In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la organización de las células y las membranas, por ejemplo, qué papel juegan las señales geométricas en el proceso. La principal ventaja de esta técnica es que permite un control preciso sobre todos los aspectos que influyen en la formación de patrones, como las concentraciones de proteínas. Para empezar, genere vesículas multilaminares como se describe en el protocolo de texto.

Ahora, congele y descongele los lípidos durante siete a 10 ciclos, preparando primero un vaso de precipitados con agua a 70 a 99 grados centígrados en una placa caliente, así como un recipiente que contenga nitrógeno líquido. Sostenga el vial en nitrógeno líquido con pinzas grandes hasta que el nitrógeno deje de hervir. A continuación, transfiera el vial a agua caliente hasta que la solución se descongele por completo.

Repita estos pasos hasta que la mezcla de lípidos parezca clara a la vista, dependiendo de la mezcla. A continuación, monte un extrusor de lípidos y enjuague previamente el sistema con tampón Min. Extruya la mezcla de lípidos entre 35 y 41 veces a través de una membrana de 50 nanómetros de tamaño de poro.

Asegúrese de terminar en un número impar de pasadas para evitar agregados que nunca atravesaron la membrana. Distribuya los cubreobjetos de vidrio sobre una placa de Petri de vidrio invertida u otra superficie inerte. Con una pipeta de vidrio, agregue siete gotas de ácido sulfúrico concentrado en el centro de cada cubreobjetos.

Luego agregue dos gotas de peróxido de hidrógeno al 50% en el medio de las gotas de ácido. Cubra la reacción e incube durante al menos 45 minutos. Ahora, recoja los cubreobjetos individualmente con pinzas y enjuague el ácido con agua ultrapura.

Coloque los cubreobjetos lavados en soportes antiadherentes o en un dispositivo de transporte similar. Ahora enjuague abundantemente cada cubreobjetos con agua ultrapura y seque la superficie con gas a presión. Marque el lado limpio del cubreobjetos con un marcador permanente.

Para montar la cámara, primero corte y deseche la tapa y la parte cónica de un tubo de reacción de 0,5 mililitros con unas tijeras afiladas. A continuación, aplique pegamento UV en el borde superior del tubo y distribuya el pegamento de manera uniforme con la punta de una pipeta. Pega el tubo al revés en el lado limpio del cubreobjetos.

Finalmente, cure el pegamento UV colocando varias cámaras debajo de una lámpara de 360 nanómetros o LED durante cinco a 15 minutos. Para apoyar la formación de bicapas lipídicas, precaliente un bloque de calor a 37 grados centígrados e incube dos tubos de reacción de mililitros con tampón Min o SLB a un tubo por cámara. Sople nitrógeno en las cámaras ensambladas y curadas para eliminar el polvo u otras partículas que puedan haberse depositado durante el curado y el ensamblaje UV.

Luego, coloque las cámaras en el bloque de calor. Diluya una alícuota de 20 microlitros de lípidos claros con 130 microlitros de tampón Min, creando una concentración de trabajo de 0,53 miligramos por mililitro. Agregue 75 microlitros de la mezcla de lípidos a cada cámara.

Ahora, pon un temporizador en tres minutos. Durante el tiempo de incubación, las vesículas estallan en la superficie de vidrio hidrófilo y se fusionan para formar un SLB coherente. Una vez transcurridos los 60 segundos, añade 150 microlitros de tampón Min a cada cámara.

Después de los 120 segundos restantes, lave cada cámara agregando 200 microlitros de tampón Min o SLB, pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces, quitando y agregando otros 200 microlitros. Una vez que cada cámara se haya lavado una vez, proceda a lavar bien la primera cámara hasta que se agoten los dos mililitros de tampón. El lavado de bicapas lipídicas soportadas requiere cierta experiencia para perfeccionar el alcance de los movimientos en la cámara y encontrar la intensidad de lavado correcta.

Para producir microestructuras de PDMS a partir de obleas de silicio estampadas, primero use un vaso de plástico para pesar 10 gramos de base de PDMS y un gramo de reticulante de PDMS. Utilice un dispositivo de mezcla para mezclar y desgasificar la mezcla de PDMS. Ahora, use una punta de pipeta para dejar caer una pequeña cantidad de PDMS directamente sobre la estructura de la oblea de silicona.

Coloque inmediatamente 1 cubreobjetos en la gota de PDMS y tome el extremo superior de una punta de pipeta limpia para presionar suavemente el cubreobjetos sobre la oblea de silicona. El PDMS debe extenderse finamente entre el cubreobjetos y la oblea de silicona. Coloque la oblea con los cubreobjetos en un horno y cure el PDMS durante tres o cuatro horas, o toda la noche, a 75 grados centígrados.

A continuación, retira la oblea del horno y deja que se enfríe a temperatura ambiente. Con una cuchilla de afeitar, retire con cuidado el cubreobjetos con el PDMS adjunto de la oblea de silicona. Ahora, coloque una cámara de plástico en el PDMS como se describió anteriormente para el vidrio.

Tome los cubreobjetos con la cámara adjunta y colóquelos en un limpiador de plasma con oxígeno como gas de proceso. Limpie los cubreobjetos con plasma. En este trabajo se utilizó una potencia del 30% y una presión de oxígeno de 0,3 milibares durante un minuto.

Ahora, prepare un SLB en la cámara como se describió anteriormente en vidrio. Para realizar el ensayo de autoorganización, ajuste el volumen del tampón en la cámara a 200 microlitros de tampón mínimo, menos la cantidad de proteína y solución de ATP. A continuación, añada MinD, etiquetado como MinD, MinE y, si lo desea, MinC, y mezcle suavemente los componentes mediante pipeteo.

Ahora, agregue 2.5 milimolares de ATP para iniciar la autoorganización de MinDE. Durante los próximos 10 a 30 minutos, verifique la formación regular del patrón MinDE y las microestructuras formadas correctamente en un microscopio de fluorescencia. Cuando se hayan formado patrones MinDE regulares, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar los componentes.

Retire la gran cantidad de tampón con una pipeta de 100 microlitros y, a continuación, retire con cuidado el resto con una pipeta de 10 microlitros. Para permitir tiempos de imagen más prolongados, conecte un trozo de esponja humedecido dentro de la cámara. Asegúrese de que la esponja no entre en contacto con la superficie del cubreobjetos.

Cierre inmediatamente la cámara con una tapa para evitar el secado del tampón residual en las microestructuras. Antes de obtener imágenes de las microestructuras, confirme que la autoorganización de MinDE se detiene en la parte superior de la microestructura de PDMS mientras las proteínas en las microcavidades oscilan. En este video representativo, las imágenes de doble color muestran cómo MinD y MinE se autoorganizan en ondas superficiales viajeras que conforman patrones en espiral en bicapas lipídicas compatibles.

Aquí, las imágenes de un solo color muestran MinD y MinE realizando oscilaciones de polo a polo en microestructuras de PDMS. Las oscilaciones establecen un gradiente de concentración MinD promediado en el tiempo con la concentración máxima en los polos del compartimiento y la concentración mínima en el centro del compartimento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el seguimiento de una sola partícula, para determinar la cinética de unión a la membrana y los tiempos de residencia.

No olvide que trabajar con la solución de piraña puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal al realizar este procedimiento.