Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

Este método puede abordar preguntas de investigación clave en neurociencia, oncología y más, como la expresión específica del tipo de célula y el mapeo espacial de variantes de empalme dentro del cerebro y los microambientes tumorales. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar uniones de exones, secuencias cortas y mutaciones puntuales en el contexto tisular con una sensibilidad y especificidad muy altas en células individuales. La demostración del procedimiento estará a cargo de Hell Pimentel, científico asociado de nuestro laboratorio.

Para preparar el tejido, fíjelo inmediatamente después de la disección en formol tamponado neutro al 10% a temperatura ambiente durante 16 a 32 horas. Posteriormente, la muestra se procesa y se incrusta en parafina utilizando procedimientos estándar. Corta el tejido incrustado en cinco secciones de más o menos una micra con un micrótomo.

Monte las secciones en portaobjetos de vidrio electrostáticamente adhesivos y séquelas al aire a temperatura ambiente durante la noche. Una hora antes de realizar el ensayo de hibridación de ARN NC2, coloque los portaobjetos de tejido montados en una rejilla de portaobjetos y hornee en un horno de aire circulante a 60 grados centígrados. Antes de comenzar el ensayo de hibridación de ARN NC2, asegúrese de que el horno de hibridación esté configurado a 40 grados centígrados.

Humedezca bien el papel humidificador, elimine el agua residual y coloque la tapa en la bandeja de control de humedad. Prepare 200 mililitros de reactivo de recuperación de objetivos 1X disponible en el mercado agregando 20 mililitros de reactivo de recuperación de objetivos 10X a 180 mililitros de agua. Coloque dos soportes para correderas en una vaporera.

Llene un portaobjetos con 200 mililitros de reactivo de recuperación de objetivos 1X y el otro con 200 mililitros de agua. Con la vaporera, caliente ambas soluciones hasta que hiervan. Caliente el tampón de lavado 50X a 40 grados centígrados durante 10 a 20 minutos.

A continuación, prepare tres litros de tampón de lavado 1X diluyendo 60 mililitros de tampón de lavado 50X precalentado con 2,94 litros de agua. En una campana extractora, prepare el 50% de la solución contratinente de hematoxilina de Gill agregando 100 mililitros de hematoxilina de Gill a 100 mililitros de agua. Prepare el reactivo azulado añadiendo 1,43 mililitros de hidróxido de amonio al 20 a 30% a 250 mililitros de agua.

Precaliente las sondas objetivo a 40 grados centígrados durante 10 minutos antes de la hibridación de la sonda. Lleve los siete reactivos amplificadores, amperios de 0 a 6, a temperatura ambiente. Inicie la despariffinización de la muestra retirando secciones del horno y sumergiendo los portaobjetos de tejido montados en xileno con agitación durante cinco minutos.

Despariffinizar de nuevo en xileno fresco durante cinco minutos. Deshidratar en etanol al 100% con agitación durante dos minutos. Y repita de nuevo en etanol fresco al 100% durante dos minutos.

Seque al aire los portaobjetos a 60 grados centígrados en un horno de circulación durante cinco minutos hasta que estén completamente secos. A continuación, incube las secciones con unas cuatro gotas de peróxido de hidrógeno listo para usar a temperatura ambiente durante 10 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Decanta la solución de los portaobjetos y enjuágalos dos veces con agua.

Sumerja brevemente las secciones en el agua precalentada y luego coloque las secciones en 200 mililitros del reactivo de recuperación de objetivos a 100 grados Celsius en el vaporizador durante 15 a 30 minutos. Retire los portaobjetos de la recuperación de destino y enjuague dos veces con agua. Sumérjalo en etanol al 100% durante tres minutos.

Luego seque los portaobjetos a 60 grados centígrados en un horno de aire circulante hasta que estén completamente secos. Una vez que los portaobjetos estén secos, use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar una barrera hidrofóbica de aproximadamente 0.75 por 0.75 pulgadas alrededor de la sección. Deje que la barrera se seque completamente a temperatura ambiente durante un minuto.

Coloque los portaobjetos en un soporte para portaobjetos y coloque el portaobjetos en la bandeja precalentada con control de humedad. Agregue aproximadamente cuatro gotas de proteasa 3 a cada portaobjetos e incube a 40 grados centígrados en el horno de hibridación durante 15 a 30 minutos. Decanta la solución de los portaobjetos y enjuágalos dos veces con agua.

Para comenzar el procedimiento de hibridación de la sonda, agregue aproximadamente cuatro gotas de la solución de sonda lista para usar adecuada para cubrir toda la sección. Hibridar las sondas a 40 grados centígrados en el horno de hibridación durante dos horas. Decantar la solución de los portaobjetos y lavar los portaobjetos en 200 mililitros de tampón de lavado 1X a temperatura ambiente con agitación ocasional durante dos minutos.

Repita el procedimiento de lavado. El siguiente paso es amplificar la señal incubando las secciones en una serie de reactivos amplificadores. Añade unas cuatro gotas de Amp 0 para cubrir toda la sección de cada portaobjetos e incuba a 40 grados centígrados en el horno de hibridación durante 30 minutos.

A continuación, decantar la solución y lavar los portaobjetos en 200 mililitros de tampón de lavado 1X a temperatura ambiente con agitación ocasional durante dos minutos. Repita el procedimiento de lavado. De la misma manera, incube las secciones en Amp 1 a Amp 6 a la temperatura y durante la cantidad de tiempo indicada en este esquema.

Después de que los portaobjetos hayan sido tratados con la serie de reactivos de amplificación, prepare una solución de trabajo de colorante Fast Red. Añade el volumen adecuado de tinte Fast Red-B y Fast Red-A en un tubo y mezcla bien. Decanta el exceso de líquido de los portaobjetos y añade la solución de trabajo del tinte Fast Red a los portaobjetos.

Incubar los portaobjetos en una bandeja con tapa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de 10 minutos, decanta la solución Fast Red y enjuaga los portaobjetos dos veces sumergiéndolos arriba y abajo con agua del grifo. Para contrarrestar la tinción de las secciones de tejido, sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina de Gill al 50% a temperatura ambiente durante dos minutos.

Lave los portaobjetos con agua del grifo, repitiendo esto varias veces hasta que los portaobjetos estén transparentes mientras las secciones permanecen moradas. Sumerja los portaobjetos en agua con 02% de amoníaco dos o tres veces para azular. Reemplace el agua amoniacal con agua del grifo y lave los portaobjetos de tres a cinco veces.

Seque los portaobjetos en un horno de aire circulante a 60 grados centígrados durante 15 minutos hasta que estén completamente secos. Coloque una o dos gotas de reactivo de montaje en un cubreobjetos y coloque el portaobjetos sobre el cubreobjetos evitando que queden atrapadas las burbujas de aire. Seque los portaobjetos al aire durante al menos cinco minutos.

Por último, observe los portaobjetos bajo un microscopio de campo claro estándar. Se diseñaron sondas de unión de exones de doble Z para determinar el estado de EGFRvIII en dos muestras de glioblastoma de parafina fija en formol o FFPE. Ambas sondas de tipo salvaje detectaron señal en ambas muestras, lo que indica que las dos muestras expresan EGFR de tipo salvaje.

Sin embargo, la sonda mutante solo detectó señal en la muestra positiva de EGFRvIII y no en la muestra negativa de EGFRvIII. Se incluyeron sondas de control positivas y negativas en el ensayo. Cuando se realizó un ensayo de diana corto en células Jurkat, preparadas como un pellet de célula FFPE utilizando sondas antisentido o de sentido, dirigiéndose a las secuencias en rojo, se observó una tinción robusta con sondas antisentido tanto para CDR3-alfa como para CDR3-beta, mientras que las sondas de detección detectaron poca o ninguna señal.

Se utilizó dapB como control negativo. El ensayo también es capaz de detectar mutaciones puntuales. En este ejemplo, se diseñaron dos sondas, una para detectar la secuencia de EGFR mutada L858R y otra para detectar la secuencia de tipo salvaje EGFR L858.

La sonda mutante detectó señal en la línea celular H1975, que es heterocigota para la mutación EGFR L858R, pero no detectó señal en la línea celular H2229, que solo expresa el tipo salvaje EGFR L858. La sonda de tipo salvaje detectó la señal en ambas líneas celulares. Al intentar este procedimiento, es importante recordar fijar adecuadamente los tejidos, ejecutar sondas de control positivas y negativas y utilizar el sistema de procesamiento de portaobjetos en el horno de hibridación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la IHQ con marcadores celulares, para responder a preguntas adicionales, como la identificación de la expresión específica del tipo de célula de variantes de empalme o secuencias diana cortas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en neurociencia, oncología y otros exploren eventos de empalme alternativos en el contexto de los tejidos, identificando mutaciones puntuales mapeadas espacialmente y visualizando secuencias cortas y altamente homólogas in situ. No olvide que trabajar con formalina y xileno neutros tamponados puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una campana extractora y usar equipo de protección personal al realizar este procedimiento.