Name: Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprende a etiquetar proteínas endógenas en células madre pluripotentes humanas usando CRISPR/Cas9. Este método permite estudiar la dinámica proteica bajo control regulatorio endógeno con eficiencias de inserción de hasta el 95%.

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Agradecemos a Daphne Dambournet para muchas discusiones profundas y asesoramiento sobre gene edición, Thao para Ilustración, Angelique Nelson para la lectura crítica del manuscrito y Andrew Tucker para generar la línea de celular de Lamin B1 etiquetado mEGFP. Queremos reconocer la células madre y genes Editing y equipos de desarrollo de ensayos en el Instituto Allen para la ciencia de la célula por su contribución a la gene de edición y control de calidad. La línea WTC que utilizamos para crear nuestra línea celular editado gene fue proporcionada por el Bruce R. Conklin Laboratory en los Institutos Gladstone y UCSF. Agradecemos el Instituto Allen para fundador de ciencia celular, Paul G. Allen, por su visión, ánimo y apoyo.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado aquí para generar endógenamente regula fusiones de la proteína fluorescente en hiPSCs es un enfoque versátil y potente para la generación de líneas celulares de gene editado con aplicaciones que van desde la proyección de imagen de células vivas a diversos estudios funcionales y " modelos de la enfermedad en un plato"usando derivados del paciente hiPSC líneas13,14,15. Mientras que este método ha sido utilizado para introducir grandes etiquetas FP a N - o C-terminal de proteínas endógenas, potencialmente podría utilizarse para introducir otras etiquetas o pequeños cambios genéticos a modelo o correcto el enfermedad-causar mutaciones22,23 . Para rellenos pequeños, puede reducirse el tamaño del brazo de homología, pero el enfoque general a la edición en este método puede aplicar24,25. Mientras que el uso de hiPSCs se recomienda por su gran utilidad, con cuidado de optimización, este protocolo puede adaptarse para editar los genomas de otras líneas de células de mamífero.
Hora de identificar un gen de interés para el etiquetado FP, estimaciones de abundancia de la transcripción (de microarrays o datos de RNA-Seq) es un buen punto de partida para evaluar si se expresa un gen o isoforma de interés, aunque los niveles de transcripción no siempre se correlacionan con niveles de proteína. La estrategia de enriquecimiento FACS descrita aquí funcionará mejor para los genes que se expresan por lo menos moderadamente bien en el tipo de la célula de interés. Esta estrategia ha tenido éxito en la selección para fusiones que muestran patrones de punteado o discreta localización como centrin, desmoplaquina y paxillin donde la relación señal a fondo es muy bajo12,19. Genes que muy no se expresan o se expresan únicamente en tipos celulares derivados pueden requerir estrategias de selección adicional.
El punto de partida para crRNA y donantes plasmid plantillas utilizadas en líneas celulares humanas debe ser el genoma humano de referencia (GRCh38). Dado que los genomas de diferentes líneas celulares pueden variar de la misma especie, y porque CRISPR/Cas9 es específica de secuencia, es muy útil identificar variantes específicas de la línea de la célula (polimorfismos de nucleótido único o inserciones/deleciones (indels)) difiere del genoma de referencia e incorporar en el diseño. Esto asegura que crRNAs será compatible con el genoma del anfitrión y que los brazos de homología plásmido donante plantilla conservará las variantes específicas de la línea celular. Es una estrategia sugerida incorporar variantes homocigóticas en brazos de homología de plásmido de plantilla de crRNAs y donantes durante el proceso de diseño. La incorporación de variantes heterozigóticas es opcional. Los reactivos específicos utilizan para gran knock-en experimentos y otras consideraciones principales de este protocolo se discuten a continuación.
Proteína de Cas9
El principal beneficio de usar proteína Cas9 es que introduciendo la Cas9 y gRNA como una complejo RNP se ha demostrado para dar lugar a una duración limitada de la actividad de nucleasa comparado con enfoques basados en el plásmido donde expresión de la Cas9 y gRNA puede continuar por días y conducir a mayor en y fuera del objetivo actividad26,27. Un beneficio adicional de usar proteína Cas9 es que está disponible para unirse una vez dentro de las células. Esto contrasta con los métodos más convencionales de Cas9 mRNA o plásmido Cas9/gRNA que requieren transcripción, traducción y procesamiento26,28la proteína. Wildtype S. pyogenes Cas9 proteína ya está disponible de muchas fuentes comerciales.
Guía de ARN
Hay muchas herramientas disponibles para la búsqueda de objetivos de crRNA cerca del sitio de inserción deseado de FP que tienen cero o pocos predicha de-objetivos en el anfitrión genoma29,30,31,32. Eficiencias en HDR y la precisión de los resultados HDR varían ampliamente entre los objetivos de la crRNA en un locus dado12. Por este motivo, prueba varios crRNAs (2-4 y preferentemente dentro de 50 bp del sitio de inserción deseada) por locus se recomienda ya que esto puede aumentar la probabilidad de que un exitoso experimento de edición. Posibilidades actuales para la entrega de gRNA incluyen sintética parte 2-crRNA y tracrRNA, gRNAs solo sintético (sgRNAs), en vitro transcribe sgRNAs, o la entrega de un plásmido a las células que expresan lo sgRNA de un promotor U6. Este protocolo no fue optimizado para actividad de escote alto. Sin modificar parte 2-crRNA y tracrRNA (véase Tabla de materiales) fueron utilizados con el objetivo de generar líneas de células mono-alélica FP-agregó mientras causando la perturbación menor potencial a las células.
Plásmido de plantilla de donantes
Porque algunos de la homología del brazo secuencia siempre en el donante plásmidos de la plantilla se incorporarán en el genoma del anfitrión durante el evento HDR, mutaciones de punto a los sitios de reconocimiento de crRNA deben introducirse para evitar más escote por Cas9 después de HDR. Muchas veces el simple cambio disruptivo es mutar la secuencia de PAM. Ya que algunas secuencias no-canónico de PAM todavía pueden ser reconocidos por tipo de salvaje Cas9 de S. pyogenes , es mejor evitar el uso de NGG, NAG o NGA33. Cuando mutando el brazo de homología, evitar las mutaciones no sinónimas y la introducción de codones raros. Si no es posible un cambio sinónimo a la secuencia de PAM, considerar tres sinónimas mutaciones de punto en la región de la semilla (10 bp proximal a PAM) del sitio de Unión crRNA. Debe tener extremo cuidado al hacer estos cambios en la región no traducida (UTR) de 5ʹ, puesto que estas regiones pueden contener secuencias reguladoras importantes. Consultar una base de datos de conservación genética tales como pistas de genómica comparativa de navegador de genoma de UCSC pueden orientar en estos casos, como cambios a las bases no conserva pueden tolerarse mejor que cambia a bases altamente conservado17. A veces la mera inserción de la secuencia FP es suficiente para alterar el sitio de unión de crRNA (como en la figura 1); sin embargo, debe revisarse la secuencia recién anexada para la persistencia de crRNA vinculante y secuencias de PAM.
Enlazadores de aminoácidos entre la FP y la proteína nativa se recomiendan conservar la función de la proteína de fusión34. A menudo un vinculador del aminoácido puede ser elegido por su particular carga o tamaño. Si una fusión de cDNA con un diseño similar a la específica endógena proteína de fusión se ha estudiado bien, que la misma secuencia de vinculador puede utilizarse para CRISPR/Cas9 knock-in experimento12,19. Si dicha información está disponible, un enlazador corto como GTSGGS también ha sido utilizado con éxito12. Otros estudios han demostrado éxito con una secuencia de vinculador ácido 3-amino pequeño genérico para una variedad de objetivos35.
Transfección y el enriquecimiento de la FACS
Muchos reactivos de transfección comercialmente disponibles están formulados para la entrega de ciertos tipos de moléculas a las células, mientras que un sistema de electroporación puede utilizarse para proporcionar reactivos con una amplia gama de composición, tamaño y carga. Además de ser un método común de transfección para duro para transfectar células como hiPSCs, electroporación también conlleva el beneficio de entrega de los tres componentes para FP CRISPR/Cas9-mediada knock-in como se describe en este método. Electroporación fue encontrada para producir los mejores resultados en comparación con otros reactivos disponibles en el mercado en el desarrollo de este método (datos no mostrados) y también ha sido utilizado por otros para RNP entrega26,28,36 .
Cuando se utiliza este protocolo para la edición hiPSCs, especial debe tener cuidado para asegurar un manejo suave de las células antes y después del gene de la edición de proceso para la supervivencia celular óptima y mínima diferenciación espontánea. En particular, los métodos de enriquecimiento FACS deben adaptarse para la clasificación de las células madre mediante el uso de la boquilla más grande posible (130 μm), una baja tasa de flujo (≤24 μl/min), fluido de vaina sin conservantes (como solución salina, véase Tabla de materiales) y muestra bajo presión (10 bar). En lugar de sola celda de clasificación, que da como resultado subóptimo viabilidad en células madre, el FACS enriquecido hiPSCs son ordenados a granel y ampliados como una población para optimizar integridad celular viabilidad y célula de vástago. Sin embargo, clasificación de la célula puede ser apropiado para menos tipos de células sensibles. Para promover la supervivencia celular, las células son volvió a cultura no más de una hora después de la cosecha para el enriquecimiento del FACS y mantenerse a temperatura ambiente durante el proceso de clasificación. Para algunos tipos de células, también puede mejorar supervivencia de la célula por incubación de las células en hielo (4° C) durante todo el proceso de clasificación.
La expansión masiva de células positivas de FP ofrece una oportunidad para evaluar la población de análisis para la localización de la proteína de fusión antes de generar líneas clonales. Mientras que la población enriquecida resultante de células puede ser suficiente para algunos estudios, estas poblaciones con frecuencia Mostrar señal de FP de intensidad variable. Las líneas clonales aisladas tienen señal uniforme (figura 3), lo que los hace más apropiados para experimentos funcionales12.
Generación de línea clonal de la célula
A lo largo del edición y clonal línea proceso de generación, es importante controlar la morfología de la célula. hiPSC colonias cultivadas en condiciones libres de alimentador deben exhibir bordes lisos y un centro bien lleno, incluso12,18,19. Deben observarse las células diferenciadas en menos del 5% de la cultura. Al escoger colonias individuales, elegir aquellos exhiben buena morfología. En la placa de 96 pocillos pases a eventos, ver clones de morfología y deje de aquellos que han invadido ya que podría conducir a la diferenciación o ser un indicio de inestabilidad genética.
Generación de líneas celulares clonales permite la confirmación genética de edición precisas, que es importante porque Cas9 inducido de doble cadena se rompe en el genoma son a menudo reparado impreciso a pesar de la incorporación de la etiqueta en el lugar deseado. Ensayos de PCR previamente descritos mostraron que acumulativamente en diez lugares geométricos genomic únicos muchos (45%) de los clones expresando su punto de congelación sufrida de la integración de columna vertebral de plásmido donante en el lugar geométrico del objetivo o (raramente) al azar en el genoma12. Además, clones de 23% de GFP-positivas (n = 177) en loci únicos diez fueron encontrados para abrigar mutaciones en o cerca del sitio de corte de crRNA esperado en el alelo sin etiquetar, probablemente debido a NHEJ12. Este análisis genético de muchas líneas clonales (~ 100 clones/edit) subrayaron la importancia de la validación genética que no es posible en una población celular desde FP-expresión y localización de la proteína de fusión prevista solo no garantizan la precisa edición12 . Además, estos ensayos basados en PCR no se puede realizar en una población enriquecida de células con certeza, justificando la necesidad de generación de línea clonal antes análisis significativo pueden ser completado. Confirmación genética de la etiqueta FP insertada y verificación de la integridad genética del alelo sin editar (en una copia editada mono-alélica) son necesarias para edición precisa en el locus específico más allá de la expresión de la etiqueta.
Una baja tasa de ediciones bi-alélicos y la falta de mutaciones fuera de objetivo (como ensayado por Sanger y secuenciación del exoma) se han observado hasta la fecha con este método (datos no publicados)12. Esto es consistente con estudios previos que describe el uso de corta duración RNP CRISPR/Cas9 experimentos26,27. La falta de líneas de células clonales con bi-alélicos ediciones también puede ser específicas de locus o debido a la incapacidad de la célula para tolerar dos tagged copias de una proteína esencial según lo sugerido de los experimentos previamente publicados donde fueron supuestas células editadas bi-alélicos observado para un lugar geométrico (LMNB1), pero no otro (TUBA1B)12. Líneas celulares clonales completamente validado BI-alélicos se han generado con este método para etiqueta ST6 beta-galactósido alfa-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1) y miembro de RAB5A RAS oncogene family (RAB5A) mEGFP19.
Más allá de confirmar la precisión de la edición del genoma, hay una variedad de ensayos de control de calidad que pueden utilizarse para caracterizar la línea clonal e identificar clones que cumplan todas células, genómica, y criterios biológicos de la célula para utilizan en el futuro estudios . Estudios biológicos y funcionales de células pueden utilizarse para confirmar la adecuada expresión, localización y función de la proteína de fusión12. La comparación a los controles parentales sin editar le ayudará a evaluar la influencia del proceso de edición en función, dinámica y localización. Otros ensayos como análisis de crecimiento y pruebas de estabilidad genomic también pueden ayudar a determinan si la proteína etiquetada es perturbador a la celda. Cuando utilice hiPSC en este protocolo, evaluación de marcadores de pluripotencia y diferenciación potencial puede ser crítico en la determinación de un clon que es valioso para abajo estudios12. Porque extendida cultura de hiPSC se ha demostrado que la inestabilidad genética, monitoreo de la tasa de crecimiento y cariotipo de líneas celulares clonales es también importante12,37. Sin embargo, la final intención de uso de las células editadas en última instancia determinará el nivel y la amplitud de control de calidad análisis y variará según la aplicación.

El uso de estrategias de edición del genoma, especialmente CRISPR/Cas9, para estudiar los procesos celulares se está convirtiendo en cada vez más accesible y valiosa1,2,3,4,5, 6 , 7. una de las muchas aplicaciones de CRISPR/Cas9 es la introducción (a través de reparación (HDR) de la homología dirigida) de grandes secuencias exógenas como GFP en loci genómicos específicos que luego sirven de reporteros para la actividad de un gen o proteína producto8 . Esta técnica puede utilizarse para unirse a una secuencia de la proteína fluorescente a un marco de lectura abierto endógeno donde la proteína resultante de la fusión endógeno regulado puede ser utilizada para visualizar la localización subcelular y la dinámica de la proteína de interés5 ,6,9,10,11. Mientras que proteínas endógeno etiquetas ofrecen muchas ventajas en comparación con la sobreexpresión sistemas, introduciendo grandes secuencias en el genoma humano es un proceso ineficiente, por lo general exigen una selección o una estrategia de enriquecimiento para obtener una población de células que puede ser fácilmente estudiados5,12.
Este protocolo describe la inserción de una secuencia de ADN que codifican una proteína fluorescente (FP) en un locus genómico deseado. El protocolo incluye diseño y entrega del plásmido de la plantilla de donante y el complejo ribonucleoproteína (RNP) (proteína de tipo salvaje S. pyogenes Cas9 combinada con ARN sintético de CRISPR (crRNA) y activación de trans crRNA (tracrRNA)). También se describe es el enriquecimiento de células supuestamente editados vía celular de fluorescencia activada (FACS) de clasificación y el proceso de generación de línea clonal de la célula. Hasta la fecha, se ha utilizado este método para generar líneas hiPSC con monoallelic o etiquetas (raramente) bi-alélicos proteína verde fluorescente (GFP) etiquetado 25 proteínas que representan estructuras celulares principales. Las células editadas resultantes de estos esfuerzos se han confirmado la inserción genética esperada, expresar una proteína de fusión localizar correctamente, y mantener la pluripotencialidad y un cariotipo estable12 (y datos no publicados). Este método también se ha utilizado para generar múltiples otro single y dual (dos proteínas diferentes etiquetadas en la misma célula) editan poblaciones de hiPSCs (datos no publicados).
IPSCs humanos derivados de un donante sano fueron elegidos para estos esfuerzos de edición del genoma porque, a diferencia de muchas líneas de celulares convencionales, son diploides, karyotypically estable, no transformado y proliferativa. Estas propiedades proporcionan un modelo atractivo para estudiar la biología de la célula fundamental y el modelado de la enfermedad. Además, el potencial de diferenciación de hiPSCs proporciona la oportunidad de estudiar varias etapas del desarrollo en paralelo a través de diversos linajes y tipos celulares utilizando células isogénicas incluidos organoides, tejidos y modelos de la "enfermedad en un plato"13 ,14,15. Aunque este protocolo fue desarrollado para hiPSCs (línea WTC), puede ser informativo para el desarrollo de protocolos con otras líneas de células de mamífero.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, o</td> software bioinformático similar <td></td><td>para en silico diseño de plásmidos donante</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT, o similar</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubadora, o similar</td><td>ThermoFisher Scientific, o</td><td>similar 51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas (1000 y micro; L, 200 y micro; L, 20 y micro; L, 10 y micro; L, 2 y micro; L)</td> <td>Rainin, o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1000 y micro; L, 200 y micro; L, 20 y micro; L)</td> <td>Pipeta multicanal Rainin, o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 &micro; L)</td>Pipetas serológicas <td>Rainin o similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar, o</td><td></td><td></td></tr> similar <tr><td>Colector de 8 canales de MARCA para uso Quiksip,</td><td>Millipore Sigma</td> esterilizable en autoclave o similar <td>BR704526-1EA</td><td>con puntas de pipeta no filtradas, como las puntas de pipeta de baja retención de Molecular BioProducts, Pure 10, por debajo</td>de</tr><tr><td>las puntas de pipeta de baja retención de Molecular BioProducts, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, o similar</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipeta Controller</td><td>Drummond, o similar</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pasteur Desechable</td><td>VWR, o similar</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Clase II, Tipo A2 Cabina de Seguridad Biológica</td><td>CELLGARD, o similar</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, Factor de Crecimiento Reducido</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lote probado antes de usar con hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-rojo fenol)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>frío, para diluir Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medios completos</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>medios de crecimiento recomendados para la línea WTC hiPSC</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC línea hiPSC</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>la línea hiPSC utilizada en este protocolo está disponible a través de Coriell</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos placa de cultivo celular</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL poliestireno cónico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( Inhibidor de ROCK)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 ARNcr sintético, sin modificar (secuencia personalizada)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 ARNtrac sintético</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Estreptococo recombinante de tipo salvaje Streptococcus piógenes Proteína purificada Cas9-NLS, 40 y micro; M</td><td>Universidad de California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plásmido de donante personalizado (PriorityGENE)</td>El diseño del inserto del donante de <td>Genewiz</td><td></td><td>fue sintetizado y clonado en la columna vertebral pUC57 por Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transfección de neón</td><td>ThermoFisher Sistema de</td><td></td> transfección de neón MPK5000 <td></td></tr><tr><td>científico, 100 y micro; L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico de polipropileno de alta claridad</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>versión FlowJo 10.2</td> Banco de sangre <td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL solución salina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>utilizado como tampón FACS sin conservantes</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Olympus SZX7, o similar</td><td>Olympus, o similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos, 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 96 pocillos, fondo en V</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>utilizado como tampón de criopreservación para células en formato de placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

proteína endógena tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Se presenta un protocolo para la generación de células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) que endógeno expresan proteínas fusionadas para etiquetas fluorescentes N o C terminal en-marco. El sistema CRISPR/Cas9 procariota (Cluster corto regularmente otro palindrómico 9 repeticiones/CRISPR-asociados) puede utilizarse para introducir secuencias exógenas grandes de loci genómicos mediante reparación de homología dirigida (HDR). Para lograr el deseado knock-in, este protocolo emplea la ribonucleoproteína (RNP)-enfoque donde proteínas tipo salvaje Cas9 de Streptococcus pyogenes , sintética guía parte 2-RNA (gRNA) y un plásmido de la plantilla de donantes se entregan a las células a través de electroporación. Células supuestamente editadas expresando las proteínas fluorescencia etiquetas se enriquecen por célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación. Líneas clonales entonces se generan y pueden ser analizadas para los resultados de edición precisa. Mediante la introducción de la etiqueta fluorescente en el locus genómico del gen de interés, la localización subcelular resultante y la dinámica de la proteína de fusión puede ser estudiada bajo control regulador endógeno, una mejora clave sobre sobreexpresión convencional sistemas. El uso de hiPSCs como sistema modelo para el etiquetado de genes proporciona la oportunidad de estudiar las proteínas etiquetadas en diploides, nontransformed las células. Desde hiPSCs pueden diferenciarse en múltiples tipos de células, este enfoque brinda la oportunidad de crear y estudiar proteínas etiquetadas en una variedad de contextos celulares isogénicas.

El objetivo de este experimento fue fusible mEGFP (monomeric GFP mejorada) a la proteína lamin nuclear del B1 al introducir la secuencia de mEGFP al final 5ʹ de los genes LMNB1 (N-terminal de la proteína). Un enlazador (secuencia de aminoácidos SGLRSRAQAS) fue elegido en base a construcciones anteriores de cDNA de la colección de proteína fluorescente Michael Davidson21. Porque la región de unión de crRNA en el plásmido de la plantilla de donantes para cada crRNA del candidato fue interrumpida después de la inserción en silico de mEGFP y la secuencia de vinculador, ningunas mutaciones de punto debía ser alterar el potencial reconocimiento de crRNA y escote por Cas9 de la secuencia del donante (figura 1). La secuencia de la donante contenía armas de homología de 1 kb que flanquean ambos extremos de la secuencia mEGFP-linker. La resultante 2.734 bp de DNA fue clonado en un backbone pUC57, secuencia verificada, y el plásmido resultante de plantilla de donantes se purificó mediante una preparación libre de endotoxina maxi. El plásmido de plantilla de donantes y complejo RNP fueron transfectadas, células supuestamente editadas se enriquecieron, y la localización de la proteína de la fusión nuclear mEGFP de lamin B1 fue confirmada por microscopía de fluorescencia (figura 2). Sólo los resultados de la transfección de crRNA1 se describen aquí, aunque ambas secuencias crRNA producción poblaciones supuestamente editado12.
En comparación con el control negativo, que no contuvo ningún gRNA, proteína Cas9 o plásmido de plantilla de donantes en la reacción de electroporación (sólo tampón), el crRNA1 LMNB1 transfectadas las células contuvieron 0,95% células de mEGFP-positivo que representa supuestamente editado mEGFP-nuclear lamin B1 población (figura 3a). Este resultado estaba dentro de la gama de las knock-in eficiencias observadas a través de muchos loci genómicos utilizando este método, previamente divulgados12.
Las células mEGFP-positivas fueron aisladas por FACS y reflejadas por microscopia vivo para confirmar la localización prevista de la mEGFP nuclear lamin B1 proteína de la fusión de la envoltura nuclear. Después de enriquecimiento de la FACS, aproximadamente el 90% de las células ordenadas de la población de crRNA1 LMNB1 fueron mEGFP-positivo (según lo determinado por microscopía), lo que sugiere que algunas células de mEGFP-negativo Co purificadas con las células GFP-positivas durante el procedimiento de clasificación. Este fue un aceptable nivel de enriquecimiento que permitió la cosecha de 96 clones que podría entonces ser genéticamente para la edición de éxito. Generalmente, un atajo para el enriquecimiento de éxito es 50% positivo GFP.
La mayoría de la población de células clasificadas muestra fluorescencia en la envoltura nuclear (nuclear periferia) en células nondividing y a una lámina nuclear extendido en el citoplasma durante mitosis proporcionando la confianza en el correcto genómica edita en el LMNB1 lugar geométrico. La población enriquecida contiene células con señal brillante o tenue. Esta diferencia en la intensidad de la señal puede reflejar una combinación de correcto e incorrecto editar los resultados y destaca la utilidad de generar una línea clonal genéticamente validada por otros estudios (ver discusión) (figura 3b)12. Generación de línea clonal, genéticamente validado las células demostradas intensidad uniforme de la GFP en experimentos de microscopía (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figura 1 . Diseño estrategia para el N-terminal GFP marcado de genes LMNB1. La etiqueta GFP fue diseñada para 5ʹ de inserción del N-terminal del primer exón de LMNB1 localizado en el cromosoma 5. 5ʹ y 3ʹ homología brazos son 1 kb y la reunión entre el codón de inicio (ATG) y el segundo codón (brazos de homología sólo parcialmente representados en la figura). Dos candidatos crRNAs fueron diseñados para guiar Cas9 hender como cerca del sitio de inserción previsto como posible, sin dejar de ser única en el genoma. Secuencia de mEGFP y un enlazador de aminoácidos fueron insertados solo 3ʹ del codón de inicio (secuencia mEGFP y el vinculador no a escala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figura 2 . Flujo de trabajo para la producción endógena con la etiqueta líneas clonales hiPSC. Componentes de la transfección, incluyendo el complejo RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (se muestra como roja proteína Cas9 con crRNA de oro y púrpura tracrRNA), el plásmido de la plantilla de donante que contiene los brazos de homología (tiene, se muestra en oro) y FP + secuencia de vinculador (mostrado en verde), fueron electroporated. Después de 4 días, las células positivas de FP supuestamente editado fueron enriquecidas por FACS y ampliadas como una población de siembra todas las células ordenadas en un único pozo de una placa de 96 pocillos (~ 1.000 células) y luego amplió en cultura hasta una población de varios millones las células podrían ensayarse como la "población enriquecida" (ver protocolo paso 3.8). El rendimiento de las células positivas de FP diferencia por experimento de debido a las tasas variables de HDR12; un enriquecimiento exitoso puede incluir típicamente ~ 300-5.000 células después de transfección de aproximadamente 1.6 x 106 caderas. Estudios preliminares de proyección de imagen confirmaron la señal y la localización de la proteína de fusión en la población enriquecida. Las colonias fueron seleccionadas manualmente en una placa de 96 pocillos para la expansión y criopreservación. Más detección genómica de control de calidad utilizando gota digital PCR (ddPCR) y otros ensayos basados en PCR entonces fue utilizado para identificar clones correctamente editados, como se describió anteriormente12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figura 3 . Enriquecimiento de poblaciones celulares supuestamente editado. (A) parcelas de citometría de flujo de la LMNB1 editado transfección después de cuatro días de las células. El eje y muestra la intensidad de la GFP y el eje x muestra dispersión hacia adelante. Puertas de clasificación se establecieron en función del control sólo buffer. Desde hiPSCs son sensibles a la perturbación, live/dead mancha fue omitida y una puerta muy conservador de FSC/SSC fue utilizada en su lugar. (B) después de enriquecimiento, la población de Cr1 LMNB1 editado las células demostradas ~ 90% de células con GFP localizar a la envoltura nuclear (esperado LMNB1 localización). La población contenía células de distinta intensidad GFP, así como algunas células GFP-negativo. Barras de escala son 10 micrones. (C) generación de línea clonal, las células demostraron una intensidad uniforme de la GFP, con algunas diferencias dependientes del ciclo celular. Barra de escala es de 20 micras.

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

El objetivo de este protocolo es generar células madre pluripotentes inducidas humanas que expresen proteínas de fusión endógena fusionadas con etiquetas fluorescentes terminales de marco final N o C. Para lograr el knock-in deseado, utilizamos el sistema CRISPR-Cas9 y un enfoque basado en ribonucleoproteínas que utiliza la proteína S.pyogenes Cas9 de tipo salvaje y un ARN CRSPR sintético de dos partes y un ARN tracr. Este RNP se administra conjuntamente con la secuencia de etiqueta fluorescente deseada como plásmido donante mediante electroporación.Las células supuestamente editadas que expresan la proteína marcada con fluorescencia se enriquecen con FACS. A continuación, se generan líneas clonales para el análisis de resultados de edición precisos. Este protocolo de edición de genes tiene muchas ventajas sobre las construcciones tradicionales de sobreexpresión.Debido a que se introduce una etiqueta fluorescente en el genoma, la localización subcelular y la dinámica de la proteína de fusión resultante se pueden estudiar bajo control regulador endógeno. Aquí utilizamos células madre pluripotentes inducidas como sistema modelo porque nos permite estudiar las proteínas marcadas en células diploides no transformadas. Además, dado que las células se pueden diferenciar en múltiples tipos de células, como las células de cardiomiocitos que se muestran aquí, este enfoque brinda la oportunidad de crear y estudiar proteínas marcadas en una variedad de contextos celulares isogénicos.Sin embargo, con una optimización cuidadosa, este protocolo podría adaptarse para editar los genomas de otros tipos de células de mamíferos. Hola, soy Amanda Haupt, formo parte del equipo de células madre y edición genética del Instituto Allen de Ciencia Celular. Hoy en día, hemos utilizado este enfoque para generar más de 35 líneas celulares diferentes que expresan proteínas de fusión endógenas.Los utilizamos para estudiar una amplia variedad de estructuras y procesos celulares únicos. Este enfoque ha sido exitoso hasta en el 95% de los loci intentados hasta la fecha con nuestro grupo. Este método será particularmente útil para los biólogos celulares que estén interesados en comprender mejor la dinámica de una proteína en células vivas.Sin embargo, una vez que se generan las líneas clonales editadas, las posibilidades de estudio son infinitas. Con este método, podemos identificar de manera consistente clones que tienen etiquetas de proteínas fluorescentes monoalélicas sin ninguna otra interrupción en la secuencia genómica. Ocasionalmente también podemos obtener clones editados bialélicamente.En este video mostraremos algunos de los pasos clave en la transfección, el enriquecimiento de FACS y el aislamiento de líneas celulares clonales que expresan proteínas de fusión fluorescentes reguladas endógenamente. Dos o tres horas antes de la transfección, trate las hiPSC con diez inhibidores micromolares de ROCK suplementados en medios de crecimiento. Esto promoverá la supervivencia después de la electroporación.Las células tendrán una apariencia puntiaguda después de este tratamiento. Las células deben extraerse de la placa de cierre tisular utilizando una sola región de disociación celular y la suspensión celular debe recogerse en un tubo cónico antes de la transfección. Prepare una alícuota de 1,84 por 10 a las seis celdas para cada condición experimental que se va a transfectar.Prepare tubos de complejo de ribonucleoproteínas para cada transfección añadiendo 2,88 microlitros de ARN guía de 10 micromolares y 2,88 microlitros de Cas9 de 10 micromolares a un tubo de 1,5 milésimas de pulgada. Incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 10 minutos, un máximo de una hora. Granular la alícuota de celda preparada en el paso anterior a 211 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente.A continuación, aspire el sobrenadante y compita para hacer girar el pellet de la célula en 220 microlitros de tampón de electroporación. Añadir 220 microlitros de células re suspendidas en el tubo complejo RNP de 1,5 milésimas de pulgada previamente preparado. Añadir 4,6 microlitros de un microgramo por plásmido de donante de microlitro.Utilice la punta de nucleofección y la pipeta para mezclar los dos contenidos dos o tres veces, luego transfiera cien microlitros de suspensión al dispositivo de electroporación preparado. Evite introducir burbujas en la punta. Aplique mil trescientos voltios durante un pulso de treinta milisegundos.Transfiera suavemente la suspensión a una placa de preparación de seis pocillos con un movimiento giratorio. Disperse las células moviendo suavemente la placa de lado a lado y de adelante hacia atrás. Después de repetir para todas las condiciones experimentales y controles, incubar las células transfectadas a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas, cambiando el medio a medio de crecimiento regular sin inhibidor de ROCK a las 24 horas.A continuación, continúe alimentando las hiPSC cada 24 horas durante 72 a 96 horas controlando su confluencia. Cuando las hiPSCs alcanzan un 68 a 80% de confluencia, se procede al enriquecimiento de FACS. Dos o tres horas antes de la transfección, trate las hiPSC con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares suplementado en el medio de crecimiento para promover la supervivencia después del enriquecimiento de FACS.Para clasificar las células, retírelas de la placa con el reactivo de disociación de una sola célula y luego filtre la suspensión hiPSC a través de un filtro de malla de 35 micras en tubos de poliestireno de fondo redondo. Ordene las celdas mediante dispersión directa y dispersión lateral, incluidas: altura frente a anchura, tripletes, restos y dobletes. Utilice celdas de control de solo búfer en vivo para establecer la puerta positiva FP, de modo que menos del 1,1% de las celdas de solo búfer caigan dentro de la puerta.Al clasificar las células madre, adapte la configuración del instrumento para promover la supervivencia celular, como se sugiere en la sección de discusión. Las eficiencias típicas de detonación, determinadas por el porcentaje de células FP positivas por FACS, pueden oscilar entre el 0,1% y el 5%Clasifique las células en un tubo de polipropileno de 1,5 a 15 milésimas de pulgada que contenga de 0,5 a 2 milésimas de pulgada de medio de crecimiento a temperatura ambiente complementado con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares. Centrifugar las células recogidas a 211 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente.Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de medio de crecimiento suplementado con 10 micromolares inhibidor de ROCK. Transfiera hasta tres mil celdas variadas a un solo pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta de matrigel fresca. Incubar las células clasificadas a 37 grados centígrados en 5%CO2 durante 24 horas, cambiando el medio a medio de crecimiento suplementado con 5 micromolares inhibidor de ROCK a las 24 horas.Luego, a las 48 horas, continúe alimentando a las células con medios de crecimiento regulares, sin inhibidor de ROCK cada 24 horas durante 72 a 96 horas monitoreando la confluencia. Una vez que las células estén lo suficientemente maduras como para ser expulsadas de la placa de 96 pocillos, recomendamos pasarlas gradualmente a placas más grandes. Así, por ejemplo, de un pozo de una placa de 96 pocillos, muévalos a uno o dos pozos de una placa de 24 pocillos.Y luego de ahí a una placa de 6 pocillos, etcétera, hasta que tenga suficientes celdas para fines posteriores. Por lo general, de tres a cuatro millones de células como mínimo. Para generar líneas clonales a partir de la población enriquecida con FACS de células editadas punitivamente, pase a la suspensión de una sola célula y coloque diez mil células en una placa de 10 centímetros y permita que las colonias crezcan durante cinco a siete días.Cuando las colonias son visibles macroscópicamente, son lo suficientemente grandes como para ser aisladas. En un microscopio de disección, utilice una pipeta P200 para raspar y aspirar suavemente las colonias individuales de la superficie de la placa. Transfiera el volumen que contiene la colonia a un solo pocillo de la placa de 96 pocillos.Una vez que se hayan transferido todas las colonias, incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas. Cambie el medio a un medio de crecimiento regular sin inhibidor de ROCK a las 24 horas. Luego, continúe alimentando las celdas cada 24 horas durante 72 a 96 horas hasta que las colonias hayan triplicado aproximadamente su tamaño.Las células deberán cultivarse y pasarse en placas de 96 pocillos para tener suficientes células para criopreservarlas antaliadas para la extracción de ADN genómico. Consulte el protocolo escrito para obtener más detalles. Para pasar en placas de 96 pocillos, use un aspirador de ocho canales para quitar y desechar los medios de la primera columna.Con una pipeta multicanal P200, añada unos 200 microlitros de DPBS a la primera columna de la placa para lavar las células. Con un aspirador de ocho canales, retire y deseche el lavado DPBS de la primera columna. A continuación, añada 40 microlitros de reactivo de disociación a la primera columna.Repita estos pasos trabajando una columna a la vez hasta un total de seis columnas de la placa de 96 pocillos. Cambie las puntas para asegurarse de no contaminar los pozos de forma cruzada. Coloque la placa en la incubadora durante tres a cinco minutos desde el momento en que se agregó el reactivo de disociación a la primera columna.Cuando las celdas de la primera columna de la placa hayan comenzado a levantarse del fondo, use una pipeta multicanal P200 para agregar 160 microlitros de DPBS a la primera columna y triture suavemente las celdas en las posiciones de las 12 en punto, 3 en punto, 6 en punto y 9 en punto de cada pocillo. Transfiera todo el volumen con suspensión de celdas a una placa de 96 pocillos con fondo en V. Repita estos pasos para las columnas restantes que tienen reactivo de disociación en ellas, cambiando las puntas para no contaminar los pocillos.Gire la placa inferior en V en la centrífuga a 385 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Los subwoofers mostrados hasta este punto para el paso de 96 pozos se realizan de la misma manera cada vez que las celdas pasan en este formato de placa. A continuación, le mostraremos cómo proceder si está listo para criopreservar las células en formato de 96 pocillos.Consulte el protocolo escrito para obtener más información. Después de la etapa de centrifugación mostrada en la sección anterior, aspire el sobrenadante con una pipeta multicanal P200 y luego vuelva a suspender en 60 microlitros de medio de crecimiento suplementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK. Repita para todos los pozos, cambiando las puntas para no contaminar de forma cruzada.Transfiera 30 microlitros de suspensión celular a una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos no recubierta de matrigel. Transfiera los 30 microlitros restantes de suspensión a una placa hermana, luego agregue rápidamente 170 microlitros de tampón de congelación a cada pocillo sin mezclar. Tenga en cuenta que este proceso se realiza en placas hermanas duplicadas, de modo que existe una población de células de respaldo después de descongelar una de las placas individuales.Colocar células criopreservadas solo en cada dos columnas de la placa de 96 pocillos permite una descongelación más rápida. Envuelva la placa con parafilm y colóquela en una caja de espuma de poliestireno a temperatura ambiente con tapa. Coloque toda la caja en el congelador a menos 80 grados centígrados.Después de 24 horas, las placas se pueden transferir fuera de la caja de espuma de poliestireno y clasificar a menos 86 grados centígrados durante un máximo de cuatro semanas. La criopreservación de células madre pluripotentes inducidas humanas en formato de 96 pocillos permite una pausa temporal en el cultivo celular. El investigador puede realizar ensayos de validación genómica en las minas clonales para identificar los clones genéticamente deseables para descongelar para estudios futuros.Cuatro días después de transfectar la línea hiPSC del WTC con una proteína Cas9 de ARN guía específica y un plásmido de molde donante cuidadosamente diseñado, se observó que el 0,95% de las células expresaban GFP. Se utilizó FACS para clasificar todas las células positivas para GFP como una población enriquecida. Los estudios preliminares de microscopía revelaron la localización esperada de la proteína de fusión de la lamina nuclear B1 de mEGFP en la envoltura nuclear.La proteína marcada con fluorescencia se observó en aproximadamente el 95% de las células con diferentes intensidades. Después de la generación de líneas clonales, se obtuvieron clones con una intensidad uniforme de mEGFP y se analizaron posteriormente para una edición precisa. Para concluir, hemos mostrado un método de transfección para la edición génica de células madre pluripotentes inducidas humanas para la expresión de proteínas de fusión fluorescentes reguladas endógenamente.Debido a que las ineficiencias típicas de detonación son bajas, algunas estrategias de enriquecimiento como el método FACS que se muestra aquí dan como resultado una población de células supuestamente editadas que expresan la proteína de fusión. La población enriquecida se puede utilizar para estudios biológicos o se pueden generar líneas clonales como se describe en este método, lo que permite identificar líneas celulares que están editadas genéticamente con precisión. Es importante recordar que las roturas de doble cadena inducidas por Cas9 en el genoma a menudo se reparan de manera imprecisa a pesar de la incorporación de la etiqueta en el locus previsto.Además, en los clones editados monoalélicamente, el alelo no marcado contiene con frecuencia indels, muy probablemente causados por la reparación de la unión de extremos no homólogos. Estos hallazgos subrayan la importancia de la validación genética después de que un knock in de CRISPR Cas9 solo se revelara a través del análisis del genoma de líneas celulares clonales. La expresión de la proteína de fusión esperada por sí sola no garantiza una edición precisa.Al utilizar este protocolo para la edición de células madre pluripotentes inducidas humanas, tenga cuidado de seguir las recomendaciones detalladas en el protocolo escrito para garantizar un manejo suave de las células para una supervivencia celular óptima y una diferenciación espontánea mínima. Esperamos que este video y la lista de protocolos y materiales asociados lo ayuden a realizar experimentos similares en su propio laboratorio con su proteína favorita. Gracias por mirar.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Las herramientas de edición del genoma, como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), han mejorado en gran medida la eficiencia de la selección de genes en células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Este manuscrito describe un protocolo para generar un indicador de hiPSC específico del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas.

Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Aquí, presentamos un protocolo de eliminación exon23 basado en Cas9 para restaurar la expresión de distrofina en iPSC a partir de fibroblastos cutáneos derivados del ratón Dmdmdx y diferenciar directamente los iPSC en células progenitoras miogénicas (MPC) utilizando el sistema de activación Tet-on MyoD.

Tecnología CRISPR/Cas9 en la restauración de la expresión de distrofina en progenitores musculares derivados de iPSC

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Un flujo de trabajo de microinyección CRISPR/Cas9 para el marcaje fluorescente endógeno en la línea germinal de Caenorhabditis elegans para obtener líneas homocigotas de knock-in para análisis in vivo de localización de proteínas.

Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans

Aprende a etiquetar proteínas endógenas en células madre pluripotentes humanas usando CRISPR/Cas9. Este método permite estudiar la dinámica proteica bajo control regulatorio endógeno con eficiencias de inserción de hasta el 95%.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

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