Name: In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a reconstituir la autoorganización de proteínas MinD y MinE en bicapas lipídicas soportadas usando microcompartimentos PDMS. Este método permite controlar precisamente la formación de patrones en estudios de biología celular.

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Agradecemos a Michael Heymann y Frank Siedler para la producción de silicio obleas, Core instalación MPI-B ayuda en la purificación de la proteína y Simon Kretschmer y Leon Harrington para comentarios sobre el manuscrito.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
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<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
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<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
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<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
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<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
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<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
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<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito un protocolo para la reconstitución en vitro de MinCDE uno mismo-organización en planar bicapas de lipidos y en lípidos bicapa cubiertas estructuras 3D, utilizando el ejemplo de microestructuras en forma de PDMS. Para obtener valiosos datos de estos ensayos, los factores más importantes a controlar son proteínas y membrana de calidad.
Para garantizar la calidad de proteína, proteína de masa debe confirmarse mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas. Además, debe verificarse que las proteínas son solubles y no agregados, mediante filtración de gel analítica o dispersión de luz dinámica. Filtración de gel puede utilizarse para quitar cualquier fracción de agregados de proteínas. Ajuste del pH cuidado y calidad de agregado nucleótidos es crítica, como la adición de nucleótidos parcialmente degradadas o no ajustados a la proteína de stocks o ensayos de auto-organización es suficiente para eliminar la actividad de la proteína, por lo tanto, supresión uno mismo-organización.
Junto a la calidad de la proteína, membrana de calidad es más crítica y formación inadecuada de la membrana suele ser la causa de la defectuosa organización autónoma y el origen de estructuras superficiales artefactuales.
Cuando se realiza el Protocolo por primera vez, es útil etiquetar las bicapas lipídicas soportadas mediante la inclusión de lípidos etiquetados como Atto-655-droga o DiI en bajos porcentajes molares (0.05%). Así las propiedades y la calidad de la membrana pueden medirse directamente. Con el FRAP, la fluidez de la membrana puede ser evaluada. Además, directamente uno puede evaluar la calidad de lavado de la SLB, como habrá o bien ser muchas vesículas, no hay membrana fluida o sin membrana, si ha sido lavada. El enfoque de la cámara abierto permite lavar rigurosamente la membrana y por lo tanto, también para eliminar las vesículas que se están pegando en la superficie de la SLB. Los factores más importantes para la obtención homogénea lipídicas bicapas son la limpieza y la hidrofilia de la superficie de apoyo y el correcto tamaño y homogeneidad de SUfrente puede ser útil comprobar tamaño SUV y el uso de distribución de tamaño dispersión ligera dinámica. Distribuciones de tamaño estrechas, se recomienda sacar las vesículas en lugar de les sonicando. Otros métodos de limpieza cubreobjetos, por ejemplo, tratamientos con bases fuertes, detergentes base o utilizando cubre-objetos directamente tras el enjuague con agua, pueden producir buenos resultados, dependiendo de la mezcla de aplicación y de los lípidos.
La primera mitad del protocolo presentado aquí, en vitro de la reconstitución en bicapas lipídicas planares en cámaras abiertas, tiene la ventaja de representar la superficie accesible de Microscopías ópticas, como TIRF microscopia30, FRAP Análisis6, solo-partícula seguimiento34, así como técnicas de sonda de superficie como de microscopía de fuerza atómica26. La gran superficie homogénea permite mejores estadísticas a concentraciones definidas. Además el enfoque de cámara abierta permite para controlar con precisión la concentración de proteína y una rápida y simple adición de otros componentes, permitiendo por lo tanto, para valorar la concentración de proteína en un solo compartimiento20. El ensayo también puede ser ampliado por la adición de otros componentes de la divisome bacteriana FtsZ22,35, ZipA22 o la proteína quimérica FtsZ-YFP-MTS10,35.
Otros grupos han adoptado un enfoque similar a reconstituir el Min sistema en vitro, pero uso una celda de flujo en lugar de un compartimiento abierto17,18,19. Células de flujo tienen ciertas ventajas, en particular cuando un entorno 3D totalmente cerrado es necesario18, la influencia de flujo17,19,23 o membrana composición23 patrones de MinCDE investigado, o si los patrones de proteína deben ser observadas bajo limitación de condiciones19de proteína. Sin embargo, el control local de la concentración molecular es más difícil. Componentes de proteína, especial mente, se unen fuertemente a la membrana se encuentra primero con18,19. En nuestra experiencia, las proteínas exhiben con frecuencia la Unión no específica a la tubería, entradas, jeringas y otras partes de microfluidos. Por lo tanto, las concentraciones de proteína local difieren de las concentraciones de entrada18 y también varían a lo largo de la célula de flujo, resultando en una variedad de patrones diferentes de proteínas en la membrana entre entrada y salida, según lo observado por otros19.
La segunda mitad del protocolo presentado aquí, la reconstitución en vitro en volver a utilizar el enfoque de la cámara abierto sobre un soporte con motivos cubierto por lípidos de microestructuras en forma bicapas permite un simple imitador en vivo el comportamiento de la proteína Aunque un control preciso sobre las concentraciones de la proteína se pierde debido a retiro de búfer. Tenga en cuenta que debido a la longitud de onda de MinDE es aproximadamente un orden de magnitud mayor en vitro que in vivo las microcompartments en forma son también sobre un orden de magnitud más grande (10 x 30 μm) que una en forma de e. coli de la célula.
En general, este protocolo permite el control preciso de todas las condiciones incluyendo la concentración de proteína, tampón composición y propiedades de la membrana. El uso de soportes estructurados 3D permite la reacción a estudiar bajo confinamiento espacial, imitando el comportamiento en vivo sin necesidad de equipos complejos de microfluídica.

Patrones espacio-temporales son esenciales en la naturaleza, regulación de tareas complejas a nivel celular y pluricelular, de morfogénesis a división celular regulada1,2. Reacción-difusión sistemas juegan un papel importante en el establecimiento de estos patrones, pero son todavía no bien entendidos. Un ejemplo de un sistema de reacción-difusión y el mejor sistema biológico caracterizado hasta ahora es la Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. El sistema MinCDE oscila entre polos de la célula al polo de la célula de e. coli para determinar el centro de la célula como el sitio de la futura división. Este sistema se basa en la mente de la ATPasa, la ATPasa proteína activadora, mina y la membrana como una matriz espacial de reacción de8. MinC no es parte del mecanismo de formación de patrón, pero es el real agente funcional: un inhibidor de la proteína FtsZ5,6del divisome principal. MinC se une a la mente y por lo tanto sigue las oscilaciones, lo que resulta en un gradiente de concentración de proteína promedio de tiempo que es máxima en los polos celulares y mínima en el centro de la célula, permitiendo sólo FtsZ polimerizar en midcell9,10 . El sistema de MinCDE es parte de la familia más grande de Walker A ATPases que son claves para la organización espacio-temporal en bacterias2, para la colocación y transporte de proteínas complejos plásmidos de11 y12 y para la regulación de la célula División13 y cromosoma segregación14. Por lo tanto, el sistema de reacción-difusión de MinCDE no sólo representa un sistema reacción-difusión arquetipo, sino que también ha atraído la atención debido a su importancia para la organización espacio-temporal en las bacterias.
Detallados estudios funcionales de la MinCDE sistema en vivo son complicados, como manipulación de eliminación de proteínas y genes típicamente resultan en defectos de la división celular. Además, es muy difícil cambiar la composición de la membrana o las propiedades de cytosol en vivo 15,16. Los cambios en el sistema y que influyen en factores son difíciles de interpretar en el ambiente complejo de la célula, más aún si se disturba en una función tan esencial como la división celular. Nosotros y otros hemos convertido, por tanto, a un enfoque de reconstitución en vitro , reducir el sistema a sus componentes: mente, mina, ATP como fuente de energía y la bicapa lipídica compatibles como una reacción matriz6,17, 18. este enfoque bottom-up permite investigar el mecanismo de la uno mismo-organización en detalle sin la complejidad de una célula viva. La forma de las proteínas viajando superficie ondas6 y otras clases de patrones17,19 bajo estas condiciones, aunque con una longitud de onda que está generalmente sobre una magnitud más grande que en vivo. El uso de una cámara abierta facilita un control preciso sobre todos los aspectos que influyen en la formación de patrones: las concentraciones de proteína6, proteína propiedades20, membrana composición10, tampón composición y concentración de ATP 6, así como la adición de otros factores como la aglomeración de agentes21 y otros de proteínas de divisome22. En comparación, en vitro la reconstitución del sistema MinCDE en una celda de flujo18,19,23 puede utilizarse para probar la influencia de flujo17,23, proteína limitación de las condiciones19, membrana composición19 y confinamiento 3D18 patrones de proteína, pero representa un control exacto de la concentración de proteína o componente y además componente secuencial mucho más complicado.
Usando esta cámara abierta, también modelado el apoyo de las bicapas de lípidos planar por que uno puede probar cómo geométrica límites influencia patrón formación21, un fenómeno que recientemente ha sido también investigado en vivo utilizando bacterias moldeado en microestructuras7. También se empleó este ensayo para investigar cómo definidas mutaciones en mina afecta formación de patrones del sistema20. Además, el mismo formato básico del ensayo se ha empleado para investigar cómo la formación puede ser controlada por luz, introducir un péptido de mina azobenzene-reticulado en el análisis y proyección de imagen de microscopía TIRF24.
Encontramos que, con el fin de replicar el modelo MinDE observa formación en vivo en un confinamiento de sistema, en vitro fue clave. Permite el uso de bastoncillos microcompartments, con dimensiones de ajustar la longitud de onda mayor de MinDE en vitro (10 x 30 μm), revestido de una bicapa lipídica compatibles la reconstitución de MinDE oscilaciones de polo a Polo y la formación de gradiente de la proteína 10,25. En este ensayo, las bicapas lipídicas soportadas son depositados sobre un substrato PDMS modelado que contiene varios cientos réplicas de microcompartments barra-formado que permanecen abiertas en la parte superior. Por esto, la reacción se puede configurar en una cámara abierta, y posteriormente el tampón se baja hasta el borde de la microcompartments, confinando así la reacción a un pequeño volumen. A pesar de estos compartimientos tienen una interfaz de aire-buffer en un lado y por lo tanto no representan un confinamiento completamente en 3D por la membrana, la dinámica de la proteína mímico en vivo oscilaciones10,25. En comparación con el confinamiento completamente en 3D, que muestra muy similar resultados18, el análisis de microestructuras abierto es relativamente simple y fácil de manejar y pueden ser realizadas por laboratorios que no cuentan con equipo especializado de la microfluídica y instalaciones de sala limpia.
Aquí, presentamos un protocolo experimental para reconstituir MinCDE formación en apoyo lípidos bicapas en vitro usando una cámara abierta que permite controlar todos los componentes y fácil acceso por microscopía óptica y, con menor modificaciones, es también adaptable para técnicas de sonda de superficie de26. Al lado de bicapas lipídicas planares, mostramos también como aislamiento de proteína puede ser obtenida usando bicapas lipídicas con motivos simples de microestructuras en forma de PDMS. Estos ensayos, aunque optimizado para el sistema MinCDE, pueden también transferirse a otros sistemas de proteínas que interactúan en una manera similar con la membrana, como FtsZ27 o una corteza actina mínimo del28.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></DOPC fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Lípidos polares Avanti 850375</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Lípidos polares Avanti</td><td>840475</td><td></td></tr> Extracto lipídico <tr><td>polar de E. coli</td><td>Ávidos Lípidos Polares Avanti</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sódico sal trihidrato</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato sal monopotásica dihidratada</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tetraacetato de etileno diamina</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glicerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarosa</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>Reticulante PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 y #63 funcionan bien</td></tr><tr><td>Cubreobjetos #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>utilizado solo para microestructuras PDMS</td></tr><tr><td>tubo de reacción de 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>matraz</tr><tr>de<td>cultivo 0030123301 2L Corning</td><td></td><td>, p. ej. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td> Columna de <td></td><td></td></tr><tr><td>gelfiltración: HiLoad Superdex 75 PG o 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences Econo-Pac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10DG columna de desalinización columna preempaquetada</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo de diálisis: Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 mL o 0.5-3 mL Termo</td><td>Fisher Scientific</td><td>66333 o 66330</td><td></td></tr> hoja de <tr><td>afeitar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td>ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Sistema automatizado de purificación de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> proteínas <td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: &Auml; kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td> sonicador de <td></td><td></td></tr><tr><td>baño Branson</td><td></td><td></td><td>, p. ej., Modelo 1510</td></tr><tr><td>Mezclador ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma Zepto</td><td>Diener uso electrónico</td><td></td> oxígeno <td>como gas de proceso</td></tr><tr><td>pipetas de desplazamiento positivo</td><td>Marca</td><td></td><td>Transferpettor modelos con puntas</td></tr> <tr><td>de vidrioMicroscopio de barrido láser confocal LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Equipado con Zeiss C-Apochromat 40X/1.20</td></tr> objetivo<tr><td><plásmidos fuertes>plásmidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Departamento de Biofísica Celular y Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plásmido que codifica His-MinD y MinE no marcado para mejorar el rendimiento</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Departamento de Biofísica Celular y Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plásmido que codifica His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Departamento de Biofísica Celular y Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plásmido que codifica His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Departamento de Biofísica Celular y Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille</td><td></td><td>codificación de plásmidos His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Departamento de Biofísica Celular y Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plásmido que codifica His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Muchos aspectos de la organización espacio-temporal fundamental de las células se rigen por sistemas de reacción-difusión. In vitro de la reconstitución de estos sistemas permite estudios detallados de sus mecanismos subyacentes que no sería factibles en vivo. Presentamos un protocolo para la reconstitución en vitro del sistema MinCDE de Escherichia coli, lo que posiciona el tabique de división celular en el centro de la célula. El ensayo está diseñado para suministrar sólo los componentes necesarios para auto-organizarse, es decir, una membrana, las dos proteínas mente y minas y energía en forma de ATP. Por lo tanto fabricamos una cámara de reacción abiertos en un cubreobjetos, en el cual se forma una bicapa lipídica compatibles. El diseño abierto de la cámara permite una óptima preparación de la bicapa lipídica y manipulación controlada de los contenidos a granel. Las dos proteínas, mente y mina, así como ATP, entonces se añade en el volumen del bulto por encima de la membrana. La proyección de imagen es posible por muchos Microscopías ópticas, como los soportes de diseño confocales, amplio campo y microscopía TIRF por igual. En una variación del Protocolo, la bicapa lipídica está formada sobre un soporte de modelado, en microestructuras PDMS en forma de células, en lugar de vidrio. La solución a granel en el borde de estos compartimentos incluye la reacción en un compartimento más pequeño y proporciona límites que mímico el de en vivo el comportamiento oscilatorio. Tomados en conjunto, se describen los protocolos para reconstituir el sistema de MinCDE con y sin confinamiento espacial, permitiendo a los investigadores controlar con precisión todos los aspectos que influyen en la formación de patrones, tales como concentración y además de otros factores o proteínas y aumentar sistemáticamente la complejidad del sistema en una configuración experimental relativamente simple.

Siguiendo nuestro protocolo de purificación de proteínas debe producir proteínas Min de pureza adecuada. Como referencia, figura 1 proporciona una imagen de SDS-PAGE de la mente, fluorescencia etiquetada mente mía y MinC. Cada paso del procedimiento para realizar un análisis de la propia organización de MinDE en bicapas lipídicas con motivos no se describe en la figura 2. Mediante este protocolo, se observan MinDE regular superficie ondas viajeras a lo largo de la cámara (figura 3). La longitud de onda puede variar levemente dentro de la cámara, pero en general parecen patrones. Los bordes de la cámara no puede usarse para comparaciones cuantitativas, como las membranas que se forman en el pegamento Ultravioleta parece tener diferentes propiedades que en el cristal de la superficie (ver figura 3). Las ondas superficiales viajan pueden analizarse mediante la representación de la intensidad a lo largo de la dirección de propagación (figura 3B). Mientras que presente fluorescencia mesetas bastante rápido de la vanguardia de la ola y luego disminuye abruptamente en el borde de fuga, mina la fluorescencia aumenta casi linealmente desde el comienzo de la onda de la mente y alcanza su máximo después de la mente en el borde de fuga, donde se cae marcadamente6.
Junto a la calidad de la proteína, la calidad de las bicapas lipídicas soportadas es más crítica para una auto organización regular de MinCDE. Por un lado si la membrana se lava demasiado excesivamente o la superficie subyacente ha sido limpiada y así carga demasiado fuertemente, pueden formar agujeros en la membrana (figura 6A, parte superior). Por otro lado si la membrana no se lava correctamente o la superficie subyacente no es limpiado/hydrophilized, la vesículas se adhieren a la membrana o se verá afectada la fluidez de la membrana (figura 6A, parte inferior). Aunque no son tan evidentes al observar la membrana directamente a través de lípidos marcados, estos problemas también pueden ser detectados desde la señal de fluorescencia de la mente, como los patrones no son regulares y la fluorescencia en la maxima no es homogénea sino que contiene "huecos" o puntos brillantes como se muestra en el panel central de la figura 6A.
Para la autoorganización MinDE en microestructuras PDMS en forma el procedimiento se resume en la figura 4. Varios pasos del Protocolo no necesita ser repetido, como las proteínas y los lípidos pueden ser reutilizados. Como en los substratos no-patrón, el sustrato se limpia y hydrophilized (por limpieza de plasma), se forma una bicapa lipídica apoyado en el PDMS y el análisis de uno mismo-organización se configura en un volumen de 200 μl. Para comprobar que se ha formado una membrana apropiada y MinDE uno mismo-organiza en la membrana, son imágenes de las cámaras. Cuando una membrana apropiada se ha formado, MinDE formas regular superficie ondas viajeras en la superficie de los PDMS entre las microestructuras individuales y también uno mismo-organiza en la parte inferior de las microestructuras como las ondas pueden libremente mover en toda la superficie de membrana (figura 5A). Después del retiro de búfer, la superficie entre los compartimientos no debe presentar cualquier propagación patrones MinDE (figura 5B), debe estar completamente seco. Si sigue moviendo MinDE patrones, más buffer debe ser extirpado. Las proteínas se limitan ahora en el microcompartments barra-formado por el PDMS revestido de membrana y por el aire en la interfaz superior (figura 5), en el que se auto-organizarse. Bajo estas condiciones las dos proteínas pueden realizar oscilaciones de poste a poste como se muestra en la figura 5. Como una fracción de la mente y la mía siempre unida a la membrana, también durante la extracción del buffer, las concentraciones después de retiro del tampón no son comparables con las concentraciones de entrada. Debido a este efecto las concentraciones también varían entre microestructuras individuales sobre el mismo cubreobjetos como dependen de la posición de los patrones antes de la eliminación de búfer. Producción de la oblea de silicio o moldeado de PDMS de la oblea de silicio resulta en microestructuras incompletas que no pueden utilizarse para el análisis (Figura 6B). Además, debido al búfer de microestructuras de retiro podrían secarse durante el proceso y por lo tanto, deben excluirse del análisis (Figura 6B). Como resultado sólo una fracción de las microestructuras en una cámara de muestra las oscilaciones deseadas de polo a Polo. Para analizar la dinámica de la proteína en las microestructuras, puede obtenerse una kymograph dibujar una selección sobre toda la estructura (figura 5E). Cuando MinCDE oscilan de polo a Polo, MinC y mente mostrará un gradiente de concentración promedio de tiempo de concentración máxima en los polos del compartimiento y la concentración mínima en el compartimiento (figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: muestra los productos finales de purificaciones de proteínas SDS-PAGE. Su mente (33,3 kDa), su-eGFP-mente (60,1 kDa), su-mRuby3-mente (59,9 kDa), su mina (13,9 kDa) y su-MinC (28,3 kDa) se muestran en orden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo del proceso mostrando cada paso y momento de protocolo para un auto-organizarse en bicapas lipídicas con motivos no soportadas (pasos 1-6). Cajas punteadas indican que una de estas dos opciones puede utilizar para la limpieza. Las flechas marcadas por círculos indican donde el protocolo puede ser pausado y reanudado más tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: proyección de imagen de MinDE análisis mediante microscopía confocal. A) espiral Min Regular, de que velocidad de la propagación de la onda, trama de la intensidad y la velocidad pueden obtenerse mediciones. Concentraciones utilizadas: 0,6 μm mente (eGFP-mente del 30%), 1,8 μm su mina (30% su-mina-Alexa647) B) parcela de intensidad normalizada de ejemplo para la región marcada en A. C) Resumen de la cámara de ensayo completo (barra de escala: 1 m m, la misma concentración de proteína como arriba). Espirales o sentido de giro, así como se pueden observar patrones de blanco. La región ampliada muestra cómo los patrones de onda difieren sobre el pegamento Ultravioleta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: Diagrama de flujo del proceso mostrando cada paso y momento del protocolo para la uno mismo-organización en microestructuras en forma de bastoncillos (pasos 1-5, 7, 8). Cajas gris indican pasos donde los productos pueden ser reutilizados del protocolo en bicapas lipídicas no modelado. Las flechas marcadas por círculos indican donde el protocolo puede ser pausado y reanudado más tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: resultados representativos para MinDE formación en microcompartments PDMS barra-formado del patrón. A) MinDE auto-organizarse en la superficie de PDMS formando la superficie ondas viajeras (mente de 1 μm (30% EGFP-mente), 2 μm mina y mM 2,5 ATP). B) después de que el búfer se baja a la altura de las microestructuras, la autoorganización de la proteína se detiene en la superficie plana entre el microcompartments. C) esquemático de un microcompartment en forma de barra. D) imágenes representativas de MinDE oscilaciones de polo a Polo después del retiro de búfer. E) Kymograph de las oscilaciones a lo largo de la línea resaltada se muestra en D). F) imagen y Perfil de la intensidad de fluorescencia media de la serie de tiempo se muestra en D) que claramente muestra el gradiente de la proteína que es máxima en microcompartment polos y mínima en el medio del compartimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: ejemplos de resultados experimentales negativos. A) membranas demasiado lavadas acumulan los agujeros, mientras que preparaciones vesícula subóptima y composiciones de lípidos llevan a pegarse las vesículas. Los paneles del dos centro muestran una combinación de problemas y cómo llegan a ser visibles al observar oscilaciones de Min. Las membranas fueron etiquetadas con 0.05% Atto655-droga. (barras de escala: 50 μm) B) panel superior: secado microcompartments puede ser causado por demasiada extracción tampón o cuando el buffer se evapora con el tiempo. Panel inferior: compartimientos incompletos pueden ser formados durante la producción de la oblea o moldeado de PDMS. (barras de escala: 30 μm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo adicional 1: Mapa de plásmido para su mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo adicional 2: Mapa de plásmido para su-EGFP-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Mapa de plásmido para la su-mRuby3-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo adicional 4: Mapa de plásmido para su mina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 5: Mapa de plásmido para su MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 6: Archivo CAD de la oblea de silicio de microcompartments barra-formado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la organización de las células y las membranas, por ejemplo, qué papel juegan las señales geométricas en el proceso. La principal ventaja de esta técnica es que permite un control preciso sobre todos los aspectos que influyen en la formación de patrones, como las concentraciones de proteínas. Para empezar, genere vesículas multilaminares como se describe en el protocolo de texto.Ahora, congele y descongele los lípidos durante siete a 10 ciclos, preparando primero un vaso de precipitados con agua a 70 a 99 grados centígrados en una placa caliente, así como un recipiente que contenga nitrógeno líquido. Sostenga el vial en nitrógeno líquido con pinzas grandes hasta que el nitrógeno deje de hervir. A continuación, transfiera el vial a agua caliente hasta que la solución se descongele por completo.Repita estos pasos hasta que la mezcla de lípidos parezca clara a la vista, dependiendo de la mezcla. A continuación, monte un extrusor de lípidos y enjuague previamente el sistema con tampón Min. Extruya la mezcla de lípidos entre 35 y 41 veces a través de una membrana de 50 nanómetros de tamaño de poro.Asegúrese de terminar en un número impar de pasadas para evitar agregados que nunca atravesaron la membrana. Distribuya los cubreobjetos de vidrio sobre una placa de Petri de vidrio invertida u otra superficie inerte. Con una pipeta de vidrio, agregue siete gotas de ácido sulfúrico concentrado en el centro de cada cubreobjetos.Luego agregue dos gotas de peróxido de hidrógeno al 50% en el medio de las gotas de ácido. Cubra la reacción e incube durante al menos 45 minutos. Ahora, recoja los cubreobjetos individualmente con pinzas y enjuague el ácido con agua ultrapura.Coloque los cubreobjetos lavados en soportes antiadherentes o en un dispositivo de transporte similar. Ahora enjuague abundantemente cada cubreobjetos con agua ultrapura y seque la superficie con gas a presión. Marque el lado limpio del cubreobjetos con un marcador permanente.Para montar la cámara, primero corte y deseche la tapa y la parte cónica de un tubo de reacción de 0,5 mililitros con unas tijeras afiladas. A continuación, aplique pegamento UV en el borde superior del tubo y distribuya el pegamento de manera uniforme con la punta de una pipeta. Pega el tubo al revés en el lado limpio del cubreobjetos.Finalmente, cure el pegamento UV colocando varias cámaras debajo de una lámpara de 360 nanómetros o LED durante cinco a 15 minutos. Para apoyar la formación de bicapas lipídicas, precaliente un bloque de calor a 37 grados centígrados e incube dos tubos de reacción de mililitros con tampón Min o SLB a un tubo por cámara. Sople nitrógeno en las cámaras ensambladas y curadas para eliminar el polvo u otras partículas que puedan haberse depositado durante el curado y el ensamblaje UV.Luego, coloque las cámaras en el bloque de calor. Diluya una alícuota de 20 microlitros de lípidos claros con 130 microlitros de tampón Min, creando una concentración de trabajo de 0,53 miligramos por mililitro. Agregue 75 microlitros de la mezcla de lípidos a cada cámara.Ahora, pon un temporizador en tres minutos. Durante el tiempo de incubación, las vesículas estallan en la superficie de vidrio hidrófilo y se fusionan para formar un SLB coherente. Una vez transcurridos los 60 segundos, añade 150 microlitros de tampón Min a cada cámara.Después de los 120 segundos restantes, lave cada cámara agregando 200 microlitros de tampón Min o SLB, pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo varias veces, quitando y agregando otros 200 microlitros. Una vez que cada cámara se haya lavado una vez, proceda a lavar bien la primera cámara hasta que se agoten los dos mililitros de tampón. El lavado de bicapas lipídicas soportadas requiere cierta experiencia para perfeccionar el alcance de los movimientos en la cámara y encontrar la intensidad de lavado correcta.Para producir microestructuras de PDMS a partir de obleas de silicio estampadas, primero use un vaso de plástico para pesar 10 gramos de base de PDMS y un gramo de reticulante de PDMS. Utilice un dispositivo de mezcla para mezclar y desgasificar la mezcla de PDMS. Ahora, use una punta de pipeta para dejar caer una pequeña cantidad de PDMS directamente sobre la estructura de la oblea de silicona.Coloque inmediatamente 1 cubreobjetos en la gota de PDMS y tome el extremo superior de una punta de pipeta limpia para presionar suavemente el cubreobjetos sobre la oblea de silicona. El PDMS debe extenderse finamente entre el cubreobjetos y la oblea de silicona. Coloque la oblea con los cubreobjetos en un horno y cure el PDMS durante tres o cuatro horas, o toda la noche, a 75 grados centígrados.A continuación, retira la oblea del horno y deja que se enfríe a temperatura ambiente. Con una cuchilla de afeitar, retire con cuidado el cubreobjetos con el PDMS adjunto de la oblea de silicona. Ahora, coloque una cámara de plástico en el PDMS como se describió anteriormente para el vidrio.Tome los cubreobjetos con la cámara adjunta y colóquelos en un limpiador de plasma con oxígeno como gas de proceso. Limpie los cubreobjetos con plasma. En este trabajo se utilizó una potencia del 30% y una presión de oxígeno de 0,3 milibares durante un minuto.Ahora, prepare un SLB en la cámara como se describió anteriormente en vidrio. Para realizar el ensayo de autoorganización, ajuste el volumen del tampón en la cámara a 200 microlitros de tampón mínimo, menos la cantidad de proteína y solución de ATP. A continuación, añada MinD, etiquetado como MinD, MinE y, si lo desea, MinC, y mezcle suavemente los componentes mediante pipeteo.Ahora, agregue 2.5 milimolares de ATP para iniciar la autoorganización de MinDE. Durante los próximos 10 a 30 minutos, verifique la formación regular del patrón MinDE y las microestructuras formadas correctamente en un microscopio de fluorescencia. Cuando se hayan formado patrones MinDE regulares, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces para mezclar los componentes.Retire la gran cantidad de tampón con una pipeta de 100 microlitros y, a continuación, retire con cuidado el resto con una pipeta de 10 microlitros. Para permitir tiempos de imagen más prolongados, conecte un trozo de esponja humedecido dentro de la cámara. Asegúrese de que la esponja no entre en contacto con la superficie del cubreobjetos.Cierre inmediatamente la cámara con una tapa para evitar el secado del tampón residual en las microestructuras. Antes de obtener imágenes de las microestructuras, confirme que la autoorganización de MinDE se detiene en la parte superior de la microestructura de PDMS mientras las proteínas en las microcavidades oscilan. En este video representativo, las imágenes de doble color muestran cómo MinD y MinE se autoorganizan en ondas superficiales viajeras que conforman patrones en espiral en bicapas lipídicas compatibles.Aquí, las imágenes de un solo color muestran MinD y MinE realizando oscilaciones de polo a polo en microestructuras de PDMS. Las oscilaciones establecen un gradiente de concentración MinD promediado en el tiempo con la concentración máxima en los polos del compartimiento y la concentración mínima en el centro del compartimento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el seguimiento de una sola partícula, para determinar la cinética de unión a la membrana y los tiempos de residencia.No olvide que trabajar con la solución de piraña puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra una técnica in vitro para estudiar la formación de sinapsis inmune entre las células T humanas primarias y las bicapas lipídicas soportadas (SLB). Las proteínas de la superficie de las células T interactúan con los respectivos ligandos inmovilizados en SLB para formar una sinapsis inmunitaria, seguida del movimiento de los gránulos líticos hacia la sinapsis, que se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Aquí presentamos dos protocolos ultrarrápidos para la reconstitución de proteínas de membrana en proteoliposomes fusogénicas y fusión de tales proteoliposomes con bicapas de lípidos de destino para la entrega de detergente libre de estas proteínas de membrana a la bicapa postfusion. La combinación de estos enfoques permite a Asamblea rápida y fácilmente controlado de los sistemas de membranas de varios componentes complejos.

Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes.

Apoyo sólido, libre de proteína, dobles membranas de bicapa de fosfolípidos (DLBM) pueden transformarse en redes de nanotubos de lípidos complejos y dinámicos y pueden servir como modelos 2D de abajo hacia arriba del retículo endoplasmático.

Formación espontánea y cambio de redes de nanotubos lipídica Artificial como un modelo Bottom-Up de retículo endoplasmático

La fusión mitocondrial es una reacción homeostática importante subyacente a la dinámica mitocondrial. Aquí se describe un sistema de reconstitución in vitro para estudiar la fusión de membrana interna mitocondrial que puede resolver el anclaje de membrana, acoplamiento, hemisfusión y apertura de poros. Se discute la versatilidad de este enfoque en la exploración de los sistemas de membrana celular.

Una plataforma de membrana modelo para la reconstitución de la dinámica de membrana mitocondrial

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Aquí, se describe un protocolo para generar patrones de proteínas regulados por luz y reversibles con alta precisión espacio-temporal en membranas lipídicas artificiales. El método consiste en la fotoactivación localizada de la proteína iLID (dímero mejorado inducible por la luz) inmovilizada en membranas modelo que, bajo luz azul, se une a su proteína asociada Nano (SspB de tipo salvaje).

Patrones dinámicos de proteínas inducidos por la luz en membranas modelo

Aprende a reconstituir la autoorganización de proteínas MinD y MinE en bicapas lipídicas soportadas usando microcompartimentos PDMS. Este método permite controlar precisamente la formación de patrones en estudios de biología celular.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

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