Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas

Este método combina enfoques bioquímicos y conductuales para ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre el impacto de un desafío agudo con quinurenina en ratas. La principal ventaja de la técnica es que proporciona un método fiable y consistente para la medición de los metabolitos de la vía de la quinurenina en el cerebro y el plasma de ratas. Carly Fabian, estudiante asistente de investigación de mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

En el punto final experimental apropiado después de la administración de quinurenina intraperitoneal, descongele el plasma recolectado congelado en hielo húmedo y diluya las muestras descongeladas con agua ultrapura. Transfiera 100 microlitros de muestra diluida a recipientes individuales de 25 microlitros de ácido perclórico al 6% y vórtice en centrifugar las muestras. A continuación, transfiera 100 microlitros de sobrenadantes de cada tubo a tubos individuales de microcentrífuga de 250 microlitros para la determinación de quinurenina y ácido quinurénico.

Para la medición de ácido quinurénico a partir de muestras de cerebro, descongele las muestras de cerebro recolectadas congeladas en hielo seco y pese individualmente cada muestra en una balanza analítica precisa. Cuando se hayan pesado todas las muestras, mueva los tubos sobre hielo húmedo y diluya cada muestra de tejido en una proporción de uno a 10 peso por volumen con agua ultrapura, seguida de la homogeneización con un sonicador. Alícuota 100 microlitros de cada lodo de muestra a un tubo nuevo, luego agregue 25 microlitros de ácido perclórico al 25% para vórtice y centrifugación.

A continuación, transfiera 100 microlitros de sobrenadante a tubos individuales de microcentrífuga de 250 microlitros para la determinación del ácido quinurénico. Para preparar la máquina de cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, para el análisis de quinurenina, primero coloque los tubos de admisión de HPLC individuales en la fase móvil, agua ultrapura y recipientes 100% acetonitrilo. A continuación, programe el instrumento para que funcione con un 5 % de acetonitrilo y un 95 % de agua ultrapura a 0,5 mililitros por minuto y deje que la máquina de HPLC funcione durante 20 a 30 minutos.

Cuando se haya alcanzado una presión y una línea de base estables, cambie la composición de la solución a una fase móvil con 5 % de acetonitrilo y 95 % de acetato de sodio y equilibre el instrumento durante otros 30 minutos. Mientras el instrumento se equilibra, encienda la lámpara del detector de fluorescencia. Antes de la derivación, bombee la solución de acetato de zinc por separado a través de una bomba peristáltica que se combine con la columna de poste de fase móvil y encienda la bomba de post-columna a un caudal de 0,1 mililitros por minuto durante unos 20 minutos, hasta que alcance una presión estable de aproximadamente 500 psi.

Cuando el instrumento esté listo para el análisis, configure el software del sistema para controlar los parámetros de la secuencia de muestras y permitir la autoinyección de varias muestras. En la pantalla Ejecutar muestra, haga clic en Archivo" y arrastre hacia abajo hasta Crear nuevo conjunto de muestras (seleccionando Vacío) en la nueva ventana. Enumere individualmente todos los patrones y muestras en el orden en que deben ejecutarse, con los patrones ensayados al principio y al final de la secuencia.

En la columna de funciones, designe los estándares y las muestras y configure el programa para inyectar agua entre cada cinco muestras. Establezca el tiempo de ejecución de cada muestra en 15 minutos e inyecte 20 microlitros de las muestras de los estándares, seguidos de 20 microlitros de las muestras de plasma y 30 microlitros de las muestras de homogeneizado cerebral según sea apropiado experimentalmente. A continuación, ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión según el compuesto que se esté midiendo y ejecute la secuencia.

Para cuantificar los datos, abra la pantalla Examinar proyecto y, en la pestaña Conjuntos de muestras, haga doble clic en el conjunto de muestras que se va a cuantificar. De la lista de inyecciones, resalte todos los estándares y haga clic con el botón derecho para seleccionar Proceso'en la nueva ventana. A continuación, utilice el menú desplegable para seleccionar Calibrar y cuantificar'Resalte todos los patrones de nuevo, haga clic con el botón derecho y seleccione Revisar'Cuando se abran los cromatogramas, integre y calibre cada patrón para generar la curva estándar.

A continuación, vuelva a la pestaña Conjuntos de muestras y haga doble clic en el conjunto de muestras para cuantificar y revisar como se demuestra, integrando y cuantificando cada muestra para generar la concentración de cada muestra en función de la curva estándar creada anteriormente. El análisis por HPLC de muestras de tejido extraídas de animales a los que se les administró quinurenina revela un tiempo de retención de quinurenina de unos seis minutos y un tiempo de retención de ácido quinurénico de unos 11 minutos. La cuantificación de la quinurenina plasmática y el ácido quinurénico del hipocampo revela que la inyección aguda de quinurenina aumenta los niveles de ácido quinurénico en el cerebro, con un pico alcanzado a las dos horas después de la inyección que vuelve a la línea de base a las cuatro horas después de la inyección.

Aunque no se observan diferencias entre los grupos durante los ensayos de entrenamiento con el paradigma de evitación pasiva, los animales de control muestran un aumento significativo en la latencia para entrar en el lado oscuro durante los ensayos de prueba, lo que indica un aprendizaje contextual, mientras que los animales inyectados con quinurenina 24 horas antes no muestran el mismo aumento en la latencia, lo que demuestra un déficit en el aprendizaje. Además, la evaluación del impacto de una elevación aguda de quinurenina durante la fase de luz en la arquitectura de sueño-vigilia indica una reducción en la duración total del sueño con movimientos oculares rápidos durante las dos primeras horas después de la inyección de quinurenina. Estos datos se reflejan en un aumento en la duración de la vigilia durante estos períodos de tiempo y una ligera reducción en el sueño con movimientos oculares no rápidos, lo que demuestra que una elevación aguda de quinurenina también causa alteraciones en la dinámica sueño-vigilia.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del comportamiento, para responder preguntas adicionales sobre el papel de la formación elevada de ácido quinurénico en la modulación de la cognición y el sueño.