Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

El objetivo de este protocolo es generar células madre pluripotentes inducidas humanas que expresen proteínas de fusión endógena fusionadas con etiquetas fluorescentes terminales de marco final N o C. Para lograr el knock-in deseado, utilizamos el sistema CRISPR-Cas9 y un enfoque basado en ribonucleoproteínas que utiliza la proteína S.pyogenes Cas9 de tipo salvaje y un ARN CRSPR sintético de dos partes y un ARN tracr. Este RNP se administra conjuntamente con la secuencia de etiqueta fluorescente deseada como plásmido donante mediante electroporación.

Las células supuestamente editadas que expresan la proteína marcada con fluorescencia se enriquecen con FACS. A continuación, se generan líneas clonales para el análisis de resultados de edición precisos. Este protocolo de edición de genes tiene muchas ventajas sobre las construcciones tradicionales de sobreexpresión.

Debido a que se introduce una etiqueta fluorescente en el genoma, la localización subcelular y la dinámica de la proteína de fusión resultante se pueden estudiar bajo control regulador endógeno. Aquí utilizamos células madre pluripotentes inducidas como sistema modelo porque nos permite estudiar las proteínas marcadas en células diploides no transformadas. Además, dado que las células se pueden diferenciar en múltiples tipos de células, como las células de cardiomiocitos que se muestran aquí, este enfoque brinda la oportunidad de crear y estudiar proteínas marcadas en una variedad de contextos celulares isogénicos.

Sin embargo, con una optimización cuidadosa, este protocolo podría adaptarse para editar los genomas de otros tipos de células de mamíferos. Hola, soy Amanda Haupt, formo parte del equipo de células madre y edición genética del Instituto Allen de Ciencia Celular. Hoy en día, hemos utilizado este enfoque para generar más de 35 líneas celulares diferentes que expresan proteínas de fusión endógenas.

Los utilizamos para estudiar una amplia variedad de estructuras y procesos celulares únicos. Este enfoque ha sido exitoso hasta en el 95% de los loci intentados hasta la fecha con nuestro grupo. Este método será particularmente útil para los biólogos celulares que estén interesados en comprender mejor la dinámica de una proteína en células vivas.

Sin embargo, una vez que se generan las líneas clonales editadas, las posibilidades de estudio son infinitas. Con este método, podemos identificar de manera consistente clones que tienen etiquetas de proteínas fluorescentes monoalélicas sin ninguna otra interrupción en la secuencia genómica. Ocasionalmente también podemos obtener clones editados bialélicamente.

En este video mostraremos algunos de los pasos clave en la transfección, el enriquecimiento de FACS y el aislamiento de líneas celulares clonales que expresan proteínas de fusión fluorescentes reguladas endógenamente. Dos o tres horas antes de la transfección, trate las hiPSC con diez inhibidores micromolares de ROCK suplementados en medios de crecimiento. Esto promoverá la supervivencia después de la electroporación.

Las células tendrán una apariencia puntiaguda después de este tratamiento. Las células deben extraerse de la placa de cierre tisular utilizando una sola región de disociación celular y la suspensión celular debe recogerse en un tubo cónico antes de la transfección. Prepare una alícuota de 1,84 por 10 a las seis celdas para cada condición experimental que se va a transfectar.

Prepare tubos de complejo de ribonucleoproteínas para cada transfección añadiendo 2,88 microlitros de ARN guía de 10 micromolares y 2,88 microlitros de Cas9 de 10 micromolares a un tubo de 1,5 milésimas de pulgada. Incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 10 minutos, un máximo de una hora. Granular la alícuota de celda preparada en el paso anterior a 211 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente.

A continuación, aspire el sobrenadante y compita para hacer girar el pellet de la célula en 220 microlitros de tampón de electroporación. Añadir 220 microlitros de células re suspendidas en el tubo complejo RNP de 1,5 milésimas de pulgada previamente preparado. Añadir 4,6 microlitros de un microgramo por plásmido de donante de microlitro.

Utilice la punta de nucleofección y la pipeta para mezclar los dos contenidos dos o tres veces, luego transfiera cien microlitros de suspensión al dispositivo de electroporación preparado. Evite introducir burbujas en la punta. Aplique mil trescientos voltios durante un pulso de treinta milisegundos.

Transfiera suavemente la suspensión a una placa de preparación de seis pocillos con un movimiento giratorio. Disperse las células moviendo suavemente la placa de lado a lado y de adelante hacia atrás. Después de repetir para todas las condiciones experimentales y controles, incubar las células transfectadas a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas, cambiando el medio a medio de crecimiento regular sin inhibidor de ROCK a las 24 horas.

A continuación, continúe alimentando las hiPSC cada 24 horas durante 72 a 96 horas controlando su confluencia. Cuando las hiPSCs alcanzan un 68 a 80% de confluencia, se procede al enriquecimiento de FACS. Dos o tres horas antes de la transfección, trate las hiPSC con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares suplementado en el medio de crecimiento para promover la supervivencia después del enriquecimiento de FACS.

Para clasificar las células, retírelas de la placa con el reactivo de disociación de una sola célula y luego filtre la suspensión hiPSC a través de un filtro de malla de 35 micras en tubos de poliestireno de fondo redondo. Ordene las celdas mediante dispersión directa y dispersión lateral, incluidas: altura frente a anchura, tripletes, restos y dobletes. Utilice celdas de control de solo búfer en vivo para establecer la puerta positiva FP, de modo que menos del 1,1% de las celdas de solo búfer caigan dentro de la puerta.

Al clasificar las células madre, adapte la configuración del instrumento para promover la supervivencia celular, como se sugiere en la sección de discusión. Las eficiencias típicas de detonación, determinadas por el porcentaje de células FP positivas por FACS, pueden oscilar entre el 0,1% y el 5%Clasifique las células en un tubo de polipropileno de 1,5 a 15 milésimas de pulgada que contenga de 0,5 a 2 milésimas de pulgada de medio de crecimiento a temperatura ambiente complementado con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares. Centrifugar las células recogidas a 211 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente.

Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de medio de crecimiento suplementado con 10 micromolares inhibidor de ROCK. Transfiera hasta tres mil celdas variadas a un solo pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta de matrigel fresca. Incubar las células clasificadas a 37 grados centígrados en 5%CO2 durante 24 horas, cambiando el medio a medio de crecimiento suplementado con 5 micromolares inhibidor de ROCK a las 24 horas.

Luego, a las 48 horas, continúe alimentando a las células con medios de crecimiento regulares, sin inhibidor de ROCK cada 24 horas durante 72 a 96 horas monitoreando la confluencia. Una vez que las células estén lo suficientemente maduras como para ser expulsadas de la placa de 96 pocillos, recomendamos pasarlas gradualmente a placas más grandes. Así, por ejemplo, de un pozo de una placa de 96 pocillos, muévalos a uno o dos pozos de una placa de 24 pocillos.

Y luego de ahí a una placa de 6 pocillos, etcétera, hasta que tenga suficientes celdas para fines posteriores. Por lo general, de tres a cuatro millones de células como mínimo. Para generar líneas clonales a partir de la población enriquecida con FACS de células editadas punitivamente, pase a la suspensión de una sola célula y coloque diez mil células en una placa de 10 centímetros y permita que las colonias crezcan durante cinco a siete días.

Cuando las colonias son visibles macroscópicamente, son lo suficientemente grandes como para ser aisladas. En un microscopio de disección, utilice una pipeta P200 para raspar y aspirar suavemente las colonias individuales de la superficie de la placa. Transfiera el volumen que contiene la colonia a un solo pocillo de la placa de 96 pocillos.

Una vez que se hayan transferido todas las colonias, incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas. Cambie el medio a un medio de crecimiento regular sin inhibidor de ROCK a las 24 horas. Luego, continúe alimentando las celdas cada 24 horas durante 72 a 96 horas hasta que las colonias hayan triplicado aproximadamente su tamaño.

Las células deberán cultivarse y pasarse en placas de 96 pocillos para tener suficientes células para criopreservarlas antaliadas para la extracción de ADN genómico. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles. Para pasar en placas de 96 pocillos, use un aspirador de ocho canales para quitar y desechar los medios de la primera columna.

Con una pipeta multicanal P200, añada unos 200 microlitros de DPBS a la primera columna de la placa para lavar las células. Con un aspirador de ocho canales, retire y deseche el lavado DPBS de la primera columna. A continuación, añada 40 microlitros de reactivo de disociación a la primera columna.

Repita estos pasos trabajando una columna a la vez hasta un total de seis columnas de la placa de 96 pocillos. Cambie las puntas para asegurarse de no contaminar los pozos de forma cruzada. Coloque la placa en la incubadora durante tres a cinco minutos desde el momento en que se agregó el reactivo de disociación a la primera columna.

Cuando las celdas de la primera columna de la placa hayan comenzado a levantarse del fondo, use una pipeta multicanal P200 para agregar 160 microlitros de DPBS a la primera columna y triture suavemente las celdas en las posiciones de las 12 en punto, 3 en punto, 6 en punto y 9 en punto de cada pocillo. Transfiera todo el volumen con suspensión de celdas a una placa de 96 pocillos con fondo en V. Repita estos pasos para las columnas restantes que tienen reactivo de disociación en ellas, cambiando las puntas para no contaminar los pocillos.

Gire la placa inferior en V en la centrífuga a 385 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Los subwoofers mostrados hasta este punto para el paso de 96 pozos se realizan de la misma manera cada vez que las celdas pasan en este formato de placa. A continuación, le mostraremos cómo proceder si está listo para criopreservar las células en formato de 96 pocillos.

Consulte el protocolo escrito para obtener más información. Después de la etapa de centrifugación mostrada en la sección anterior, aspire el sobrenadante con una pipeta multicanal P200 y luego vuelva a suspender en 60 microlitros de medio de crecimiento suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK. Repita para todos los pozos, cambiando las puntas para no contaminar de forma cruzada.

Transfiera 30 microlitros de suspensión celular a una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos no recubierta de matrigel. Transfiera los 30 microlitros restantes de suspensión a una placa hermana, luego agregue rápidamente 170 microlitros de tampón de congelación a cada pocillo sin mezclar. Tenga en cuenta que este proceso se realiza en placas hermanas duplicadas, de modo que existe una población de células de respaldo después de descongelar una de las placas individuales.

Colocar células criopreservadas solo en cada dos columnas de la placa de 96 pocillos permite una descongelación más rápida. Envuelva la placa con parafilm y colóquela en una caja de espuma de poliestireno a temperatura ambiente con tapa. Coloque toda la caja en el congelador a menos 80 grados centígrados.

Después de 24 horas, las placas se pueden transferir fuera de la caja de espuma de poliestireno y clasificar a menos 86 grados centígrados durante un máximo de cuatro semanas. La criopreservación de células madre pluripotentes inducidas humanas en formato de 96 pocillos permite una pausa temporal en el cultivo celular. El investigador puede realizar ensayos de validación genómica en las minas clonales para identificar los clones genéticamente deseables para descongelar para estudios futuros.

Cuatro días después de transfectar la línea hiPSC del WTC con una proteína Cas9 de ARN guía específica y un plásmido de molde donante cuidadosamente diseñado, se observó que el 0,95% de las células expresaban GFP. Se utilizó FACS para clasificar todas las células positivas para GFP como una población enriquecida. Los estudios preliminares de microscopía revelaron la localización esperada de la proteína de fusión de la lamina nuclear B1 de mEGFP en la envoltura nuclear.

La proteína marcada con fluorescencia se observó en aproximadamente el 95% de las células con diferentes intensidades. Después de la generación de líneas clonales, se obtuvieron clones con una intensidad uniforme de mEGFP y se analizaron posteriormente para una edición precisa. Para concluir, hemos mostrado un método de transfección para la edición génica de células madre pluripotentes inducidas humanas para la expresión de proteínas de fusión fluorescentes reguladas endógenamente.

Debido a que las ineficiencias típicas de detonación son bajas, algunas estrategias de enriquecimiento como el método FACS que se muestra aquí dan como resultado una población de células supuestamente editadas que expresan la proteína de fusión. La población enriquecida se puede utilizar para estudios biológicos o se pueden generar líneas clonales como se describe en este método, lo que permite identificar líneas celulares que están editadas genéticamente con precisión. Es importante recordar que las roturas de doble cadena inducidas por Cas9 en el genoma a menudo se reparan de manera imprecisa a pesar de la incorporación de la etiqueta en el locus previsto.

Además, en los clones editados monoalélicamente, el alelo no marcado contiene con frecuencia indels, muy probablemente causados por la reparación de la unión de extremos no homólogos. Estos hallazgos subrayan la importancia de la validación genética después de que un knock in de CRISPR Cas9 solo se revelara a través del análisis del genoma de líneas celulares clonales. La expresión de la proteína de fusión esperada por sí sola no garantiza una edición precisa.

Al utilizar este protocolo para la edición de células madre pluripotentes inducidas humanas, tenga cuidado de seguir las recomendaciones detalladas en el protocolo escrito para garantizar un manejo suave de las células para una supervivencia celular óptima y una diferenciación espontánea mínima. Esperamos que este video y la lista de protocolos y materiales asociados lo ayuden a realizar experimentos similares en su propio laboratorio con su proteína favorita. Gracias por mirar.