Name: Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprende a caracterizar bioquímicamente la actividad de la tRNA-isopentenil transferasa Mod5 en levadura mediante un ensayo in vitro simple y directo. Este método permite detectar modificaciones covalentes del ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer a Dr. David Engelke por su orientación y comentarios sobre este manuscrito. Pijamas - fondos de puesta en marcha de laboratorio de Ball State University; DAB - concesión 1R15AI130950-01.

Nota: El protocolo fue adaptado de la ref. 24.
1. obtener el ARN y la enzima de interés
<ol><li>Uso en vitro transcribe ARN marcado internamente con 32P y Mod5 de His6 recombinante expresada en y purificado de la e. coli, como se describió anteriormente24.<ol>
<li>Introducir en vitro transcritos RNAs (sección 3) utilizando T7 ARN polimerasa en presencia de ATP sin etiqueta, UTP, CTP, GTP y 10 μCi de gel purificado, precipitado etanol α-ATP, resuspendió en TE 1 x (pH de 10 mM Tris-HCl 7.5, 0.1 mM EDTA) y almacenados a-80 ° C 24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>También puede obtener RNAs fluorescente etiquetados disponibles en el mercado de interés. Producir la enzyme(s) de interés en cualquier sistema de expresión preferido. PRECAUCIÓN: Etiquetas fluorescentes internos en el ARN pueden alterar la estructura de RNA y reconocimiento por enzimas.</li>
</ol>2. prepare una 20% de poliacrilamida desnaturalizantes Gel
Nota: Para obtener la suficiente resolución de fragmentos de ARN, se recomienda un gel de losa vertical de longitud 40 cm. El ancho del gel utilizado es determinado por el número de muestras a analizar.
<ol><li>Limpie las placas de cristal. En primer lugar, lavar con agua y jabón, enjuagar con agua desionizada y finalmente limpiar con isopropanol y trapos sin pelusa.</li>
	<li>Montar las placas y los espaciadores.</li>
	<li>Mezclar los siguientes reactivos para hacer 100 mL de 20% de acrilamida, 7.5m de urea, 1 gel x TBE: 80 mL de gel de urea concentrado (237,5 g/L de acrilamida, 12.5 g/L de bisacrilamida de metileno, 7,5 M de urea en agua desionizada), 10 mL de diluyente de gel de urea (7.5M urea en agua desionizada) y 10 mL de tampón de gel de urea (0,89 M Tris-borato-20 mM EDTA buffer pH 8,3 y 7,5 M urea). Nota: El volumen de la solución en gel debe ajustarse a las dimensiones del gel.</li>
	<li>Agregar 40 μl de N, N, N′, Tetramethylethylenediamine N′ (TEMED) y 800 μl de persulfato de amonio 10% recién preparada (APS).</li>
	<li>Elaboración de la solución en gel en una jeringa grande y dispensar entre placas de vidrio. Grifo de cristal con los dedos mientras lo vierte para evitar formación de burbujas.</li>
	<li>Deje el gel solidificar por 30 minutos.</li>
	<li>Abrazadera de gel solidificado en gel vertical apparatus utilizando clips binder.</li>
	<li>Llenan cámaras de amortiguación superior e inferior de 1 x TBE.</li>
	<li>Dos horas antes de cargar el gel, ejecutar previamente el gel a 20 mA, por 2 h para permitir que el límite de búfer a correr más rápido que los más pequeños oligonucleótidos - lo contrario más pequeño nucleotides y oligonucleótidos tienden a colapsar en el frente del almacenador intermediario.</li>
</ol>3. ARN Isopentenylation ensayo
<ol><li>Preparar las reacciones en un volumen final de 17 μl, conteniendo 58 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 inhibidor de U de Rnasa (e.g., SuperRNaseIn), 40.000 CPM internamente 32ARN marcado con P, μm 5.3 Mod5 y 1,2 mM 2 - mercaptoetanol.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C durante 1 hora las reacciones.</li>
	<li>Etanol-precipitado RNAs con 2,5 volúmenes (42.5 μl) de etanol al 100% y 1/10 volúmenes (1,7 μL) de 3,5 M sodio acetato pH 5.5 y a-20 ° C para 1 h o durante la noche.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de RNA por 20 min a 15.400 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70% de RNA.</li>
	<li>Centrifugar muestras en 5 min 15.400 x g a 4° C.</li>
	<li>Retire con cuidado las pelotillas de RNA sobrenadante y secado al aire durante 15 minutos, o hasta que se evapore el etanol todos.</li>
	<li>Resuspender el pellet de RNA en 10 μl de 8 M de urea.</li>
	<li>Añadir 150 U de ARNasa T1 e incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Añadir 2 μl de 6 x buffer (glicerol al 60%, 0.1% xileno cyanol) del cargamento.</li>
	<li>Cargar 10 μl de cada muestra de RNA en una pre-carrera, 20% poliacrilamida, gel de urea de 7.5 M (véase la sección 2 del Protocolo). Nota: Escalas de tamaño de RNA radiactiva pueden incluirse como un marcador de movilidad adicional.</li>
	<li>Ejecutar gel por 2 h a 25 mA.</li>
	<li>Dejar el gel y retire del aparato.</li>
	<li>Entre las placas de dos vidrio y quitar una de las placas de vidrio, con gel en la placa "inferior". Nota: tenga cuidado de no para rasgar el gel durante este paso.</li>
	<li>Coloque una capa de envoltura de plástico sobre el gel y exponer en una pantalla de fósforo para 3 h. alternativamente, Coloque gel en cromatografía en papel y secar con un secador antes de la exposición de pantalla de fósforo de gel.</li>
	<li>Pantalla de fósforo de imagen en un sensor de fósforo.</li>
</ol>

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li>
<li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li>
<li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+modification+of+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li>
<li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li>
<li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li>
<li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li>
<li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li>
<li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li>
<li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+MOD5%2C+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li>
<li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li>
<li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li>
<li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li>
<li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+%28TRIT1%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li>
<li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424(2014).</li>
<li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li>
<li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3%27+untranslated+region+of+TRIT1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009(2015).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1%2C+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients%27+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li>
<li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li>
<li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA-modifying+protein%2C+TRIT1%2C+forms+amyloid+fibers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23716598">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li>
<li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li>
<li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N%281%29-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+reveals+a+conserved%2C+widespread%2C+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li>
<li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053(2011).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li>
</ol>

Ninguno para revelar.

Modificaciones de RNA continúan ser demostrado que desempeñan un papel cada vez más importantes y diversas en función celular y organismo. Como tal, el desarrollo de ensayos para interrogar RNA enzimas modificadoras es central para comprender mejor los aspectos fundamentales de la biología. Este protocolo describe un análisis de alta resolución de vitro para caracterizar la actividad de modificación de tRNA de Mod5.
Este protocolo tiene la clara ventaja de proporcionar una lectura dir...

Se han identificado al menos 163 distinta modificación postranscripcional de RNA, con estas modificaciones confieren funciones diversas y contextual para RNAs directamente influir en la estructura del RNA y que afectan a las interacciones de RNA con otros las moléculas1,2. A medida que aumenta la apreciación de la cantidad y variedad de modificaciones de RNA, es fundamental para desarrollar ensayos que pueden interrogar confiablemente las modificaciones del RNA y las enzimas que catalizan los.
Una de las primeras modificaciones de RNA para identificarse se produce en 37 base en tRNAs, adyacente al anti-codon en el 3' parte3,4. Un grupo de isopentenyl se transfiere del dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) en la posición N6 de la adenosina 37 (me6A37) 3,5 en un subconjunto de tRNAs citoplásmica y mitocondrial. i6A37 mejora la fidelidad de la traducción y eficiencia aumentando la afinidad del ARNt por el ribosoma4,6 y yo6A37 es importante para la respuesta de estrés en las bacterias7. Las enzimas que realizan esta modificación se denominan transferasas de isopentenyl tRNA y están muy conservadas en bacterias8,9, hongos10, gusanos11, plantas12y eucariotas superiores13 , incluyendo los seres humanos14.
Las mutaciones en el gene humano de tRNA isopentenyl transferasa, TRIT1, están asociadas con enfermedad humana. Por ejemplo, una mutación en el TRIT1 se correlaciona con una severa enfermedad mitocondrial, probablemente causada por un defecto en la síntesis de proteínas mitocondriales15,16. Además, TRIT1 ha sido descrito como un tumor supresor genes17,18 y está implicada en varios tipos de cáncer incluyendo melanoma19, mama20, gástrico21y cánceres de pulmón22 ,23. Finalmente, TRIT1 y Mod5 transferasas de isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) son propensas a la agregación de proteínas que forman las fibras de amiloide-como prión24,25,26. Estas observaciones implican potencialmente transferasas de isopentenyl tRNA en enfermedades neurodegenerativas, aunque todavía no se ha demostrado evidencia directa para esto.
Dado el papel que isopentenyl transferasas en traducción y la enfermedad, métodos que directamente me miden6una actividad de transferasa de isopentenyl son importantes para una comprensión mecanicista de estas enzimas bajo normal y Estados de la enfermedad. Un número creciente de métodos está disponible para detectar modificaciones de una RNA6, incluyendo en vitro isopentenylation ensayos, hibridación positivo en ausencia de6ensayos (PHA6), delgada cromatografía (TLC), aminoácido ensayos de actividad de aceptación y métodos de espectrometría de masas (revisado en Ref. 4).
Un ensayo de isopentenylation en vitro se ha descrito que utiliza 14C-DMAPP y tRNAs sin etiqueta. En este ensayo, carbono radiactivo se transfiere al ARN de 14C-DMAPP por la transferasa de isopentenyl. Mientras que este ensayo es altamente sensible, a menudo es difícil determinar el residuo concreto que es modificada9,20,27. PHA6 ensayos dependen de la voluminosa me modificación6A interferir con la hibridación de una sonda marcada con P 32, que abarca el residuo modificado. Como tal, la hibridación es mayor en la ausencia de una i6una modificación18,28,29. PHA6 ensayos son muy sensibles y capaces de análisis de ARN total extraído de Lisados celulares. Además, la habilidad de diseñar sondas específicas de RNA de interés ofrece esta flexibilidad de método objetivo sustancial. Sin embargo, ensayos de PHA6 se limitan a la caracterización de las modificaciones que se producen en los residuos dentro de la región específica de la sonda y por lo tanto son menos propensos a identificar sitios de modificación novedosa. Además, como falta de Unión es indicativa de la modificación, otras modificaciones o mutaciones que afectan la Unión de la RNA se confundir análisis de datos.
Otro enfoque combina cromatografía de celulosa bencílico DEAE celulosa (BD) con actividad de aceptación de aminoácidos como una lectura de lo6A modificaciones en el tRNA30. Este enfoque ensayos directamente la función de la i modificación de6A, pero es una aproximación indirecta a detectar i6A modificación y carece de resolución para mapear modificaciones a un residuo específico en el ARN. Un enfoque del TLC se ha utilizado para detectar total tRNA i6A modificaciones. En este enfoque, internamente 32tRNAs P etiquetados son digeridos a nucleótidos individuales y análisis TLC bidimensional se utilizan para identificar el isopentenylation. Este enfoque es altamente sensible en la detección de i total6A en una muestra determinada de RNA pero sobre digestión, toda la información de secuencia se pierde; así, el investigador no tiene forma de determinar que los residuos han sido modificados31.
Más recientemente, se han desarrollado métodos líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que comparar cuantitativamente la total modificación de RNA entre especies, tipos celulares y condiciones experimentales32,33, 34. Una limitación de esta metodología es que es menos capaz de determinar la identidad y posición en el ARN que los nucleósidos modificados fue derivan34. Además, la experiencia y el equipo necesario para ejecutar estos experimentos limitan la utilidad de este enfoque.
Además, se han desarrollado varias tecnologías de secuenciación de próxima generación para RNA modificaciones todo el transcriptoma34. Inmunoprecipitación de RNAs con anticuerpos específicos a una modificación especial (RIP-Seq) permiten al investigador a identificar todas las secuencias que contiene una modificación específica35,36. Además, enfoques basados en la transcriptasa reversa como Chem-Seq y secuencia del desajuste no aleatoria se basan en las perturbaciones de la reacción de transcripción inversa en los residuos modificados37,38,39. A pesar de la ventaja de estas técnicas para asignar todo el RNA modificaciones transcriptoma, RIP-seq y Chem-Seq tecnologías están limitadas por la falta de anticuerpos confiables o disponible para cada modificación específica, respectivamente34reactivos químicos. Además, las enzimas transcriptasa reversa necesaria para realizar Chem-Seq y técnicas de secuenciación de desajuste no aleatoria pueden verse obstaculizadas por las estructuras de RNA estables. La naturaleza altamente modificada y estructuralmente estable de tRNAs hacen especialmente difíciles de interrogar utilizando estas técnicas. Hasta la fecha, tecnologías de secuenciación de próxima generación no se han utilizado todavía para mapa i6una modificaciones34.
Adjunto, describimos un enfoque simple y directo detectar6un tRNA modificaciones in vitro. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasa (Mod5), seguido por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel de 1 dimensión para mapa i6A modificaciones. Este enfoque es directo y requiere poco especializados para analizar los datos. Además, este método es adaptable a otros RNA modificación de enzimas, incluyendo enzimas que modifican covalentemente el peso molecular del ARN o movilidad de un RNA a través de un gel.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentrado de gel de urea</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Como parte de un kit</td></tr><tr><td>Diluyente de UreaGel</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Como parte de un kit</td></tr><tr><td>Tampón de UreaGel</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Como parte de un kit</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Como parte de un kit</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sodiume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidrio cortas (20-40 cm de ancho x 40 cm de largo)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidrio largas (20-40 cm de ancho x 40 cm de largo)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparato de gel vertical</td><td>The Gel Company</td> Jeringa desechable <td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de acero inoxidable</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoscreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Envoltura de plástico</td> <td>(tienda de comestibles local)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo in vitro para detectar actividad de transferasa de isopentenyl trna

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6- isopentenyladenosine RNA modificaciones son funcionalmente diverso y altamente conservado entre procariotas y eucariotas. Una de las más altamente conservado N6- isopentenyladenosine modificaciones se produce en la posición de A37 en un subconjunto de tRNAs. Esta modificación mejora la eficiencia de la traducción y fidelidad mediante el aumento de la afinidad de los tRNA por el ribosoma. Mutación de las enzimas responsables de esta modificación en eucariotas están asociados con varios Estados de enfermedad, incluyendo cáncer y la disfunción mitocondrial. Por lo tanto, comprender la especificidad de sustrato y las actividades bioquímicas de estas enzimas es importante para la comprensión de la biología de eucariota normal y patológica. Una gran variedad de métodos se ha empleado para caracterizar i6A modificaciones. Es en este documento se describe un enfoque directo para la detección de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante isopentenyl transferasa, seguida por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel 1-dimensional detectar modificaciones6A. Además, se discute la adaptabilidad potencial de este protocolo para caracterizar otras enzimas de modificación de RNA.

Mod5 fue incubado con una tirosina tRNA o serina tRNA en la presencia o ausencia de DMAPP. Tras la reacción de modificación, productos fueron digeridos ARNasa T1, que separa el extremo 3' de todos guanosines dejando una 3' guanosina (GMP) de Unión24 (figura 1). Digestión completa de los RNAs produce un patrón predecible de los fragmentos radiactivos (figura 2A), que luego se resolvió en un...

Aquí, describimos un protocolo para la caracterización bioquímica de la enzima de modificación de RNA de la levadura, Mod5 y discutir cómo este protocolo podría aplicarse a otras enzimas de modificación de RNA.

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

El objetivo general de este protocolo es caracterizar bioquímicamente la actividad de la tRNA-Isopentenyl Transferase In Vitro. Este método es útil para la detección in vitro y la caracterización de la actividad de tRNA-isopentenyl transferase de enzimas recombinantes purificadas. La principal ventaja de esta técnica es que es un ensayo simple y directo utilizado para detectar una modificación covalente del ARN.Aunque este método proporciona información sobre la actividad de tRNA-isopentenyl transferase, es potencialmente adaptable para la caracterización bioquímica de enzimas modificadoras de ARN o de amplio rango. El primer paso en este procedimiento es limpiar a fondo las placas de vidrio que se utilizarán para la fundición del gel. Lave las placas con agua y jabón, enjuague bien con agua desionizada y luego limpie las placas con isopropanol y toallitas sin pelusas.A continuación, montar las placas y espaciadores. Mezclar los siguientes reactivos para hacer un gel de 100 mililitros 20%acrilamida, 7,5 molares, 1x gel TBE. 80 mililitros de concentrado de gel de urea, 10 mililitros de diluyente de gel de urea y 10 mililitros de tampón de gel de urea.Añadir 40 microlitros de T-med y

an-in-vitro-assay-to-detect-trna-isopentenyl-transferase-activity

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe la preparación de un sustrato sintético para el...

Ensayo in vitro de metilación del ADN tRNA con Entamoeba histolytica y Dnmt2 tRNA metiltransferasa (Ehmeth) Enzima

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Esfuerzos para aislar a la subunidad catalítica de la telomerasa, TERT, en cantidades suficientes para realizar estudios estructurales, han tenido un éxito limitado desde hace más de una década. En este sentido, los actuales métodos para el aislamiento de la recombinación del TERT Tribolium castaneum...

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.

La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

Galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole y su análogo freebase presentan baja citotoxicidad celular micromolar. Este manuscrito describe una reacción de transcripción de ARN, ARN de formación de imágenes con un gel teñido con bromuro de etidio, y la cuantificación de ARN con espectroscopía UV-Vis, con el fin de evaluar la inhibición de la transcripción por corroles y demuestra un método directo de la evaluación de propiedades contra el cáncer candidatos.

Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimática Ensayo para medir la transcripción Inhibición por galio (III) y H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

El presente informe describe un ensayo enzimático in vitro para medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa utilizando extractos de células de Leishmania. Este ensayo se basa en la transferencia de un grupo metilo radiactivo de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a la fosfatidiletanolamina endógena.

Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

En este manuscrito, describimos un protocolo para examinar funcionalmente la transcripción y la actividad inhibitoria de agentes antibacterianos dirigidos a la transcripción bacteriana.

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

Se presenta un protocolo para la producción de tRNA (UUU) y el análisis de tRNA (UUU) en complejo con la enzima TcdA mediante ensayos de retardo de gel de agarosa.

Ensayos de Retardo de Gel de ARNt de Proteína-ARNt para el Análisis del<emN</em<sup6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Presentamos un protocolo para estudiar la regulación de la traducción de mRNA en células infectadas por poxvirus usando el ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN. El ensayo se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Elements de un mRNA, incluyendo 5 '-región no traducida (UTR) y 3 '-UTR. También se pueden examinar diferentes modos de iniciación de la traducción utilizando este método.

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

Aquí, se describe un ensayo in vitro libre de anticuerpos para el análisis directo de la actividad de la metiltransferasa en ARN sintético o transcrito in vitro.

Ensayo libre de anticuerpos para el análisis de actividad de la metiltransferasa de ARN

El seguimiento de eventos de traducción individuales permite estudios cinéticos de alta resolución de mecanismos de traducción dependientes de la tapa. Aquí demostramos un ensayo in vitro de una sola molécula basado en interacciones por imágenes entre anticuerpos etiquetados fluorescentemente y péptidos nacientes etiquetados con epitopos. Este método permite la caracterización de moléculas únicas de cinética de iniciación y elongación peptídica durante la traducción activa dependiente de la...

Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

Aprende a caracterizar bioquímicamente la actividad de la tRNA-isopentenil transferasa Mod5 en levadura mediante un ensayo in vitro simple y directo. Este método permite detectar modificaciones covalentes del ARN.

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

Explorar más videos