Name: Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a aislar e identificar células inmunes del miocardio en ratones mediante digestión enzimática y citometría de flujo. Este método permite cuantificar subpoblaciones raras durante estados de reposo e inflamación.

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Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación salud (148808 y 148792), SE contó con un corazón y un movimiento Fundación, premio personal de la Oficina Provincial de Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre para la investigación del corazón y el Peter Munk Centro cardíaco. XCC tiene una beca de Banting CIHR. LA sostiene un corazón & movimiento/Richard Lewar beca premio.

Declaración de ética: este protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la red de salud universitaria (Toronto, Canadá) y está de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.
1. preparación de buffer
<ol><li>Preparar el tampón HBB (de Hank balanceado sal solución (HBSS), suero bovino inactivado por calor 2%, albúmina de suero bovino 0,2%). Añadir 10 mL de calor inactiva el suero bovino y 1 g de albúmina de suero bovino a 500 mL de HBSS. Filtro de esterilización a través de un filtro μm 0.2 y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar el tampón FACS (tampón de fosfato salino (PBS), 2% calor inactiva el suero bovino, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, pH 8.0)). Añadir inactivado de calor de 10 mL de suero bovino y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 500 mL de PBS. Filtro de esterilización a través de un filtro μm 0.2 y almacenar a 4 ° C. Nota: Las soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.</li>
</ol>2. etiquetado de leucocitos que circulan
<ol><li>Preparar asépticamente inyección de CD45 anti ratón con 1 μg de anticuerpo diluido en tampón de fosfato estéril salino (PBS) para un volumen de inyección final de 200 μL/ratón. Volumen de carga en una jeringa de insulina 28,5 G y mantener lejos de la luz. Nota: Utilice dos anticuerpos anti-CD45 marcado con fluorocromo diferente para distinguir el intravascular (teñido a través de la administración de i.v.) de la tinción intracardiaco (manchado después de la digestión; ver paso 4).</li>
	<li>
Caliente previamente ratones (8 – 12 semanas) exponiendo la cola a una lámpara de calor rojo durante 5 minutos. ADVERTENCIA: No recaliente el animal. Mantenga la lámpara a una distancia segura (> 30 cm).<ol>
<li>Refrenar el animal en posición esternal utilizando un dispositivo apropiado. Exponer y estabilizar la cola con la mano no dominante por inmovilizar la base de la cola con el índice y el dedo medio y la región medio-distal de la cola con el pulgar y el dedo anular. PRECAUCIÓN: No aplique demasiada fuerza en la punta de la cola ya que la piel puede ser halada. Inserte la aguja con el bisel hacia arriba en la vena. Mantenga la aguja paralela a la vena en todo momento ya que es fácil punzar la vena. Nota: Sangre en la jeringa puede ocurrir y es un signo de una buena inyección. Doblar la aguja a un ángulo de 90° puede facilitar la administración de i.v.. Confirme con su oficina de seguridad como agujas de flexión pueden representar un peligro.</li>
		<li>Inyectar por vía intravenosa 200 μL en la vena de la cola. El líquido debe fluir fácilmente y eliminar temporalmente la vena. PRECAUCIÓN: No fuerce el líquido en si encuentra resistencia. Esto es signo de mala colocación de la aguja.</li>
		<li>Permiten el anticuerpo a circular durante 5 minutos antes humanamente euthanizing ratón.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. corazón de aislamiento y la digestión
<ol><li>
Eutanasia a ratones con CO2 o por cualquier otro procedimiento de eutanasia institucionalmente aceptado.
	<ol>
<li>Eutanasia de CO2 , coloque el ratón en la cámara de CO2 y la tasa de utilización a 20% del volumen por minuto (es decir, si la cámara es de 10 L, llenado en 2 L/min). Funcionar durante 2 min y monitor ratón hasta que ha dejado de respirar.</li>
		<li>Apague el CO2 y dejar el ratón un adicional 1-2 min Asegúrese de que ha dejado de respirar antes de abrir la cámara y realizar un pellizco del dedo del pie para confirmar que el ratón está muerto antes de proceder a procesar el ratón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rocíe el ratón con etanol al 70%. Levante la piel en el abdomen y diseccionar el ratón cortando a lo largo del principio de la línea media ventral a nivel de las caderas hasta el esternón. Abrir el abdomen y mover el hígado para exponer el diafragma.</li>
	<li>
Cortar el diafragma y las costillas en ambos lados de la línea media, siendo cuidadoso para evitar pinchar los pulmones y el corazón.
	<ol>
<li>Exponer el corazón por peeling espalda las costillas, luego corte primero las aurículas izquierdas seguidas de la aurícula derecha. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al cortar las aurículas, asegurando arterias ni venas no se lesionan, como esto puede disminuir la eficacia del lavado de la sangre contenida en los órganos.</li>
		<li>Inundar el corazón con 15 – 20 mL de PBS frío utilizando una jeringa de 60 mL con una aguja de 21 G y PBS frío. Suavemente Sujete la base del corazón con unas pinzas e Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo cerca del ápice. Repita el procedimiento en el ventrículo derecho. Una correcta inyección resulta en blanco pulmones y hígado pálido. Nota: La perfusión debe realizarse en 5 minutos después de la eutanasia para evitar la coagulación de la sangre, que puede contaminar los órganos de interés con las células circulantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sostenga la base del corazón con unas pinzas y suavemente tire el corazón, luego separar el corazón mediante la reducción de las principales arterias pulmonares y las venas, aorta y el saco pericárdico.
	<ol>
<li>Limpiar el corazón sosteniendo suavemente el corazón entre los dedos del índice y el pulgar en una toalla de papel limpio libre de pelusas y extraiga las aurículas y los restos de las arterias principales y venas y otros contaminantes con el fórceps. Nota: Asegúrese de retira la totalidad de las aurículas y no otros tejidos como el pulmón o los vasos sanguíneos, están presentes como estos tejidos tienen sus propias células inmunes residentes. En particular, el pulmón tiene una población grande de la célula inmune que puede enmascarar a las poblaciones más pequeñas de ésos dentro del miocardio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloque el corazón en un recipiente plástico de 5 cm con 50 μl de PBS frío.
	<ol>
<li>Picar el corazón usando tijeras disección curvas hasta que no hay piezas visibles y tiene una consistencia suave. Nota: Trate de mantener el corazón en un área de contenido del plato en picar para minimizar la pérdida de tejido.</li>
		<li>Transferencia de tejido de thetrituratedheart usando fórceps curvado en el tubo de microcentrífuga de 2 mL con de 800 μl frío Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Añadir 450 U/mL ofcollagenase I, 60 U/mL de hialuronidasa tipo I-S y 60 U/mL de DNasa-I para cada muestra.
	<ol>
<li>Incubar las muestras a 37 ° C en un agitador oscilante a 50 rpm durante 45 – 60 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Después de la digestión, brevemente muestras de vórtice (20 s) y colocar inmediatamente en hielo para mantener las muestras a 4 ° C.
	<ol>
<li>Utilizando una pipeta de 1 mL, pipetear las muestras hacia arriba y hacia abajo hasta que las muestras de tejido son homogéneas y no obstruir la punta de la pipeta. Nota: Definir un número específico de veces para pipeta puede aumentar la reproducibilidad. Si el corazón no se digiere óptimamente, piezas del miocardio pueden obstruir la pipeta. Pulir suavemente la punta de la pipeta contra el tubo de microcentrífuga ayudará a homogeneizar los trozos más grandes de tejido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Humedezca previamente un filtro de celular de 40 μm a un tubo cónico de 50 mL con 1 mL de frío HBB.
	<ol>
<li>Añada la muestra homogeneizada en el filtro y lavar a través vertiendo lentamente 12 – 14 mL de frío HBB.</li>
		<li>Transferencia de muestras de filtrado a un tubo cónico de 15 mL con y guardar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire de sobrenadante.
	<ol>
<li>Lyse células de sangre rojas añadiendo 1 mL de tampón de lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) para cada muestra. Resuspender las muestras con un vórtex e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Una vez que ha completado la lisis, agregar 5 – 8 mL de frío de Hank balanceado sal solución (HBSS) para detener la hemólisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar las muestras a gfor 400 x 5 min a 4 ° C. Aspire de sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón FACS a cada muestra y su traslado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con. Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí para un máximo de 2 h con las muestras almacenadas a 4 ° C.</li>
</ol>4. flujo Cytometry de tinción y análisis
<ol><li>
Centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.
	<ol>
<li>Para reducir el atascamiento no específico anticuerpo, diluido 1: 100 anti-CD16/CD32 y bloqueador de monocitos (1:20) (véase Tabla de materiales) que representa el 50 FACS μl por muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Preparar la contabilidad de dilución (1: 250 para cada anticuerpo) del anticuerpo para 50 μl de FACS por muestra. Nota: Un tinte de viabilidad puede incluirse en el cóctel de anticuerpos para excluir las células muertas. Por otra parte, exclusión de tamaño pequeño por análisis de flujo puede ser usado (figura 1C y D).</li>
		<li>Sin lavar, agregar 50 μl de mezcla principal anticuerpo para cada uno de la muestra y mezclar.</li>
		<li>Incubar las muestras a 4 ° C por 30 min en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 600 μl FACS a cada muestra para lavar y centrifugar las muestras a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL FACS. Mantener las muestras a 4 ° C en la oscuridad. Nota: Algunos colorantes de viabilidad, como DAPI, requieren tinción dentro de 10 minutos antes de ejecutar la citometría de flujo.</li>
	<li>Analizar mediante citometría de flujo (ver figuras 1 y 2) dentro de lo próximo 3 h. Si más tiempo es necesario, a corto plazo fijación utilizando un paraformaldehido de baja concentración (0.5 – 1% en PBS) se recomienda para preservar la coloración. Nota: Se recomienda filtrar las muestras por un colador de célula 40 μm antes de análisis de citometría de flujo iniciar para evitar la obstrucción de los fluidos de la citometría de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+Immunopathology+Research%22%5BJournal%5D)">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814(2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25349429">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24675722 ">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
<li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD103%28%2B%29+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li>
<li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+migration+of+effector+CD8%2B+T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li>
<li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+CD103%2B+dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha%2B+conventional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inflamación miocardio o la miocarditis, es una característica de las enfermedades cardiovasculares más. Sin embargo, el miocardio no está desprovista de sus propios componentes inmunes en Estados no patológicos. Durante el estado estacionario, muchas células inmunes residen en el miocardio y desempeñan las funciones esenciales de mantenimiento y protección. La caracterización de estas diversas poblaciones de células no habría sido posible sin métodos como la que se presenta en el presente Protocolo.
<p class="jove_co...

Diferentes formas de estrés miocárdico o lesiones, incluyendo isquémico (isquemia reperfusión o infarto de miocardio) y no isquémica (hipertensión o miocarditis), promover el reclutamiento de células inflamatorias con reparadora y protectora, sino también propiedades patógenas. Ya en 1891, Romberg describió por primera vez la presencia de infiltrados celulares en el miocardio de pacientes infectados por el tifus y la fiebre escarlata1. Sin embargo, el estudio detallado de las células inmunes cardiacas requiere el desarrollo de las técnicas más avanzadas de immunophenotyping. En consecuencia, sólo recientemente hemos empezado a entender que una población diversa de células inmunes con papeles de mantenimiento esencial durante el estado estacionario en el miocardio.
La histología ha sido y sigue siendo, el método más común para caracterizar a las células inmunes cardiacas durante la inflamación. Sin embargo, mientras que la histología representa una valiosa herramienta de diagnóstico, su uso en el estudio de las células inmunes cardiacas tiene limitaciones importantes. Las células inmunes que reside en el miocardio representan una proporción muy pequeña de las células totales y son más o menos uniformemente distribuidas en un espacio proporcionalmente enorme. Del mismo modo, varias formas de inflamación cardiaca, como la miocarditis viral, muestran patrones focal de inflamación. Esto significa que un análisis minucioso del sistema inmune del corazón requieren a menudo grados más altos de toma de muestras histológicas, aumentando el costo para reducir el sesgo. Por otra parte, la histología proporciona una cantidad muy limitada de información útil en la identificación de la célula (por ejemplo, el número de parámetros). Con un creciente número de subconjuntos de la célula que requieren la utilización de múltiples marcadores de expresión (incluyendo marcadores de superficie, factores de transcripción o moléculas secretadas), citometría de flujo se ha consolidado como la herramienta más potente para Inmunofenotipificación, debido al bajo costo y alto rendimiento.
El uso de técnicas de immunophenotyping depende estrechamente en el desarrollo de protocolos de digestión eficiente que permitió para el análisis de células individuales de un gran número de células. El desarrollo de exhaustivos protocolos de extracción de la célula abre una nueva ventana de oportunidades en el estudio de la inmunología cardiaca. A través de la combinación de digestión, citometría de flujo y la transcriptómica, las principales poblaciones de macrófagos y células dendríticas que residen en el corazón han sido caracterizados2,3. La población más abundante de las células inmunes cardiacas durante el estado estacionario son CD64++ de MerTK los macrófagos, que pueden dividir más a fondo en su expresión de CCR2 o CD11c2base. CCR2+ macrófagos se originan de la hematopoyesis de la médula ósea adulta, mientras que la mayoría de CCR2 los macrófagos– , que pueden expresar altos o bajos niveles de MHC-II, son principalmente de origen prenatal. Los macrófagos realizan funciones claves como reparación4 y retiro de escombros5 lesiones o apoyando la conectividad eléctrica6 en estado estacionario. Durante diferentes formas de la inflamación se producen una importante afluencia de Ly6CHola MHC-IIlo CD64int monocitos, que más tarde se diferencian en Ly6CHola CCR2+ los macrófagos2,7 . Una población perceptiblemente más pequeña, pero importante, de las células que residen en el miocardio de los individuos sanos se compone de células dendríticas8,9. Los dos subconjuntos principales de DCs convencionales cardiacas (CDC) se han caracterizado recientemente: cDC1 (CD103+ DCs) y cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempeñan papeles importantes en la defensa contra la infección8 pero también pueden promover uno mismo-lesión durante la inflamación, particularmente durante el infarto de miocardio9.
Aquí, describimos un método simple para el aislamiento de las células inmunes cardíacas viables de miocardio de ratón. El método combina la digestión enzimática y mecánica con filtración celular-colador para obtener una suspensión unicelular que puede ser analizada, o más purificada, por clasificación de citometría de flujo o enriquecimiento de grano magnético. Las medidas exactas de células del miocardio extravasculares requieren perfusión cardiaca con el fin de eliminar los posibles contaminantes del torrente sanguíneo de la microcirculación cardiaca. Además, presentamos un paso opcional del etiquetado intravascular de células inmunes que pueden utilizarse para distinguir aún más células del miocardio de contaminantes intravasculares, basados en el Galkina et al protocolo10. Por último, presentamos un análisis de citometría de flujo básico para identificar las principales subpoblaciones de macrófagos y cDC.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Aguja PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vacío, 0,2 &micro; m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc jeringa de insulina</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM con 4,5 g/L de glucosa y L-glutamina y piruvato de sodio</td></tr><tr><td>colagenasa I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>de Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hialuronidasa tipo I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNasa-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>de páncreas bovino</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 y micro; m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK)</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-ratón/humano CD11b Biolegend</td><td></td><td>101222</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-ratón Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>APC anti-ratón CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-ratón CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>PE anti-ratón Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td> 1<td>:250 dilución</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-ratón I-Ab Biolegend</td><td></td><td>116422</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>FITC anti-ratón CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-ratón CD45 Biolegend</td><td></td><td>103113</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-ratón CD45 Biolegend</td><td></td><td>103132</td><td>dilución 1:40</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-ratón CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>dilución 1:100</td></tr><tr><td>Bloqueador de monocitos True-Stain Biolegend</td><td></td><td>426101</td><td>dilución 1:20</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Ratón: Batf3-/-</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento e identificación de las células inmunes extravascular del corazón

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

El sistema inmune es un componente esencial de un corazón sano. El miocardio es hogar de una rica población de subconjuntos diferentes de célula inmune con compartimentación funcional durante el estado estacionario y durante diferentes formas de la inflamación. Hasta hace poco, el estudio de las células inmunes en el corazón requiere el uso de la microscopía o protocolos de digestión mal desarrollados, que proporcionaron suficiente sensibilidad durante la inflamación severa pero no pudieron con confianza identifican pequeños — pero clave — las poblaciones de células durante el estado estacionario. Aquí, discutimos una combinación simple método enzimático (colagenasa, hialuronidasa y ADNasa) y digestión mecánica de corazones murino precedido por la administración intravascular de anticuerpos fluorescente etiquetado para diferenciar pequeños pero inevitable contaminantes intravascular de la célula. Este método genera una suspensión de células viables aisladas que pueden ser analizadas por citometría de flujo para identificación, phenotyping y cuantificación, o más purificado con clasificación celular activado por fluorescencia o la separación magnética de grano para transcripcionales estudios análisis o in vitro . Incluimos un ejemplo de un análisis de citometría de flujo de paso a paso para distinguir las poblaciones de células dendríticas del corazón y macrófagos clave. Para un experimento de tamaño medio (10 corazones) la terminación del procedimiento requiere de 2-3 h.

Hasta la fecha, ningún buen método ha sido diseñado para aislar las células inmunes de otras componentes de la célula cardiaca, como cardiomiocitos. Por lo tanto, el análisis de la suspensión de la célula cardiaca mediante citometría de flujo requiere la sincronización con CD45 para identificar las poblaciones de células inmunitarias, seguidas por celular único y pequeño tamaño exclusión bloquea (figura 1A). Alternativamente, una tinción de v...

Este protocolo presenta un método sencillo y eficaz para aislar, identificar y cuantificar las células inmunes que reside en el miocardio de ratones durante el estado estacionario o inflamación. El protocolo combina la digestión enzimática y mecánica para la generación de una suspensión unicelular que puede ser más analizada por citometría de flujo.

Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición de los subconjuntos de células inmunitarias dentro del corazón, tanto durante los estados estables como durante los estados de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para el inmunofenotipado preciso de poblaciones de células inmunitarias cardíacas, incluidos subconjuntos muy raros. Este protocolo es relativamente simple.Sin embargo, las inyecciones en las venas de la cola pueden ser difíciles, por lo que es importante practicar esta técnica hasta que se sienta cómodo antes de usar animales de experimentación. Para etiquetar los leucocitos circulantes, cargue 200 microlitros de anticuerpo anti-CD45 conjugado con fluoróforos de ratón recién preparado en PBS en una jeringa de insulina de calibre 28,5 y precaliente a ocho ratones de 12 semanas de edad en una manta de agua circulante configurada a 35 a 41 grados Celsius durante cinco a diez minutos. Cuando la vena de la cola se haya dilatado, sujete al primer animal en posición esternal, con un dispositivo de sujeción adecuado.Si las venas de la cola no están lo suficientemente dilatadas, sumerja la cola en agua de 36 a 40 grados centígrados durante uno o dos minutos. Cuando las venas de la cola estén listas, frote el área de inyección con una gasa empapada en etanol al 70% e inmovilice la base de la cola con los dedos índice y medio, y la región medio-distal de la cola con el pulgar y el dedo anular. Sosteniendo la aguja con el lado biselado hacia arriba y paralela a la vena, inserte la aguja en una vena de cola dilatada e inyecte por vía intravenosa todo el volumen de anticuerpo.Luego, permita que el anticuerpo circule durante cinco minutos antes de la eutanasia humanitaria. Para extraer el corazón, rocíe el ratón con etanol al 70% y levante la piel del abdomen para abrir el abdomen a lo largo de la línea media ventral desde las caderas hasta el esternón. Abra el peritoneo y mueva el hígado para exponer el diafragma.Corta el diafragma y las costillas a ambos lados de la línea media, teniendo cuidado de no perforar los pulmones y el corazón. Pela las costillas para exponer el corazón antes de hacer una incisión en las aurículas izquierda y derecha. Agarrando suavemente la base del corazón con fórceps, inserte una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de 60 mililitros en el ventrículo izquierdo cerca del ápice y perfunda el corazón con 15 a 20 mililitros de PBS frío.La correcta perfusión del corazón es esencial para evitar contaminantes intravasculares. Por lo tanto, tenga cuidado de diseccionar y perfundir el corazón rápidamente después de la eutanasia para evitar la contaminación debida a la sangre coagulada. Después de la perfusión del ventrículo derecho, como se acaba de demostrar, se deben observar pulmones blancos y un hígado pálido.Sosteniendo la base del corazón con las pinzas, tire suavemente del corazón hacia arriba y corte las arterias y venas pulmonares principales, la aorta y el saco pericárdico para separar el tejido cardíaco. Sosteniendo suavemente el corazón entre los dedos pulgar e índice, limpie cuidadosamente el corazón con una toalla de papel limpia y sin pelusa y use las pinzas para eliminar las aurículas y cualquier resto de arterias y venas principales u otros contaminantes. Coloque el corazón limpio en un plato de plástico de cinco centímetros y agregue 50 microlitros de PBS frío.Con unas tijeras de disección curvas, pica el corazón hasta que no queden trozos visibles y el tejido tenga una consistencia lisa y espesa. Utilice pinzas curvas para transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de dos mililitros que contienen 800 microlitros de DMEM frío. Suplementar con colagenasa, DNasa e hialuronidasa e incubar durante 45 a 60 minutos a 37 grados centígrados y 50 rpm.Al final del vórtice de digestión, tome muestras durante 20 segundos e inmediatamente colóquelas en hielo. La muestra siempre debe mantenerse a cuatro grados centígrados, a menos que se especifique lo contrario, ya que algunos antígenos de superficie pueden internalizarse si se dejan a temperatura ambiente. A continuación, humedece previamente un filtro de células de 140 microlitros en un tubo cónico de 50 mililitros por muestra con un mililitro de HBB frío.Con una pipeta de un mililitro, pipetee las muestras hasta que las suspensiones de tejido sean homogéneas y no obstruyan la punta de la pipeta y añada las muestras homogeneizadas a los filtros. Lave lentamente las muestras a través de los filtros con 12 a 14 mililitros de HBB frío por muestra y transfiera las muestras filtradas a un tubo cónico de 15 mililitros marcado con hielo. Una buena digestión se demuestra por la ausencia de restos de corazón en el filtro.Recoger las muestras por centrifugación y eliminar el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio a cada muestra. Vuelva a suspender las muestras con un breve vórtice, seguido de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.A continuación, detenga la hemólisis con cinco a ocho mililitros de HBSS frío. Recoja las muestras por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de clasificación celular activada por fluorescencia o tampón FACS y transfiéralos a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para otra centrifugación. Para analizar las muestras por citometría de flujo, resuspender los pellets en 50 microlitros de anticuerpo anti-CD16/CD32 y un bloqueador de monocitos para reducir la unión de anticuerpos inespecíficos para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.Sin lavar, agregue 50 microlitros de mezcla maestra de anticuerpos a cada muestra con mezcla para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados protegida de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con 600 microlitros de tampón FACS por tubo y resuspender los gránulos en 300 microlitros de tampón FACS fresco o paraformaldehído al 1%. A continuación, analice los leucocitos cardíacos mediante citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de flujo.El análisis de la suspensión cardíaca de una sola célula mediante citometría de flujo requiere una activación previa con CD45 para diferenciar las células inmunitarias de las células no inmunitarias del corazón, seguida de una sola célula y una compuerta de exclusión de tamaño pequeño. Los macrófagos, identificados por su expresión de CD64, son la principal población de células inmunitarias del corazón, representando entre el 60 y el 70% de todas las células inmunitarias. Las células dendríticas cardíacas convencionales son células CD64 negativas que expresan altos niveles de MHC clase II y CD11c.Estas células se pueden dividir aún más en función de su expresión de CD103 o CD11b y representan una subpoblación cardíaca mucho más pequeña en comparación con los macrófagos. El uso de la citometría de flujo de una suspensión unicelular de miocardio permite el estudio de pequeñas subpoblaciones de leucocitos dentro del corazón. Por ejemplo, utilizando el análisis de citometría de flujo para comparar las células inmunitarias del miocardio de tipo salvaje con las de ratones deficientes en Batf3, se puede confirmar la falta de células dendríticas CD103 positivas dentro de los animales knockout.Además, este análisis reveló una falta de alteración significativa de la composición de otras poblaciones cardíacas en los animales deficientes en Batf3, lo que demuestra el grado de sensibilidad que se puede lograr utilizando este método combinado de digestión enzimática y mecánica para lograr una suspensión de una sola célula. Al intentar este procedimiento, es importante tener siempre en cuenta la viabilidad de su célula aislada. Por lo tanto, recomendamos optimizar el tiempo y la concentración de enzimas de la digestión de acuerdo con sus condiciones experimentales.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de ARN de una sola célula, ensayos funcionales y aislamiento magnético de perlas para responder preguntas adicionales sobre las funciones de las células aisladas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este método para aislar células del sistema inmune funcional del corazón es una alternativa a los métodos convencionales de digestión de colagenasa, que provoca la activación de células inmunes no deseadas, lo que resulta en una disminución de la respuesta de estas células. Nuestro método de aislamiento de los rendimientos de las células inmunes funcional cardiaca, evitando los problemas asociados con la digestión enzimática.

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El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

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En este artículo, se proporciona un método para aislar células estromales mesenquimales cardiacas de endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica. Su caracterización y el protocolo para impulsar su diferenciación adipogenic se describen.

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Aquí se presenta un protocolo para aislar varios subconjuntos de macrófagos y otras células no inmunes del miocardio humano y de ratón mediante la preparación de una suspensión de una sola célula a través de la digestión enzimática. También se presentan esquemas de gating para la identificación basada en citometría de flujo y la caracterización de macrófagos aislados.

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El objetivo de este trabajo es desarrollar un método para aislar reproduciblemente los cardiomiocitos del corazón adulto y medir el contenido de ADN y la nucleación.

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El protocolo presentado aquí proporciona un enfoque paso a paso para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de la región del nodo sinoauricular (SAN) y el nodo auriculoventricular (AVN) de corazones de ratón.

Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.

Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas

Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.

Microdisección y tinción con inmunofluorescencia de mangas miocárdicas en venas pulmonares murinas

Este estudio ha establecido un método estable y eficiente para el aislamiento, cultivo y determinación funcional de células madre CD34+ residentes en la pared vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de aislamiento fácil de seguir y eficaz en el tiempo puede ser utilizado por otros investigadores para estudiar los posibles mecanismos implicados en las enfermedades cardiovasculares.

Aislamiento inmunomagnético de células madre CD34+ residentes en la pared vascular de ratones

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