en un horno de aire circulante a 60 grados centígrados. Antes de comenzar el ensayo de hibridación de ARN NC2, asegúrese de que el horno de hibridación esté configurado a 40 grados centígrados.Humedezca bien el papel humidificador, elimine el agua residual y coloque la tapa en la bandeja de control de humedad. Prepare 200 mililitros de reactivo de recuperación de objetivos 1X disponible en el mercado agregando 20 mililitros de reactivo de recuperación de objetivos 10X a 180 mililitros de agua. Coloque dos soportes para correderas en una vaporera.Llene un portaobjetos con 200 mililitros de reactivo de recuperación de objetivos 1X y el otro con 200 mililitros de agua. Con la vaporera, caliente ambas soluciones hasta que hiervan. Caliente el tampón de lavado 50X a 40 grados centígrados durante 10 a 20 minutos.A continuación, prepare tres litros de tampón de lavado 1X diluyendo 60 mililitros de tampón de lavado 50X precalentado con 2,94 litros de agua. En una campana extractora, prepare el 50% de la solución contratinente de hematoxilina de Gill agregando 100 mililitros de hematoxilina de Gill a 100 mililitros de agua. Prepare el reactivo azulado añadiendo 1,43 mililitros de hidróxido de amonio al 20 a 30% a 250 mililitros de agua.Precaliente las sondas objetivo a 40 grados centígrados durante 10 minutos antes de la hibridación de la sonda. Lleve los siete reactivos amplificadores, amperios de 0 a 6, a temperatura ambiente. Inicie la despariffinización de la muestra retirando secciones del horno y sumergiendo los portaobjetos de tejido montados en xileno con agitación durante cinco minutos.Despariffinizar de nuevo en xileno fresco durante cinco minutos. Deshidratar en etanol al 100% con agitación durante dos minutos. Y repita de nuevo en etanol fresco al 100% durante dos minutos.Seque al aire los portaobjetos a 60 grados centígrados en un horno de circulación durante cinco minutos hasta que estén completamente secos. A continuación, incube las secciones con unas cuatro gotas de peróxido de hidrógeno listo para usar a temperatura ambiente durante 10 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Decanta la solución de los portaobjetos y enjuágalos dos veces con agua.Sumerja brevemente las secciones en el agua precalentada y luego coloque las secciones en 200 mililitros del reactivo de recuperación de objetivos a 100 grados Celsius en el vaporizador durante 15 a 30 minutos. Retire los portaobjetos de la recuperación de destino y enjuague dos veces con agua. Sumérjalo en etanol al 100% durante tres minutos.Luego seque los portaobjetos a 60 grados centígrados en un horno de aire circulante hasta que estén completamente secos. Una vez que los portaobjetos estén secos, use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar una barrera hidrofóbica de aproximadamente 0.75 por 0.75 pulgadas alrededor de la sección. Deje que la barrera se seque completamente a temperatura ambiente durante un minuto.Coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos y coloque el portaobjetos en la bandeja precalentada con control de humedad. Agregue aproximadamente cuatro gotas de proteasa 3 a cada portaobjetos e incube a 40 grados centígrados en el horno de hibridación durante 15 a 30 minutos. Decanta la solución de los portaobjetos y enjuágalos dos veces con agua.Para comenzar el procedimiento de hibridación de la sonda, agregue aproximadamente cuatro gotas de la solución de sonda lista para usar adecuada para cubrir toda la sección. Hibridar las sondas a 40 grados centígrados en el horno de hibridación durante dos horas. Decantar la solución de los portaobjetos y lavar los portaobjetos en 200 mililitros de tampón de lavado 1X a temperatura ambiente con agitación ocasional durante dos minutos.Repita el procedimiento de lavado. El siguiente paso es amplificar la señal incubando las secciones en una serie de reactivos amplificadores. Añade unas cuatro gotas de Amp 0 para cubrir toda la sección de cada portaobjetos e incuba a 40 grados centígrados en el horno de hibridación durante 30 minutos.A continuación, decantar la solución y lavar los portaobjetos en 200 mililitros de tampón de lavado 1X a temperatura ambiente con agitación ocasional durante dos minutos. Repita el procedimiento de lavado. De la misma manera, incube las secciones en Amp 1 a Amp 6 a la temperatura y durante la cantidad de tiempo indicada en este esquema.Después de que los portaobjetos hayan sido tratados con la serie de reactivos de amplificación, prepare una solución de trabajo de colorante Fast Red. Añade el volumen adecuado de tinte Fast Red-B y Fast Red-A en un tubo y mezcla bien. Decanta el exceso de líquido de los portaobjetos y añade la solución de trabajo del tinte Fast Red a los portaobjetos.Incubar los portaobjetos en una bandeja con tapa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de 10 minutos, decanta la solución Fast Red y enjuaga los portaobjetos dos veces sumergiéndolos arriba y abajo con agua del grifo. Para contrarrestar la tinción de las secciones de tejido, sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina de Gill al 50% a temperatura ambiente durante dos minutos.Lave los portaobjetos con agua del grifo, repitiendo esto varias veces hasta que los portaobjetos estén transparentes mientras las secciones permanecen moradas. Sumerja los portaobjetos en agua con 02% de amoníaco dos o tres veces para azular. Reemplace el agua amoniacal con agua del grifo y lave los portaobjetos de tres a cinco veces.Seque los portaobjetos en un horno de aire circulante a 60 grados centígrados durante 15 minutos hasta que estén completamente secos. Coloque una o dos gotas de reactivo de montaje en un cubreobjetos y coloque el portaobjetos sobre el cubreobjetos evitando que queden atrapadas las burbujas de aire. Seque los portaobjetos al aire durante al menos cinco minutos.Por último, observe los portaobjetos bajo un microscopio de campo claro estándar. Se diseñaron sondas de unión de exones de doble Z para determinar el estado de EGFRvIII en dos muestras de glioblastoma de parafina fija en formol o FFPE. Ambas sondas de tipo salvaje detectaron señal en ambas muestras, lo que indica que las dos muestras expresan EGFR de tipo salvaje.Sin embargo, la sonda mutante solo detectó señal en la muestra positiva de EGFRvIII y no en la muestra negativa de EGFRvIII. Se incluyeron sondas de control positivas y negativas en el ensayo. Cuando se realizó un ensayo de diana corto en células Jurkat, preparadas como un pellet de célula FFPE utilizando sondas antisentido o de sentido, dirigiéndose a las secuencias en rojo, se observó una tinción robusta con sondas antisentido tanto para CDR3-alfa como para CDR3-beta, mientras que las sondas de detección detectaron poca o ninguna señal.Se utilizó dapB como control negativo. El ensayo también es capaz de detectar mutaciones puntuales. En este ejemplo, se diseñaron dos sondas, una para detectar la secuencia de EGFR mutada L858R y otra para detectar la secuencia de tipo salvaje EGFR L858.La sonda mutante detectó señal en la línea celular H1975, que es heterocigota para la mutación EGFR L858R, pero no detectó señal en la línea celular H2229, que solo expresa el tipo salvaje EGFR L858. La sonda de tipo salvaje detectó la señal en ambas líneas celulares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar fijar adecuadamente los tejidos, ejecutar sondas de control positivas y negativas y utilizar el sistema de procesamiento de portaobjetos en el horno de hibridación.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la IHQ con marcadores celulares, para responder a preguntas adicionales, como la identificación de la expresión específica del tipo de célula de variantes de empalme o secuencias diana cortas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en neurociencia, oncología y otros exploren eventos de empalme alternativos en el contexto de los tejidos, identificando mutaciones puntuales mapeadas espacialmente y visualizando secuencias cortas y altamente homólogas in situ. No olvide que trabajar con formalina y xileno neutros tamponados puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana extractora y usar equipo de protección personal al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Biología

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