Name: Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a medir quinurenina y ácido quinurénico mediante HPLC en ratas para estudiar los efectos de la vía del triptófano en cognición y sueño. Este método combina análisis bioquímico y conductual.

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El presente estudio fue financiado en parte por los institutos nacionales de salud (R01 NS102209) y una donación de la Clare E. Forbes Trust.

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<li>Pocivavsek, A., Rowland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Neuroscience+Illuminates+Causal+Relationship+Between+Sleep+and+Memory%3A+Translating+to+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).</li>
<li>Shibata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorimetric+micro-determination+of+kynurenic+acid%2C+an+endogenous+blocker+of+neurotoxicity%2C+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+consolidation+during+sleep%3A+a+neurophysiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective.</a> Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).</li>
<li>Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+deprivation+selectively+impairs+memory+consolidation+for+contextual+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning.</a> Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para una evaluación confiable de KYNA en el cerebro después de una administración periférica de la quinurenina, es fundamental combinar e interpretar experimentos bioquímicos y funcionales. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite a los usuarios nuevos para establecer métodos eficaces para la medición de la quinurenina de plasma y el cerebro KYNA de ratas. La medición de la quinurenina en plasma confirma la inyección precisa y la medición del metabolito KYNA confirma la síntesis de novo en el cerebro...

El KP es responsable de degradar casi el 95% del aminoácido esencial triptófano1. En el cerebro mamífero, quinurenina en los astrocitos se metaboliza en la molécula pequeña neuroactivos KYNA principalmente por la enzima aminotransferasa (KAT) quinurenina II2. KYNA actúa como un antagonista en los receptores NMDA y α7nACh en el cerebro2,3,4, y también objetivos de señalización como el receptor de hidrocarburo de arilo (AHR) y la proteína G de receptores juntados receptor 35 (GPR35)5 ,6. En animales de experimentación, elevaciones en cerebro KYNA han demostrado para deteriorar su rendimiento cognitivo en una matriz de análisis conductual2,7,8,9,10 . Una hipótesis emergente sugiere que KYNA desempeña un papel integral en la modulación de las funciones cognitivas afectando sueño-vigilia comportamiento11, apoyando así aún más el papel de moléculas derivadas de astrositos en la modulación de la neurobiología del sueño y 12de la cognición.
Clínicamente, se han encontrado elevaciones en KYNA en líquido cefalorraquídeo y tejido fino del cerebro post mortem de pacientes con esquizofrenia13,14,15,16, un debilitante trastorno psiquiátrico caracterizado por debilitaciones cognoscitivas. Pacientes con esquizofrenia a menudo se ven afectados por trastornos del sueño que pueden exacerbar la enfermedad17. Entender el papel del metabolismo de KP y KYNA en la modulación de una relación entre el sueño y cognición, particularmente entre el aprendizaje y la memoria, puede conducir al desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de estos pobres resultados en la esquizofrenia y otros enfermedades psiquiátricas.
Un método confiable y consistente para la medición de metabolitos de KP es importante para garantizar que la investigación de distintas instituciones puede ser integrada en la comprensión científica de la biología de KP. En la actualidad, se describe la metodología para medir la quinurenina en plasma de rata y KYNA en el cerebro de la rata por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El presente Protocolo, que hace uso de una detección fluorimétrica en presencia de Zn2 +, primero fue desarrollado por Shibata18 y más recientemente adaptado y optimizado para derivatize con acetato de zinc 500 mM como el reactivo de la columna, lo que permite la detección de endógeno, cantidad nanomolar de KYNA en el cerebro11.
Para estimular la producción endógena de KYNA de novo como se describe en el presente Protocolo, la quinurenina bioprecursor directa se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) en ratas. En combinación con evaluaciones bioquímicas para determinar el grado de producción de KYNA, los impactos de un quinurenina desafían la memoria dependiente del hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y la arquitectura de sueño-vigilia (señales de EEG y EMG) es también investigar11. Una combinación de estas técnicas permite el estudio de los efectos bioquímicos y funcionales de un quinurenina reto en vivo en ratas.

<table><tbody><tr><td>Ratas Wistar</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>macho adulto, 250-350 g</td></tr><tr><td>Sulfato de L-quinurenina</td><td>Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 columna (4 mm x 150 mm)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Clips</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>Materiales de montaje tornillos</td><td>PlasticsOne</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Suturas no absorbibles</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP Medical Monomid Black Nylon Suturas, 4-0, P-3, 18", CAJA de 12</td></tr><tr><td>Suturas Absorbibles</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1</td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0.45 mm</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Alliance HPLC system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E2695 módulo de separación</td><td>Waters</td><td>176269503</td><td></td></tr><tr><td>detector de fluorescencia 2475</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186247500</tr><tr><td>Administrador de reactivos posteriores a la columna</td><td>Waters</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>computadora Lenovo</td><td>Software 668000249</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empower</td><td>de Waters</td><td>176706100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>><fuerte>Caja de evitación pasiva para ratas</fuerte></td>Cubículo de atenuación acústica <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de MDF extra alto</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-018MD</td><td>Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D)</td></tr>Cámara de <tr><td>caja de lanzadera moduladora de canal central</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr><tr><td>Suelo de rejilla de acero inoxidable para ratas</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-GF</td><td></td></tr><tr><td>Puerta de guillotina automática</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>Arnés de suelo de rejilla de desconexión rápida para ratas</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>Luz de estímulo, lente blanca de 1", montada en panel modular</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-221M</td> Módulo <td></td></tr><tr><td>Sonalert con control de volumen para cámara de ratas</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>Paquete SmartCtrl de 8 entradas/16 salidas</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>Control IR de 8 canales para cajas de lanzadera</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>Fuente infrarroja y tiras de matriz de detectores</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de interfaz de sobremesa, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de estimulación aversiva de corriente constante de doble rango</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>Módulo codificador de suelo de rejilla de estado sólido</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de control de choque Dual A/B</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>Extensión mini-molex de 2' y 3 pines</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>Cable de salida de choque de 10', DB-9 M/F</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>Cable de control de choque de lanzadera 15', 6</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>Pequeño armario de sobremesa y fuente de alimentación, 120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080D Paquete</td><td></td></tr><tr>de<td>interfaz PCI</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>Paquete utilitario para evitar la caja de lanzadera</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipo de monitoreo de sueño-vigilia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 Interfaz de adquisición de fuentes</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>Computadora Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bits</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de computadora Dell de 19"</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>Receptores para jaulas de plástico, 8x</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>Cisco RV130 VPN router Data</td><td>Sciences International (DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 2.0</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr><tr><td>Conmutador de red</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>Software Neuroscore</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>Transmisor de dos canales biopotenciales, modelo TL11M2-F40-EET</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>

una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

La vía de la quinurenina (KP) de la degradación de triptófano ha sido implicada en trastornos psiquiátricos. Específicamente, el metabolito derivado de astrositos ácido quinurénico (KYNA), un antagonista en ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) y α7 los receptores nicotínicos de la acetilcolina (α7nACh), se ha implicado en procesos cognitivos en la salud y la enfermedad. Como los niveles KYNA son elevados en los cerebros de pacientes con esquizofrenia, un mal funcionamiento en los receptores colinérgicos y glutamatérgicos se cree que la causal se relaciona con disfunción cognitiva, un dominio de base de la psicopatología de la enfermedad. KYNA puede jugar un papel patofisiológico importante en individuos con esquizofrenia. Es posible elevar el KYNA endógena en el cerebro de roedor por tratar a los animales con la quinurenina bioprecursor directa y estudios preclínicos en ratas han demostrado que elevaciones agudas en KYNA pueden afectar sus procesos de aprendizaje y la memoria. El protocolo actual describe este acercamiento experimental en detalle y combina a) un análisis bioquímico del nivel de quinurenina y cerebro formación KYNA (utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento), b) comportamiento de prueba para probar la memoria contextual dependiente de hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y c) una evaluación de comportamiento de sueño y vigilia [grabaciones telemétricas combinar señales de electromiografía (EMG) y Electroencefalografía (EEG)] en ratas. Tomados en conjunto, se estudia una relación entre el elevado KYNA, sueño y cognición, y este protocolo describe en detalle un enfoque experimental para comprender los resultados de la función de elevación de la quinurenina y KYNA formación en vivo en ratas. Resultados obtenidos a través de las variaciones de este protocolo pondrá a prueba la hipótesis que el KP y KYNA sirven papeles fundamentales en la modulación de sueño y cognición en Estados de salud y enfermedad.

Para validar el uso de una inyección intraperitoneal de quinurenina como método para elevar el cerebro KYNA, se realizó un análisis HPLC de tejido. Curvas estándar (figura 1) fueron construidas usando el software asociado y permite la cuantificación de las muestras de tejido. Cromatogramas representativos de quinurenina y KYNA se presentan en la figura 2. Quinurenina se observó en un tiempo de retención de 6 min y KYNA tenía un t...

Alteraciones en los metabolitos de quinurenina vía (KP) neuroactivos implicados en enfermedades psiquiátricas. Investigar los resultados funcionales de un alterado quinurenina vía metabolismo en vivo en los roedores puede ayudar a elucidar nuevos enfoques terapéuticos. El protocolo actual combina enfoques bioquímicos y de comportamiento para investigar el impacto de un desafío de quinurenina aguda en ratas.

Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

Este método combina enfoques bioquímicos y conductuales para ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre el impacto de un desafío agudo con quinurenina en ratas. La principal ventaja de la técnica es que proporciona un método fiable y consistente para la medición de los metabolitos de la vía de la quinurenina en el cerebro y el plasma de ratas. Carly Fabian, estudiante asistente de investigación de mi laboratorio, demostrará el procedimiento.En el punto final experimental apropiado después de la administración de quinurenina intraperitoneal, descongele el plasma recolectado congelado en hielo húmedo y diluya las muestras descongeladas con agua ultrapura. Transfiera 100 microlitros de muestra diluida a recipientes individuales de 25 microlitros de ácido perclórico al 6% y vórtice en centrifugar las muestras. A continuación, transfiera 100 microlitros de sobrenadantes de cada tubo a tubos individuales de microcentrífuga de 250 microlitros para la determinación de quinurenina y ácido quinurénico.Para la medición de ácido quinurénico a partir de muestras de cerebro, descongele las muestras de cerebro recolectadas congeladas en hielo seco y pese individualmen

a-high-performance-liquid-chromatography-measurement-kynurenine

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Este video muestra un protocolo para implantar un conjunto de electrodos de electroencefalograma (EEG) y electromiograma (EMG) en un ratón anestesiado. El proceso consiste en asegurar el ratón en un marco estereotáxico, hacer una incisión en la línea media del cráneo, perforar agujeros para los electrodos y fijar la unidad de electrodos para el registro de la señal. Después de la recuperación, el comportamiento de sueño-activación del mouse se analiza utilizando las señales registradas.

Análisis del comportamiento del sueño en ratones a través de registros de electroencefalograma y electromiograma

El registro del electroencefalograma (EEG) y el electromiograma (EMG) en ratones que se comportan libremente es un paso crítico para correlacionar el comportamiento y la fisiología con el sueño y la vigilia. El protocolo experimental descrito en este documento proporciona un sistema basado en cable para adquirir registros de EEG y EMG en ratones.

Poligráfico Procedimiento de Grabación en medición del sueño en ratones

Absorción de la dopamina Synaptosomal y cromatografía líquida de alto rendimiento representan experimental las herramientas de análisis para investigar la homeostasis de la dopamina en ratones mediante la evaluación de la función de transportador de la dopamina y los niveles de dopamina en el tejido estriado, respectivamente. Aquí presentamos los protocolos para medir contenido de tejido de dopamina y evaluar la funcionalidad del transportador de dopamina.

Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal

Presentamos una cómoda extracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica (ECD) para la determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina y dos de sus metabolitos en la orina de los bebés. También identificamos el metabolito MHPG como un potencial biomarcador para el diagnóstico precoz de daño cerebral para los niños.

Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

Se describe un método de alto rendimiento de medición de sueño por medio de la actividad casa jaula monitoreo. Este método ofrece ventajas sobre los métodos tradicionales basados en el EEG. Bien validado para la determinación de la duración total del sueño y puede ser una poderosa herramienta para controlar el sueño en modelos de roedores de la enfermedad humana.

Determinación no invasiva, de alto rendimiento de la duración del sueño en roedores

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

La pérdida de sueño y la desalineación circadiana contribuyen a numerosos accidentes e incidentes operativos. La eficacia de las contramedidas y los diseños de programación de trabajo destinados a mitigar la fatiga puede ser difícil de evaluar en entornos operativos. Este manuscrito resume un enfoque para recopilar datos de sueño, circadianos, fatiga y rendimiento en entornos operativos complejos.

Recopilación de datos de sueño, circadiano, fatiga y rendimiento en entornos operativos complejos

Aquí, presentamos un método para investigar los ritmos diurnos en el rendimiento después de la categorización precisa de los participantes en grupos de fenotipos circadianos basados en el Cuestionario ChronoType de Múnich, biomarcadores de fase circadiana estándar de oro y medidas actigráficas.

Fenotipado circadiano humano y pruebas de rendimiento diurno en el mundo real

Aquí se describe un protocolo para la determinación de cuatro metabolitos triptófanos diferentes generados en la vía kynurenina (kynurenina, 3-hidroxikynurenina, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxiyanthranilic) en el medio recogido de cultivos celulares cancerosos analizados por cromatografía líquida junto con una sola espectrometría de masa cuadrúpeda.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

Aprende a medir quinurenina y ácido quinurénico mediante HPLC en ratas para estudiar los efectos de la vía del triptófano en cognición y sueño. Este método combina análisis bioquímico y conductual.

Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas (Video) | JoVE Journal

Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas

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