Descelularización de todo humano corazón dentro de una bolsa presurizada en una orientación invertida
26 de noviembre de 2018
Este método permite la descelularización de un órgano sólido complejo utilizando un protocolo simple basado en choque osmótico y perfusión de detergente iónico con una interrupción mínima del órgano matriz. Se compone de una técnica de descelularización novela para los corazones humanos dentro de una bolsa presurizada con monitoreo en tiempo real de flujo dinámica y celulares residuos de la salida.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la generación de andamios vascularizados, que son realmente el Santo Grial del campo de la ingeniería de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es que una bolsa presurizada en una orientación invertida mejora la descelularización de los órganos humanos no trasplantables y nos permite hacerlo de forma estéril en un marco de tiempo adecuado. Para preparar el corazón para la descelularización, primero realice una inspección interna para posibles defectos.
Si hay un defecto septal, corrija el defecto con las suturas apropiadas. A continuación, ligar los cavas de vena superior e inferior con sutura de seda 2-0. Suturar la pared de la aurícula derecha con 5-0 PROLENE, y diseccionar la aorta lejos de la arteria pulmonar principal para la posterior cánula.
Inserte los conectores, según el diámetro del recipiente, en la aorta y la arteria pulmonar, y fije los conectores con suturas de seda 2-0. Usando uno de los orificios de la vena pulmonar, inserte una línea de tubo a través de la aurícula izquierda hacia el ventrículo izquierdo, y conecte una línea de perfusión al conector en la aorta y una línea de salida al conector en la arteria pulmonar. Coloque el corazón preparado en una bolsa de poliéster en la orientación invertida y coloque la bolsa en un recipiente de perfusión.
Conecte cada una de las líneas a los puertos respectivos en el tapón de goma, según el diámetro del recipiente, e inserte el tapón en la tapa del recipiente de perfusión para sellar la bolsa de poliéster. A continuación, perfunda PBS a través del puerto de infusión del tapón de goma para verificar la salida de la arteria pulmonar y de la línea insertada en el ventrículo izquierdo, utilizando este flujo para limpiar el órgano de cualquier rastro residual de sangre dentro de la vasculatura. Cuando el corazón esté listo, coloque el biorreactor montado en orientación vertical y conecte la línea de perfusión, la línea de la cabeza de presión, la línea de salida de la arteria pulmonar y la línea de drenaje del biorreactor a los puertos de la superficie de la tapa de goma en la parte superior del biorreactor de perfusión.
Luego, descelularizar el corazón durante cuatro horas con solución hipertónica, dos horas con solución hipotónica, 120 horas con dodecil sulfato de sodio, o SDS, y un lavado final con 120 litros de PBS, todo bajo constante 120 milímetros de presión de mercurio medida en la raíz aórtica. Durante los últimos 10 litros del lavado PBS, añadir 500 mililitros de solución estéril de ácido peracético al 2,1% neutralizado con 10 hidróxido de sodio normal a la solución de perfusión para esterilizar el andamio. Típicamente, el caudal en la aorta durante el proceso de descelularización disminuye gradualmente a medida que la solución de perfusión cambia de hipertónico a hipotónico.
Por el contrario, el caudal aumenta cuando la solución de perfusión se cambia de una solución hipotónica a SDS, momento en el que el caudal de perfusión muestra fluctuaciones. La tasa de salida de la arteria pulmonar demuestra una tendencia similar con las soluciones hiper e hipotónicas. Sin embargo, la tasa de salida durante la perfusión SDS presenta una disminución general.
La eficiencia de perfusión coronaria también disminuye con el tiempo a medida que los diferentes reactivos se perfunde a través de la vasculatura. A medida que la salida se perfunde de la arteria pulmonar y el ventrículo izquierdo se recogen simultáneamente, su contenido de escombros se puede comparar por espectroscopia. La turbidez del efluente de ambos vasos disminuye con el tiempo durante las perfusiones, aunque la turbidez de la arteria pulmonar presenta un cambio de color más abrupto en comparación con el observado desde el ventrículo izquierdo durante el período de perfusión inicial.
La evaluación de la correlación entre la turbidez de salida y los desechos celulares mediante un ensayo de proteína de ácido bicinchonínico de seis corazones humanos decelularizados revela una correlación lineal entre la concentración de proteínas y la turbidez del efluente. Al intentar este procedimiento, es importante monitorear el caudal y recoger el perfuso periódicamente para monitorear realmente el proceso de perfusión. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otras técnicas como la evaluación mecánica o las pruebas de esterilidad para evaluar la fidelidad del andamio y su uso potencial para la recelularización para generar un tejido cardíaco funcional.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos exploraran la generación de órganos vascularizados enteros, cambiando literalmente el campo del trasplante de órganos sólidos. No olvide que trabajar con órganos y tejidos humanos y productos químicos como SDS puede ser extremadamente peligroso, y siempre usar equipos de protección personal adecuados al emprender este procedimiento.
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Descripción general
Este método permite la descelularización de órganos sólidos complejos, específicamente corazones humanos, mediante un protocolo sencillo que minimiza la alteración de la matriz del órgano. La técnica emplea una bolsa presurizada para el monitoreo en tiempo real de la dinámica del flujo y la salida de restos celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos
- Descelularización de órganos
- Investigación cardiovascular
Antecedentes
- La descelularización es fundamental para crear andamiajes vascularizados en ingeniería de tejidos.
- Los métodos actuales suelen alterar la matriz del órgano.
- Se necesitan técnicas mejoradas para órganos humanos no trasplantables.
- La monitorización en tiempo real puede mejorar el proceso de descelularización.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica novedosa de descelularización para corazones humanos.
- Mejorar la esterilidad y eficiencia del proceso de descelularización.
- Facilitar la generación de andamiajes vascularizados.
Métodos Utilizados
- Inspección interna del corazón en busca de defectos.
- Corrección de los defectos septales mediante suturas.
- Ligadura de las venas cavas superior e inferior.
- Diseción de la aorta para la canulación.
Resultados principales
- La bolsa presurizada mejora la eficiencia de la descelularización.
- El monitoreo en tiempo real permite un mejor control del proceso.
- Se logró una mínima alteración de la matriz del órgano.
- El método es aplicable en un entorno estéril.
Conclusiones
- Esta técnica representa un avance significativo en la descelularización de órganos.
- Tiene potencial para futuras aplicaciones en ingeniería de tejidos.
- Investigaciones futuras podrían ampliar su uso a otros tipos de órganos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La descelularización de corazones humanos completos mediante una bolsa presurizada en orientación invertida permite la generación de andamiajes vascularizados para la ingeniería de tejidos cardíacos, abordando la necesidad crítica de órganos trasplantables. Este método posibilita la reducción predictiva de riesgos al preservar la arquitectura de la matriz extracelular y permitir el monitoreo en tiempo real de la dinámica de perfusión, lo cual informa sobre la calidad del andamiaje y su potencial de recelularización. Esto sitúa a la técnica como una capacidad fundamental para impulsar el desarrollo de corazones bioartificiales y reducir la dependencia de órganos donados.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la composición de la matriz extracelular cardíaca y la arquitectura vascular para la validación de dianas en terapias contra la insuficiencia cardíaca.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma de andamio reproducible para estudios mecanicistas de las interacciones célula-matriz en tejidos sanos frente a enfermos.
Desarrollo de Pruebas y Selección
- Valor científico: Genera andamios estandarizados derivados de humanos para la evaluación cuantitativa del sembrado celular, la proliferación y la integración funcional en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Facilita la disponibilidad del ensayo mediante métricas de turbidez y correlación de proteínas en tiempo real que permiten el control del proceso y la consistencia entre lotes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la continuidad traslacional al proporcionar un andamiaje cardíaco humano relevante para la enfermedad, útil para evaluar estrategias de recelularización y maduración electromecánica.
- Valor operativo: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante el análisis correlativo de la turbidez del efluente y la eliminación de restos celulares como indicador de control de calidad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, al proporcionar una plataforma de andamio vascularizado de origen humano.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre dianas en la matriz extracelular cardíaca y la aclaración de vías mediante la preservación de la arquitectura tisular nativa.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante la correlación cuantificable de la turbidez del efluente y del ensayo proteico con ácido bicinconínico para monitorear la eficiencia de la descelularización.
- Análisis: Proporciona resultados cuantificables, incluyendo dinámicas del flujo, gradientes de presión y perfiles de salida de residuos, que orientan la optimización del proceso y las decisiones de continuidad o interrupción.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar un andamio adecuado para la recelularización y la evaluación funcional en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable de generación de andamios aplicable en múltiples programas de reparación y regeneración cardíaca.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la fidelidad del andamiaje mediante la preservación de la matriz extracelular tridimensional y de las vasculaturas, lo que reduce la ambigüedad mecanicista en la ingeniería de tejidos cardíacos.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad logradas mediante un sistema de bolsa presurizada que permite la descelularización estéril y monitorizada durante períodos prolongados.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción basadas en el monitoreo en tiempo real del flujo de perfusión y en métricas de eliminación de residuos, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas de las carteras de medicina regenerativa.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de candidatos a andamiaje mediante la correlación cuantitativa entre turbidez y proteína como criterio de liberación para los flujos de trabajo de recelularización.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en perfusión de órganos, manipulación de reactivos para descelularización y procesamiento estéril de tejidos.
- Depende de una infraestructura de biorreactores de perfusión capaz de mantener una presión constante de 120 mmHg y permitir el intercambio de múltiples soluciones de reactivos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos para la recolección del efluente, espectroscopía y ensayos de proteínas, a fin de evaluar de manera consistente la calidad del andamiaje.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes tamaños de órganos y arquitecturas vasculares al extenderse más allá de los corazones humanos.
- Comprende limitaciones prácticas relacionadas con los riesgos de exposición a reactivos (por ejemplo, SDS, ácido peracético) que requieren estrictos protocolos de equipo de protección personal (PPE) y contención.
