Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición de los subconjuntos de células inmunitarias dentro del corazón, tanto durante los estados estables como durante los estados de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para el inmunofenotipado preciso de poblaciones de células inmunitarias cardíacas, incluidos subconjuntos muy raros. Este protocolo es relativamente simple.

Sin embargo, las inyecciones en las venas de la cola pueden ser difíciles, por lo que es importante practicar esta técnica hasta que se sienta cómodo antes de usar animales de experimentación. Para etiquetar los leucocitos circulantes, cargue 200 microlitros de anticuerpo anti-CD45 conjugado con fluoróforos de ratón recién preparado en PBS en una jeringa de insulina de calibre 28,5 y precaliente a ocho ratones de 12 semanas de edad en una manta de agua circulante configurada a 35 a 41 grados Celsius durante cinco a diez minutos. Cuando la vena de la cola se haya dilatado, sujete al primer animal en posición esternal, con un dispositivo de sujeción adecuado.

Si las venas de la cola no están lo suficientemente dilatadas, sumerja la cola en agua de 36 a 40 grados centígrados durante uno o dos minutos. Cuando las venas de la cola estén listas, frote el área de inyección con una gasa empapada en etanol al 70% e inmovilice la base de la cola con los dedos índice y medio, y la región medio-distal de la cola con el pulgar y el dedo anular. Sosteniendo la aguja con el lado biselado hacia arriba y paralela a la vena, inserte la aguja en una vena de cola dilatada e inyecte por vía intravenosa todo el volumen de anticuerpo.

Luego, permita que el anticuerpo circule durante cinco minutos antes de la eutanasia humanitaria. Para extraer el corazón, rocíe el ratón con etanol al 70% y levante la piel del abdomen para abrir el abdomen a lo largo de la línea media ventral desde las caderas hasta el esternón. Abra el peritoneo y mueva el hígado para exponer el diafragma.

Corta el diafragma y las costillas a ambos lados de la línea media, teniendo cuidado de no perforar los pulmones y el corazón. Pela las costillas para exponer el corazón antes de hacer una incisión en las aurículas izquierda y derecha. Agarrando suavemente la base del corazón con fórceps, inserte una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de 60 mililitros en el ventrículo izquierdo cerca del ápice y perfunda el corazón con 15 a 20 mililitros de PBS frío.

La correcta perfusión del corazón es esencial para evitar contaminantes intravasculares. Por lo tanto, tenga cuidado de diseccionar y perfundir el corazón rápidamente después de la eutanasia para evitar la contaminación debida a la sangre coagulada. Después de la perfusión del ventrículo derecho, como se acaba de demostrar, se deben observar pulmones blancos y un hígado pálido.

Sosteniendo la base del corazón con las pinzas, tire suavemente del corazón hacia arriba y corte las arterias y venas pulmonares principales, la aorta y el saco pericárdico para separar el tejido cardíaco. Sosteniendo suavemente el corazón entre los dedos pulgar e índice, limpie cuidadosamente el corazón con una toalla de papel limpia y sin pelusa y use las pinzas para eliminar las aurículas y cualquier resto de arterias y venas principales u otros contaminantes. Coloque el corazón limpio en un plato de plástico de cinco centímetros y agregue 50 microlitros de PBS frío.

Con unas tijeras de disección curvas, pica el corazón hasta que no queden trozos visibles y el tejido tenga una consistencia lisa y espesa. Utilice pinzas curvas para transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de dos mililitros que contienen 800 microlitros de DMEM frío. Suplementar con colagenasa, DNasa e hialuronidasa e incubar durante 45 a 60 minutos a 37 grados centígrados y 50 rpm.

Al final del vórtice de digestión, tome muestras durante 20 segundos e inmediatamente colóquelas en hielo. La muestra siempre debe mantenerse a cuatro grados centígrados, a menos que se especifique lo contrario, ya que algunos antígenos de superficie pueden internalizarse si se dejan a temperatura ambiente. A continuación, humedece previamente un filtro de células de 140 microlitros en un tubo cónico de 50 mililitros por muestra con un mililitro de HBB frío.

Con una pipeta de un mililitro, pipetee las muestras hasta que las suspensiones de tejido sean homogéneas y no obstruyan la punta de la pipeta y añada las muestras homogeneizadas a los filtros. Lave lentamente las muestras a través de los filtros con 12 a 14 mililitros de HBB frío por muestra y transfiera las muestras filtradas a un tubo cónico de 15 mililitros marcado con hielo. Una buena digestión se demuestra por la ausencia de restos de corazón en el filtro.

Recoger las muestras por centrifugación y eliminar el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio a cada muestra. Vuelva a suspender las muestras con un breve vórtice, seguido de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, detenga la hemólisis con cinco a ocho mililitros de HBSS frío. Recoja las muestras por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de clasificación celular activada por fluorescencia o tampón FACS y transfiéralos a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para otra centrifugación. Para analizar las muestras por citometría de flujo, resuspender los pellets en 50 microlitros de anticuerpo anti-CD16/CD32 y un bloqueador de monocitos para reducir la unión de anticuerpos inespecíficos para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.

Sin lavar, agregue 50 microlitros de mezcla maestra de anticuerpos a cada muestra con mezcla para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados protegida de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras con 600 microlitros de tampón FACS por tubo y resuspender los gránulos en 300 microlitros de tampón FACS fresco o paraformaldehído al 1%. A continuación, analice los leucocitos cardíacos mediante citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de flujo.

El análisis de la suspensión cardíaca de una sola célula mediante citometría de flujo requiere una activación previa con CD45 para diferenciar las células inmunitarias de las células no inmunitarias del corazón, seguida de una sola célula y una compuerta de exclusión de tamaño pequeño. Los macrófagos, identificados por su expresión de CD64, son la principal población de células inmunitarias del corazón, representando entre el 60 y el 70% de todas las células inmunitarias. Las células dendríticas cardíacas convencionales son células CD64 negativas que expresan altos niveles de MHC clase II y CD11c.

Estas células se pueden dividir aún más en función de su expresión de CD103 o CD11b y representan una subpoblación cardíaca mucho más pequeña en comparación con los macrófagos. El uso de la citometría de flujo de una suspensión unicelular de miocardio permite el estudio de pequeñas subpoblaciones de leucocitos dentro del corazón. Por ejemplo, utilizando el análisis de citometría de flujo para comparar las células inmunitarias del miocardio de tipo salvaje con las de ratones deficientes en Batf3, se puede confirmar la falta de células dendríticas CD103 positivas dentro de los animales knockout.

Además, este análisis reveló una falta de alteración significativa de la composición de otras poblaciones cardíacas en los animales deficientes en Batf3, lo que demuestra el grado de sensibilidad que se puede lograr utilizando este método combinado de digestión enzimática y mecánica para lograr una suspensión de una sola célula. Al intentar este procedimiento, es importante tener siempre en cuenta la viabilidad de su célula aislada. Por lo tanto, recomendamos optimizar el tiempo y la concentración de enzimas de la digestión de acuerdo con sus condiciones experimentales.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de ARN de una sola célula, ensayos funcionales y aislamiento magnético de perlas para responder preguntas adicionales sobre las funciones de las células aisladas.