Name: Luminophore formación en diversas conformaciones de albúmina sérica bovina mediante la Unión de Gold(III) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a formar fluoróforos rojos en albúmina sérica bovina mediante la unión de Au(III) en pH ≥ 9.7. Este método identifica sitios específicos de unión metálica y revela cambios conformacionales críticos en proteínas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.E. reconoce el apoyo del fondo de iniciativa especial Duke Endowment, Wells Fargo fondo, PhRMA Foundation, así como fondos de puesta en marcha de la Universidad de Carolina del norte, Charlotte.

1. síntesis del complejo BSA-Au(III)
<ol><li>Disolver 25 mg de BSA en 1 mL de agua grado de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en un frasco de reacción de 5 mL. Nota: La solución debe aparecer claro.</li>
	<li>Disolver el oro (III) trihidrato de cloruro (ácido chloroauric) a una concentración de 5 mM de agua de calidad HPLC. Nota: La solución debe aparecer amarillo. Chloroauric solución de ácido a esta concentración resultará en una BSA al cociente de Au de 1:13.<ol>
<li>Alternativamente, preparar una solución de ácido chloroauric con una concentración de dondequiera entre 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) 20 mm (BSA:Au = 1:50) en HPLC grado agua. Nota: Diversos cocientes de BSA a oro resultará en los patrones de fluorescencia roja drásticamente diferente del mapa de excitación emisión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar el frasco de reacción de BSA en un baño de agua de 37 ° C y agitar vigorosamente a 750 rpm usando un agitador magnético.</li>
	<li>Inmediatamente después de que comience la agitación, añadir 1 mL de ácido chloroauric a la solución. El color de la solución debe transformar de claro a amarillo.</li>
	<li>Removemos la mezcla durante 2 minutos a 37 ° C y a 750 rpm usando un agitador magnético.</li>
	<li>En el frasco de reacción, añada 100 μL de 1 M NaOH a la solución para llevar el pH a 12. Nota: Inmediatamente después de agrega NaOH, la solución debe oscurecer un poco a un amarillo marrón y luego vuelta a amarillo.</li>
	<li>Continúe revolviendo a 750 rpm durante 2 h y a 37 ° C. La solución debe cambiar poco a poco de amarillo a un color amarillo/marrón oscuro. Este cambio de color indica la formación de los BSA-Au(III) fluorescentes rojo complejo.</li>
	<li>Permita que la muestra permanezca a temperatura ambiente por 2 días y la solución se oscurece hasta un marrón ámbar y aumentará la intensidad de fluorescencia.<ol>
<li>Alternativamente, dejar que la muestra continúe remover a 37 ° C por 12 h más como el color de la solución evoluciona a un color marrón ámbar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntesis de BSA-Cu(II)-Au(III)
<ol><li>Disolver 25 mg de BSA en 1 mL de agua de calidad HPLC. La solución debe aparecer claro.</li>
	<li>Disolver el cobre (II) cloruro dihidrato en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM. La solución debe aparecer la luz azul.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la solución acuosa de BSA a un frasco de reacción de 5 mL y colocar en un baño de agua a 37 ° C. Revolver la mezcla a 750 rpm.</li>
	<li>Inmediatamente añada 0,5 mL de cobre (II) cloruro dihidrato para el frasco de reacción y mezclar durante 2 minutos. La solución seguirá siendo la luz azul.</li>
	<li>Añadir 75 μL de 1 M NaOH para llevar el pH a 12 y deje mezclar durante 2 h. La solución se volverá púrpura.</li>
	<li>Disolver el ácido chloroauric en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM.</li>
	<li>Agregar 0,5 mL de ácido chloroauric acuosa al frasco de reacción y ajuste el pH a 12 con 1 M NaOH.</li>
	<li>Revuelva la mezcla de reacción durante 2 h. Nota: La solución debe evolucionar a un color marrón.</li>
</ol>3. síntesis de BSA-Ni(II)-Au(III)
<ol><li>Disolver 25 mg de BSA en 1 mL de agua de calidad HPLC. La solución debe aparecer claro.</li>
	<li>Disolver el cloruro de níquel (II) hexahidratado en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM. La solución debe aparecer la luz verde.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la solución acuosa de BSA a un frasco de reacción de 5 mL y colocar en un baño de agua a 37 oC. Revuelva la mezcla en 750 rpm.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de la solución de níquel (II) cloruro hexahidrato al frasco de reacción y mezclar durante 2 minutos. Nota: La solución seguirá siendo la luz verde.</li>
	<li>Añadir 75 μL de 1 M NaOH para llevar el pH a 12 y deje mezclar durante 2 h. Nota: La solución se convertirá en amarillo oscuro.</li>
	<li>Disolver el ácido chloroauric en agua de calidad HPLC a una concentración de 5 mM.</li>
	<li>Agregar 0,5 mL de ácido chloroauric acuosa al frasco de reacción y ajuste el pH a 12.</li>
	<li>Revuelva la mezcla de reacción durante 2 h. Nota: La solución debe evolucionar a un color marrón.</li>
</ol>4. síntesis de [Cys34-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>2 mg de N-etilmaleimida (NEM) se disuelven en 1 mL de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Disolver 2 mg de BSA en 1 mL de solución de PBS-NEM.</li>
	<li>Transferir la solución a un frasco de reacción de 5 mL y revolver a 20 ° C a 500 rpm durante 1 hora.</li>
	<li>Dializan la solución utilizando 12 kDa tubo de diálisis en 500 mL de PBS, agitación a 50 rpm con un agitador magnético durante la noche para quitar NEM no reaccionado.</li>
	<li>Disolver el ácido chloroauric en PBS a una concentración de 0,4 mM. Nota: La solución será un amarillo tenue.</li>
	<li>Transferencia el frasco de reacción en un baño de agua a 37 ° C. Revuelva a 750 rpm.</li>
	<li>Inmediatamente añada 1 mL de solución de ácido chloroauric al frasco de reacción y deje que se mezcle durante 2 minutos.</li>
	<li>Añadir 75 μL de NaOH M 1 para el frasco de reacción para llevar el pH a 12 y deje mezclar durante 2 h.</li>
</ol>5. síntesis de [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>Preparar una solución 2 M urea y 50 mM de bicarbonato de amonio (NH4HCO3, pH 8.0) en agua de calidad HPLC.</li>
	<li>Disolver 3,3 mg de BSA en 1 mL de la solución anterior y transferencia a un frasco de reacción de 5 mL.</li>
	<li>Hacer una solución de 0.25 M tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) disolviendo 62.5 mg de TCEP en 1 mL de agua HPLC.</li>
	<li>Añadir la solución de TCEP al frasco de reacción hasta que la concentración final de TCEP 8 mM.</li>
	<li>Incubar la solución en un baño de agua durante 1 h a 50 ° C. Revuelva a 500 rpm con un agitador magnético.</li>
	<li>Deje que la solución se enfríe completamente a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar una solución stock de 100 mM NEM disolviendo 12,5 mg de NEM en 1 mL de agua de calidad HPLC.</li>
	<li>Añadir la solución de NEM para el frasco de reacción hasta que la concentración final de NEM es de 16 mM.</li>
	<li>Deje que la solución de combinar por 2 h a 20 ° C. Revuelva a 500 rpm.</li>
	<li>Dializan la solución utilizando un tubo de diálisis 12 kDa, agitando la solución a 50 rpm con un agitador magnético durante la noche en 500 mL de 50 mM NH4HCO3 para remover exceso TCEP, NEM y urea.</li>
	<li>Mueva el frasco de reacción en un baño de agua a 37 ° C y agitar a 750 rpm.</li>
	<li>Disolver el ácido chloroauric en agua de calidad HPLC a una concentración de 0,66 mM.</li>
	<li>Inmediatamente añada 1 mL de solución de ácido chloroauric al frasco de reacción y deje que se mezcle durante 2 minutos.</li>
	<li>Añadir 1 M NaOH hasta que el pH de la solución es 12 y dejar la solución para continuar mezclando durante 2 h.</li>
</ol>

<ol><li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja806804u">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).</li>
<li>Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles+in+Chemical+and+Biological+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing.</a> Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Gold+Nanostructures+for+Sensor+Applications%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review.</a> Materials. 7, 5169-5201 (2014).</li>
<li>Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gold+Nanoclusters%3A+Recent+Advances+in+Sensing+and+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).</li>
<li>Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Gold+Nanoparticles+in+Cancer+Nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%2C+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).</li>
<li>Nune, S. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19743894">Nanoparticles for Biomedical Imaging.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).</li>
<li>Dorsey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles+in+Radiation+Research%3A+Potential+Applications+for+Imaging+and+Radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization.</a> Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).</li>
<li>Daniel, M. -C., Astruc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles%3A+Assembly%2C+Supramolecular+Chemistry%2C+Quantum-Size-Related+Properties%2C+and+Applications+toward+Biology%2C+Catalysis%2C+and+Nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology.</a> Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).</li>
<li>Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Nanotechnology%3A+Opportunities+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).</li>
<li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles%3A+Interesting+Optical+Properties+and+Recent+Applications+in+Cancer+Diagnostics+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy.</a> Nanomedicine. 2, 681(2007).</li>
<li>Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles%3A+Opportunities+and+Challenges+in+Nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).</li>
<li>Doane, T. L., Burda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Unique+Role+of+Nanoparticles+in+Nanomedicine%3A+Imaging%2C+Drug+Delivery+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy.</a> Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).</li>
<li>Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Exchange+on+Gold+Nanoparticles+for+Drug+Delivery+and+Enhanced+Therapeutic+Index+Evaluated+in+Acute+Myeloid+Leukemia+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models.</a> Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/jnm/2015/784097/">Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application.</a> Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).</li>
<li>Chakraborty, I., Pradeep, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomically+Precise+Clusters+of+Noble+Metals%3A+Emerging+Link+between+Atoms+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles.</a> Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).</li>
<li>Raut, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+energy+transfer+from+tryptophan+to+BSA%2FHSA+protected+gold+nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).</li>
<li>Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Characterization+of+Human+Transferrin-Stabilized+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters.</a> Nanotechnology. 22 (27), (2011).</li>
<li>Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-Stabilized+Fluorescent+Gold+Nanocluster+for+Sensitive+and+Selective+Hg2%2B+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection.</a> Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme-Stabilized+Gold+Nanoclusters+as+a+Novel+Fluorescence+Probe+for+Cyanide+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+A%3A+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).</li>
<li>Dixon, J. M., Egusa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Change-Induced+Fluorescence+of+Bovine+Serum+Albumin-Gold+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).</li>
<li>Peters, T. Jr <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+T+%22All+About+Albumin%22">All About Albumin</a>. , (1996).</li>
<li>Masuoka, J., Saltman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc%28II%29+and+Copper%28II%29+Binding+to+Serum+Albumin.+A+Comparative+Study+of+Dog%2C+Bovine%2C+and+Human+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).</li>
<li>Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Change+of+Bovine+Serum+Albumin+by+Heat+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment.</a> Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).</li>
<li>Klotz, I. M., Curme, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Thermodynamics+of+Metallo-protein+Combinations.+Copper+with+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin.</a> Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).</li>
<li>Fiess, H. A., Klotz, I. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01124a008">The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).</li>
<li>Rao, M. S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Interaction+of+Nickel%28II%29+with+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin.</a> Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).</li>
<li>Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-Binding+Properties+of+Bovine+Serum+Albumin+and+Its+Amino-terminal+Peptide+Fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).</li>
<li>Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Thiol-Gold+Interactions+towards+the+Efficient+Strength+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control.</a> Nature Communications. 5, 4348(2014).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Protein+Characteristics+in+the+Formation+and+Fluorescence+of+Au+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters.</a> Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los compuestos de BSA-Au(III) preparados a pH 12 exhiben fluorescencia roja en una longitud de onda de emisión de λem= 640 nm cuando se excitó con ultravioleta (UV) luz λex= 365 nm (figura 1A). La aparición de fluorescencia roja es un proceso lento y llevará unos días a temperatura ambiente para aumentar a una intensidad máxima. Funcionando la reacción a 37 ° C dará los resultados óptimos, aunque una temperatura más alta puede utilizarse para producir la fluore...

Un compuesto de BSA-Au exhibiendo una radiación ultravioleta (UV)-excitable fluorescencia roja, con notable cambio de stokes, ha sido sintetizado originalmente por Xie et al. 1. la fluorescencia rojo única y estable puede encontrar diversas aplicaciones en campos tales como la detección de2,3,4, imagen5,6,7o nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Este compuesto ha sido estudiado ampliamente por muchos investigadores en el campo de la nano-ciencia en los últimos años14,15,16. El compuesto de Au de BSA ha sido interpretado como Au25 nanoclusters. El objetivo del método presentado es examinar este compuesto detalladamente y entender el origen de la fluorescencia roja. Siguiendo el enfoque presentado, se pueden ilustrar la presencia de múltiples sitios de unión de Au y el origen de la fluorescencia, alternativa a la nucleación del solo-sitio de Au25 nanoclusters. El mismo enfoque se puede emplear para estudiar cómo otras proteínas17,18,19 complexed con Au(III) puede cambiar sus propiedades intrínsecas de la fluorescentes.
La síntesis del compuesto fluorescente rojo Au BSA requiere un control estrecho de las relaciones molares de BSA para Au (BSA:Au) para maximizar la intensidad de la fluorescencia y la ubicación de los picos en la emisión excitación mapa (EEM)20. Puede ser demostrado que existen múltiples sitios de Unión para que Au(III) a atascarse, incluyendo el fragmento de asparagina (o fragmento de Asp, los primeros cuatro residuos del aminoácido en el N-terminal del BSA)21,22. El aminoácidoth 34 de BSA (Cys-34) también se indica para coordinar Au(III) y participar en el mecanismo de la fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) rojo20. Al unirse todos enlaces de disulfuro de la Cys-Cys y tapado todo fluorescencia de tioles, rojo no es producido ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Esto indica la necesidad de disulfuro de la Cys-Cys como el sitio de Unión Au(III) para producir la fluorescencia roja.
Técnicas de química de proteínas no han sido ampliamente utilizadas para el estudio de los complejos BSA-Au(III) en la comunidad de nano-ciencia. Sin embargo, sería útil emplear estas técnicas para comprender ciertos aspectos de estos complejos, así como para obtener una comprensión detallada de los sitios de unión de Au(III) en BSA. Este artículo pretende mostrar algunas de estas técnicas.

<table><tbody><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de oro (III) trihidratado, 99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de cobre (II) dihidratado, 99.999%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459097 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de níquel (II) hexahidratado, 99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida (NEM), >99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), >98.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, >98.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Urea, 99.5%</td><td>Chem-Implex Int'l</td><td>30142</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio, 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr></tbody></table>

luminophore formación en diversas conformaciones de albúmina sérica bovina mediante la unión de gold(iii)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

El propósito de los protocolos presentados es estudiar el proceso de unión de Au(III) a BSA, produciendo fluorescencia roja inducida por el cambio de conformación (λem = 640 nm) de complejos BSA-Au(III). El método ajusta el pH para mostrar que la aparición de la fluorescencia roja se correlaciona con las transiciones inducidas por el pH de equilibrio de las conformaciones de BSA. Complejos de BSA-Au(III) fluorescentes rojo sólo pueden ser formadas con un ajuste del pH o por encima de 9.7, que corresponde a la conformación de la "Forma" de BSA. Se describe el protocolo para ajustar la BSA a fracción molar de Au y para monitorear el curso del tiempo del proceso de unión de Au(III). El número mínimo de Au(III) por BSA, para producir la fluorescencia roja, es menos de siete. Describimos el protocolo en pasos para ilustrar la presencia de múltiples sitios de unión de Au(III) en BSA. Primero, mediante la adición de cobre (Cu(II)) o níquel (Ni(II)) cationes seguidos de Au(III), este método revela un sitio de Unión para Au(III) que no es el fluoróforo rojo. En segundo lugar, modificando BSA por tiol agentes de recubrimiento, se revela otro sitio de unión de Au(III) de formación nonfluorophore. En tercer lugar, cambiando la conformación de BSA hendiendo y nivelación de los enlaces de disulfuro, se ilustra el posible sitio de Unión Au(III). El protocolo descrito, para controlar la conformaciones de BSA y el enlace de Au(III), puede aplicarse generalmente para estudiar las interacciones de proteínas y cationes del metal.

De la fluorescencia del complejo BSA-Au(III), se ha observado que la conversión de la fluorescencia azul intrínseca de BSA (λem = 400 nm) a fluorescencia roja (λem = 640 nm) se presenta en sobre pH 9.7 a través de un equilibrio transición (figura 1). EEM de BSA-Au(III) en diferentes BSA para relaciones molares de Au se muestra en la figura 2, y estos datos muestran cómo modificar las relaci...

Los protocolos para el estudio de la Unión de cationes oro (Au(III)) a diversas conformaciones de albúmina de suero bovino (BSA), así como para caracterizar la conformacional dependiente única BSA-Au de la fluorescencia se presentan.

Luminophore formación en diversas conformaciones de albúmina sérica bovina mediante la Unión de Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanociencia, como la formación de fluoróforos y los complejos de proteínas medias. La principal ventaja de esta técnica es que ayuda a ilustrar sitios específicos de unión de metales y proteínas. Primero, disuelva 25 miligramos de BSA en un mililitro de agua de grado HPLC en un vial de reacción de cinco mililitros que contenga una barra de agitación magnética.A continuación, prepare una solución de cinco milimolares de ácido cloroáurico y agua de grado HPLC. Coloque el vial de reacción que contiene la solución de BSA en un baño de agua a 37 grados Celsius y revuelva a 750 RPM con un agitador magnético. Inmediatamente después de que comience la agitación, agregue un mililitro de la solución de ácido cloroáurico a la solución BSA.Después de remover durante dos minutos, agregue 100 microlitros de hidróxido de sodio molar a la solución para llevar el pH a 12. Disuelva 25 miligramos de BSA en un mililitro de agua de grado HPLC en un vial de reacción. A continuación, prepare una solución de cinco milimolares de cloruro de cobre dihidratado en agua de grado HPLC.Agregue un mililitro de la solución de BSA a un vial de r

luminophore-formation-various-conformations-bovine-serum-albumin

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Demostramos FRET entre polidiacetileno conjugado polímero (PDA) y el fluoróforo unido a la superficie de liposomas de PDA para la detección de biomoléculas. Liposomas PDA también contenía moléculas receptoras en sus superficies para las biomoléculas para ser utilizados como sondas. Ligando-receptor interacciones conducen a cambios en la eficiencia de FRET entre el fluoróforo y el PDA que es la base del mecanismo de detección.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

En este video, demostramos la inmunotinción con oro de biomarcadores localizados dentro de la región lumínica de secciones exosomales ultrafinas. Esta técnica permite el diagnóstico precoz de enfermedades mediante la visualización de las moléculas diana dentro de los exosomas secretados por las células enfermas.

Inmunotinción con oro de secciones exosómicas: una técnica para visualizar marcadores de diagnóstico en la luz exosomal

Se presenta un protocolo para el cribado de fármacos moleculares pequeños basado en la síntesis in situ de nanoclusters de oro fluorescentes ultrapequeños (Au NCs) utilizando proteínas cargadas con fármacos como plantilla. Este método es sencillo para determinar la afinidad de unión de los fármacos a una proteína diana mediante una señal fluorescente visible emitida por los Au NC con plantilla de proteínas.

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

Para obtener información básica sobre la sorción y el reciclaje de oro de sistemas acuosos, se investigó la interacción de las nanopartículas de Au(III) y Au(0) en las proteínas de la capa S. La sorción de polímeros proteicos se investigó por ICP-MS y la de monocapas proteicas por QCM-D. El AFM posterior permite la obtención de imágenes de las nanoestructuras.

Au-Interacción de SLP1 Polímeros y Monocapa de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS y AFM como Herramientas para Estudios Biomolécula metálicos

Las sondas ópticas basadas en nanopartículas han sido diseñadas como un vehículo para la detección de antígenos utilizando espectroscopía Raman y UV-Vis. Aquí describimos un protocolo para preparar dichas sondas para un inmunoensayo de espectroscopía UV-Vis/Raman de tal manera que incorporen futuras capacidades de multiplexación.

La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Se describe un método fiable y fácilmente reproducible para la preparación de nanocúmulos de oro fotoluminiscente de emisión de infrarrojo cercano funcional y y su detección directa dentro de las células de HeLa mediante citometría de flujo y microscopía de escaneo láser confocal.

Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas

El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.

Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada

Aquí, presentamos un método sistemático que describe el autoensamblaje cuasi-reversible de los agregados de oro de 20 nm recubiertos de beta amiloide 1-40 (Aβ 1-40). La red cuasi-reversible dependiente del tamaño nanométrico entre péptidos se correlacionó con aminoácidos específicos o secciones del monómero Aβ 1-40.

Caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40

Proteínas de unión de hielo (IBP), también conocidas como proteínas anticongelantes, inhibir el crecimiento del hielo y son un aditivo prometedor para su uso en la crioconservación de tejidos. La principal herramienta utilizada para investigar los IBP es el osmómetro nanolitros. Hemos desarrollado un hogar diseñado etapa de enfriamiento montado en un microscopio óptico y se controla utilizando una rutina de costumbre-construido LabVIEW. El osmómetro nanoliter descrito aquí manipulado la...

LabVIEW operado Novela Osmometer nanolitros de Investigaciones de hielo de fijación con proteínas

Aprende a formar fluoróforos rojos en albúmina sérica bovina mediante la unión de Au(III) en pH ≥ 9.7. Este método identifica sitios específicos de unión metálica y revela cambios conformacionales críticos en proteínas.

Luminophore formación en diversas conformaciones de albúmina sérica bovina mediante la Unión de Gold(III)

Explorar más videos