Name: Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a usar el trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el potencial maligno de células modificadas genéticamente en modelos de síndrome mielodisplásico. Este método permite identificar células iniciadoras de la enfermedad.

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Este trabajo fue financiado por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud (números ZIA SC 010378 y BC 010983 la concesión).

Los animales procedimientos descritos en este artículo fueron aprobados por el Instituto Nacional del cáncer en el Comité de uso y cuidado de animales de Bethesda y conforme a las políticas dentro de la política de servicio de salud pública en cuidado humano y uso de animales de laboratorio, la Ley de bienestar animal y la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. preparación de la célula
<ol><li>Cosecha de la médula células nucleadas (BMNC)<ol>
<li>Utilizar sólo material estéril. Esterilizar instrumentos reutilizables mediante un autoclave de vapor. Compra de agujas, jeringas y artículos de plástico en recipientes estériles de uso individual. Realizar todas las manipulaciones animal y la célula en una clase II, cabina de seguridad biológica de tipo A2.</li>
		<li>Preparar BMNCs de 14 mL tubo inferior que contiene 3 mL de HF2 (Hank equilibrada solución de sal suplementado con 2% de suero bovino fetal).</li>
		<li>Eutanasia C57Bl6 ratones donantes (positivos para CD45 alelo CD45.2), la edad por lo general 2-6 meses, usando una cámara de CO2 .</li>
		<li>Esterilizar el cadáver del ratón rociando etanol al 70% en todo el cuerpo con una botella de spray. Pelar la piel de las piernas, desde la pelvis hasta el tobillo.</li>
		<li>Retire los fémures y tibias de la canal utilizando tijeras estériles (recto, agudo/sharp, 11,5 cm) y pinzas (Graefe, serrado, ancho de punta de 0,8 mm). Corte claramente los músculos correspondientes.</li>
		<li>Corte los extremos proximales y distales de la tibia con las tijeras. Sostiene la tibia con fórceps, inserte una jeringa de 3 mL de indicador de 27 que contienen 2,5 mL de HF2 en la cavidad de la médula ósea tibial en el extremo distal de la tibia (tobillo). Lavar las células de la médula ósea de la tibia mediante una presión suave en la 14 mL tubo de fondo redondo.<ol>
<li>Repita para la otra tibia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Corte los extremos proximales y distales del fémur con tijeras. Ras de la cavidad de la médula ósea de fémur mediante la inserción de una aguja de calibre 20, unida a una jeringa de 3 mL conteniendo 2,5 mL de HF2 en el extremo distal de la cavidad de la médula ósea de fémur y aplicando presión suave en la jeringa.<ol>
<li>Repita para el fémur, que recoge toda la médula ósea de ambas tibias y fémures en la misma 14 mL redondo tubo inferior.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dispersar la masa de la médula ósea por aspiración hacia arriba y hacia abajo varias veces con la misma aguja de calibre 20, unida a la jeringa de 3 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tinción de anticuerpo de BMNC<ol>
<li>Cuenta BMNC. Añadir 20 μl de una solución de ácido acético 3% a 20 μl de la suspensión BMNC generó en el paso 1.1.8. Entonces, contar con un hemocitómetro y un microscopio invertido.</li>
		<li>El BMNC de pellets por centrifugación suave 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con HF2 con 90 μl por 107 células y añadir 10 μl de anticuerpo anti-linaje de biotinilado cóctel a la suspensión de células.</li>
		<li>Después de incubar durante 20 min a 4 ° C, se lavan las células teñidas con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Resuspender el BMNC con 100 μl de HF2 107 células. Añadir 2 μl de allophycocyanin (APC) conjugado anticuerpo anti-biotina a la suspensión de células, seguido por la incubación a 4 ° C por 20 min.</li>
		<li>Enjuague el BMNC manchada con 3 mL de PBS y resuspender BMNC con HF2 suplementado con 0.2 μg/mL de yoduro de propidio (PI) para la clasificación de flujo citometría celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry célula clasificación de BMNC<ol>
<li>Calibrar el clasificador de células de citometría de flujo. Optimizar todos los tubos de fotomultiplicador (PMTs), dispersión y parámetros de fluorescencia utilizando células sin manchas y dentro de la gama lineal de cada detector.</li>
		<li>Preparar sin manchas, teñidos de PI, y APC marcado linaje células cóctel paralelamente en el paso 1.2. Analizar para compensación espectral.</li>
		<li>Discrimina las células doblete por sincronización secuencial de FSC-H vs SSC-H 640-SSC-A vs 640-SSC-H y 640-SSC-S vs 640-SSC-W.</li>
		<li>Excluir las células viables mediante PI excitado en 561 nm y de emisión con un filtro de paso banda 614/20. Excitar el linaje APC etiquetado celdas de 640 nm y recoger la emisión con un filtro de paso banda 671/30.</li>
		<li>Anote los valores de fluorescencia como altura voltaje y recoger por lo menos 100.000 eventos en archivos de datos de modo lista para visualizar las poblaciones a ser ordenados.</li>
		<li>Calcular indemnización espectral después de la adquisición de tres muestras de 10.000 células por lo siguiente: sin etiqueta células, PI etiquetado células y cóctel de linaje el anticuerpo conjugado con APC etiquetado células.</li>
		<li>Establecer tres regiones para ordenar linaje negativo (LN), linaje positivo (LP) con intensidad de fluorescencia tenue (LP1) y la población de LP con fluorescencia brillante (LP2) en tubos de 5 mL con 0,5 mL de 10% FBS medios.</li>
		<li>Las células tipo usando una gota envuelven y purifican el modo de carga abortada.</li>
		<li>Realizar análisis de tipo post con 1.000 células totales en cada muestra seleccionada para confirmar la pureza y viabilidad de las células clasificadas.</li>
		<li>Recoge ordenada de las células por centrifugación a 450 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el pellet celular con 0,5 mL de HF2.</li>
		<li>Confirman clasificado celular número con hemocitómetro y azul de tripano. Ajustar el número de células con HF2 para el trasplante. Nota: Un amplio espectro de poblaciones BMNC puede ser aislado para trasplante usando combinaciones adicionales de anticuerpos conjugados con fluorocromo en el paso anterior 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. receptor ratones preparación y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT)
<ol><li>Preparación de los receptores de trasplante<ol>
<li>Mantener la veterinaria y cría cuidado congenic ratones receptores (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) en un patógeno específico (SPF) animal servicio de gratuito.</li>
		<li>De descontaminación profiláctica de la vía gastrointestinal, proporcionar agua estéril que contiene 100 mg/L de ciprofloxacina a los destinatarios durante 7 días antes de la irradiación letal dosis (9 Gy) y mantener durante 14 días después de la irradiación.</li>
		<li>Proporcionar una irradiación de dosis letal (9 Gy) de una fuente de Cs como sigue. Usar un operador entrenado, certificado de la Cs. Establecer el instrumento de la fuente de Cs para entregar 70 cGy/min dosis de radiación gamma corporal total. 10 ratones en un soporte diseñado e Inserte el soporte en la cámara del Irradiador. Entregar irradiación de cuerpo total 9 Gy en 13 minutos y volver a los ratones a sus jaulas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasplante de células madre hematopoyéticas<ol>
<li>Mezcla de tipo salvaje (WT) BMNC de un ratón receptor Congénicos (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) en una dosis de celda de 2 x 105 células por ratón con 2 a 5 x 104 células de la prueba purificada que BMNC preparado con citometría de flujo clasificación como arriba se describe en 1.3. Mezcla de células en la misma jeringa. Nota: El peso BMNC proporcionan un efecto economizador de radiación al ratón receptor y permiten la supervivencia del receptor ratón si las células de prueba no son compatibles con la hematopoyesis. La WT BMNC utilizado en este tipo de experimento expresa el alelo CD45.1 y así se pueden distinguir de las células de prueba usando los anticuerpos que discriminen entre CD45.1 y CD45.2. Las células del BM de WT se refieren como "linfocitos", "células escasamente la radiación" o "células del competidor".</li>
		<li>Ajustar el volumen de la mezcla de células a 200 μL por destinatario utilizando HF2 estéril para facilitar la inyección.</li>
		<li>Trasplante de las mezclas de la célula a la ratones receptores irradiados letalmente via cola intravenoso Inyección en la vena usando una jeringa de 1 mL y aguja de calibre 28, dentro de las 24 horas de irradiación. Colocar la cola de ratón bajo una lámpara de calor, calor conduce a la dilatación de la vena de la cola. Nota: Eutanasia a todos los ratones receptores al final del estudio y evaluar la progresión de la enfermedad por la necropsia, la histología y la citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. engraftment análisis mediante citometría de flujo
<ol><li>Para evaluar el engraftment de la célula donante, recoger sangre periférica (PB) de los ratones receptores en semana 6, semana 12 y 16 semanas después del trasplante.</li>
	<li>Caliente a los destinatarios en la jaula con la lámpara de calor durante aproximadamente 1 minuto y coloque un limitador de un ratón.</li>
	<li>Cortar la vena de la cola con un bisturí (hoja 10 mango de bisturí #3) y recoger 100 μl de PB por destinatario utilizando un tubo de microcapillary que contiene EDTA como anticoagulante.</li>
	<li>Dividir el PB recogido en dos alícuotas iguales colocando 50 μL en un tubo de microcentrífuga estéril. Utilizar una alícuota de un automatizado hemograma completo (CBC) (realizado en el centro de la histopatología de NCI) y utilizar la segunda alícuota de anticuerpos y citometría de flujo.</li>
	<li>Para detectar el engraftment de la donante mediante citometría de flujo, lisar los glóbulos rojos (RBC) añadiendo 1 mL de tampón de lisis RBC hipotónica (8,29 g/L de NH4Cl, 1 g/L de KHCO3, 0,037 g/L de Na2EDTA, pH 7,2) a 50 μl de la PB recogido. Vórtice de la muestra, mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue el PB sometidas a lisis a 4.600 x g para 1,5 min. cuidadosamente aspirar el sobrenadante y desechar.</li>
	<li>Interrumpir parcialmente el precipitado de células suavemente golpeando ligeramente o "sacudiendo" el fondo del tubo. Agregar 1,3 mL de PBS en el sedimento situado en tubo y centrifugar a 4.600 x g durante 1,5 minutos cuidadosamente aspirar y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Interrumpir el precipitado de células golpeando o sacudiendo y añadir 200 μL de HF2 suplementado con 5% de suero de rata para el precipitado de células.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo anti-CD45.2 (1 μl de) conjugado con allophycocyanin (APC) a la suspensión de células. Incubar a 4 ° C durante al menos 30 min y brevemente vórtice la mezcla.</li>
	<li>Después de la tinción, lavan las células dos veces como se describió anteriormente y resuspender con 400 μL de HF2 1 μg/ml de PI.</li>
	<li>Detectar el engraftment usando un citómetro de flujo de 4 colores. Obtener información adicional acerca de tipos de células en la sangre periférica mediante la adición de anticuerpos adicionales para detectar tipos de células específicas, tales como linfocitos B o T.</li>
	<li>Registrar datos de engraftment serie utilizando una hoja de cálculo para permitir el posterior análisis de los datos.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
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<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Aunque MDS es un trastorno clonal de células madre hematopoyéticas, las MDS "tallo" o células inicia, no se han caracterizado. Previamente demostramos que MDS puede ser transplantables a los ratones WT con la médula ósea de ratones NHD13 de HSCT, caracterizado por anemia macrocítica, leucopenia, neutropenia y evidencia morfológica de displasia15. Además, ensayos de repoblación competitiva identifican una ventaja del crecimiento de las células de la médula NHD13 MDS. Tomados en conjunto, estos resu...

Síndromes mielodisplásicos (MDS) representan un conjunto diverso de trastornos de la sangre clonales caracterizados por hematopoyesis ineficaz, evidencia morfológica de la displasia y una propensión para la transformación a leucemia mieloide aguda (AML)1,2 ,3,4. La hematopoyesis ineficaz se reconoce como una detención de la maduración en la médula ósea y los resultados en cytopenias de la sangre periférica a pesar de que la médula ósea hipercelular1,3. La incidencia de la MDS se ha estimado vario como 2-12 casos por 100.000 personas anualmente en los Estados Unidos, y la incidencia de los MDS aumenta con la edad, haciendo de esta una condición importante para entender dado el envejecimiento de población de Estados Unidos3, 5. Aunque la mayoría de los casos de MDS no tiene etiología clara, algunos casos de MDS son probablemente debido a exposición a agentes genotóxicos conocidos, incluyendo solventes como el benceno y cáncer quimioterapia6.
Pacientes de los MDS normalmente han adquirido las mutaciones en las células MDS7. Aunque relativamente poco común, un número de pacientes de los MDS tienen translocaciones cromosómicas equilibradas que involucran genes NUP98 EVI1, RUNX1, y MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nuestro laboratorio tiene un antiguo interés en translocaciones del cromosoma, que implican el gene NUP98 del8. Ratones transgénicos que expresa un transgen NUP98-HOXD13 (NHD13) regulado por el promotor de Vav1 y elementos potenciador Mostrar todas las características claves de los MDS, incluyendo cytopenias de la sangre periférica, evidencia morfológica de la displasia y transformación a LMA9 .
Aunque MDS ha sido reconocidos por más de 60 años10y se considera ser un desorden clonal de células madre, esfuerzos al engraft células humanas de MDS en ratones inmunodeficientes han sido en gran parte fracasados, porque las células MDS engraft mal11, 12,13,14 y los ratones no desarrollan enfermedad clínica. En un esfuerzo por identificar qué células hematopoyéticas pueden transmitir MDS, se volvió hacia el modelo de NHD13 y demostró que podríamos engraft MDS como una entidad de la enfermedad que mostraba todas las características cardinales de los MDS humana, incluyendo cytopenias de la sangre periférica, displasia, y transformación a LMA15. En este informe, presentamos los detalles técnicos de estos experimentos, así como métodos para fraccionar más tallo hematopoyética y células precursoras (HSPC), en un esfuerzo por identificar las células iniciadoras de MDS.

<table><tbody><tr><td>Tubo de fondo redondo de 14 mL</td> Solución salina equilibrada <td>de Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD45.2</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>Jeringa de 3 mL</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 27 G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 20 G</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Cóctel Lineage</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-Biotina</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Excelint</td><td>26027</td> Lámpara de calefacción de <td>jeringa de insulina</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>Máquina FACS</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 láseres, 5 detectores</td></tr><tr><td>de color Instrumento de clasificación FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 láseres, 23 parámetros, 6 Clasificación de población simultáneamente</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Irradiador Gamma</td><td>Best Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de extracción de sangre</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Destinatario ratones</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 ratones</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>Colonia mantenida en NIH</td></tr><tr><td>5 mL tubo de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Síndromes mielodisplásicos (SMD) son un grupo diverso de trastornos de células madre hematopoyéticas que son definidos por hematopoyesis ineficaz, cytopenias de la sangre periférica, displasia y una propensión para la transformación a leucemia aguda. Ratones transgénicos NUP98-HOXD13 (NHD13) recapitulan MDS humana en términos de cytopenias de la sangre periférica, displasia y transformación a leucemia aguda. Previamente demostramos que MDS se podía transferir de un ratón genéticamente modificado con MDS a los receptores de tipo salvaje mediante el trasplante de células nucleada de la médula MDS (BMNC). Más claramente entender la célula MDS de origen, hemos desarrollado métodos específicos de trasplante, immunophenotypically definido subconjuntos hematopoyéticos. En este artículo, describimos el proceso de aislar y transplante de poblaciones específicas de vástago de hematopoietic y células progenitoras. Después del trasplante, se describen métodos para evaluar la eficacia del trasplante y la persistencia de las células donantes del MDS.

Nos muestran figuras representativas para obtener los resultados de varios experimentos. La figura 1 muestra una citometría de flujo representativo clasificación experimento. Durante la diferenciación Hematopoyética normal, como las células se ha comprometido a un linaje hematopoyético específico, adquieren marcadores de superficie celular definición de linaje y perder la posibilidad de auto renovación. Por lo tanto, en los ratones de tipo salvaje, auto-renov...

Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Este método puede ayudar a responder algunas preguntas en el método de campo de neoplasia maligna sobre la caracterización de una célula que inicia una neoplasia maligna. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una base para el análisis funcional de estas células madre cancerosas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hasta donde la terapia de síndromes mielodisplásicos o SMD, ya que puede ayudar en la identificación de la enfermedad que inicia las células.Para preparar a los receptores para la transferencia adoptiva, una semana antes del trasplante proporcione agua estéril suplementada con 100 miligramos por litro de ciprofloxacino a animales receptores génicos durante siete días en un centro animal específico y libre de patógenos. En el séptimo día, un operador de cesio 17 capacitado y certificado ha establecido el instrumento de fuente de cesio para entregar 70 centigrays de irradiación gamma corporal total por minuto. Coloque 10 ratones en un soporte diseñado a medida.Inserte el soporte en la cámara del irradiador, entregue 9 grises de irradiación total del cuerpo en 13 minutos. Luego devuelva a los animales a sus jaulas. A la mañana siguiente, rocía 70 por ciento de etanol sobre un ratón C57 negro de seis y seis polillas y usa tijeras para quitar la piel de la pelvis hasta los tobillos.Use fórceps con las tijeras para eliminar el fémur y las tibias. Recorta limpiamente los músculos de los huesos. Corta los extremos proximal y distal de las tibias y recoge una tibia con fórceps.Inserte una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de 27 gages en la cavidad de la médula ósea y enjuague la médula ósea en un tubo inferior redondo de 14 mililitros que contenga 2,5 mililitroS de solución salina amortiguada de Hanks complementada con un 2% de suero bovino fetal o HF2. Cuando se haya recogido toda la médula, aspirar el tejido varias veces a través de la punta de la aguja de 20 gage para dispersar la masa de la médula en una sola suspensión para el recuento. Para etiquetar las células nucleadas de médula ósea, o BMNC, para la clasificación del flujo, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un uno por diez hasta el séptimo BMNC por cada 90 microlitros de concentración de HF2.A continuación, agregue diez microlitros de un cóctel de anticuerpos biotinilados y antilílago a la suspensión celular para una incubación de 20 minutos a 4 grados centígrados. Seguido de un lavado de centrífuga en tres mililitros de PBS. Re suspenda el pellet en 100 microlitros de HF2 por una por diez hasta las séptimas células.Etiquetar en segundo lugar las células con dos microlitros de anticuerpo antibiotina conjugado APC. Después de 20 minutos a cuatro grados Celsius, protegido de la luz, lavar las células en tres mililitros de PBS fresco. Re suspendir el pellet en HF2 complementado con 0,2 microgramos por mililitro de yoduro de propidio en hielo.Ahora calibre el clasificador de células de citometría de flujo utilizando celdas no manchadas para optimizar todos los parámetros de fotomultiplicador, dispersión y fluorescencia dentro del rango lineal de cada detector. Adquiera tres muestras de 10.000 celdas para las celdas etiquetadas APC sin etiquetar, con etiqueta DE PI y anti linaje. Al final de la ordenación, analice 1.000 células de cada muestra para confirmar la pureza y viabilidad de las células ordenadas.Gire las muestras en la centrífuga. Luego vuelva a suspender los pellets en 0,5 mililitros de HF2 para el conteo. Para la transferencia adoptiva de las células ordenadas, mezcle 100 microlitros de dos veces el quinto BMNC de tipo salvaje de un animal receptor con génico en HF2 estéril.Con 100 microlitros de dos a cinco veces diez a la cuarta el donante clasificado BMNC de interés en HF2 estéril en un tubo de micro centrífuga por animal receptor. Cargue una jeringa de un mililitro, equipada con un medidor de 28 por recipiente con 200 microlitros de células. A continuación, coloque los ratones receptores debajo de una lámpara de calor para inducir la dilatación de la vena de cola.Entregar las mezclas celulares a cada animal receptor irradiado lecionalmente a través de la vena de la cola. Como la auto-renovación de células madre se limita al linaje negativo de tipo silvestre BMNC, el linaje negativo, bajo linaje positivo, y el alto linaje positivo células se clasifican y trasplantan a receptores de tipo salvaje para determinar la capacidad de auto-renovación de cada población celular. Adoptivamente trasplantado donante trans genético BMNC de MDS modelo animales pueden ser distinguidos ex vivo por su expresión de marcador de superficie celular CD45.2.A las 16 semanas después del trasplante de BNMC negativo de linaje, o BMNC no clasificado de animales transgénicos donantes MDS, las células transgénicas compiten contra las células de tipo salvaje como lo demuestra un porcentaje creciente de células donantes positivas CD45.2, observadas en la sangre periférica de los animales receptores lecionalmente irradiados. Aquí se muestran las células de una transformación leucémica de un ratón trasplantado con células MDS transgénicas. Tenga en cuenta la presencia de numerosas explosiones y formas inmaduras.Al intentar el procedimiento, es importante recordar limitar el tiempo de manipulación ex vivo, ya que puede poner tensión indebida en las células, lo que resulta en la muerte celular o pérdida funcional. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para los investigadores en el programa de campo, para poner en neoplasia maligna para explorar la fuente de la enfermedad en ratones genéticamente diseñados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Este protocolo proporciona pautas paso a paso para establecer experimentos competitivos de trasplante de médula ósea de ratón para estudiar la función de las células madre/progenitoras hematopoyéticas sin purificación previa de las células madre mediante clasificación de células.

Los trasplantes competitivos para Evaluar la aptitud de Células Madre Hematopoyéticas

Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.

Detección de células progenitoras eritroides de donantes Residual después del trasplante de células madre hematopoyéticas para los pacientes con hemoglobinopatías

Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.

Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

Identificación de poblaciones microambientales de médula ósea en el síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda

Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.

Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos 

Aprenda a usar el trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el potencial maligno de células modificadas genéticamente en modelos de síndrome mielodisplásico. Este método permite identificar células iniciadoras de la enfermedad.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

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