Name: Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda un método de cultivo proximal para estudiar la señalización paracrina entre células de cáncer de ovario y HPMCs. Esta técnica simple y reproducible captura interacciones paracrinas sin contacto directo celular.

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Estamos agradecidos a los pacientes por su participación en la colección de tejidos para estos experimentos. Un premio de Academia DoD OCRP ovárico cáncer (W81XWH-15-0253) y un premio de piloto de la Fundación sueño de Colleen a Anirban K. Mitra apoyaron esta investigación.

El protocolo sigue las pautas de la institucional Consejo Regulador de la Universidad de Indiana.
1. preparación de la célula
<ol><li>
Aislamiento y cultivo de células mesothelial primarias humanas
	<ol>
<li>Aislamiento primarias mesothelial células humanas (HPMCs) del epiplón humano como se ha descrito anteriormente17,18 y cultivarlas en completan medio [modificado Eagle de Dulbecco Medium (DMEM) que contiene 10% suero fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% vitaminas] en 37 ° C y 5% CO2. Nota: El HPMCs típicamente crecen hasta confluencia 100% (figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condiciones de crecimiento de las células de cáncer de ovario
	<ol>
<li>Crecen las células de cáncer de ovario de HeyA8 en medio de mas crecimiento a 37 ° C y 5% CO2. Nota: Uso HeyA8 células cultivadas a cerca de 80% de confluencia (figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultivo celular
<ol><li>
Configuración de la cultura proximal
	<ol>
<li>Uso Transwell insertos para placas de 6 pocillos con una membrana de policarbonato tratado con cultura de tejido μm de espesor 10 con 0,4 μm poros (108 poros/cm2) y un área de crecimiento de2 cm de 4,67. Si es necesario, optimizar para insertar diferentes tamaños por el escalamiento del número de células sembradas según la superficie de crecimiento. Medio de cultivo completo caliente, tripsina y solución salina con tampón fosfato (PBS) a 37 ° C antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de los rellenos
	<ol>
<li>Para las células HeyA8 en la parte inferior de la membrana del parte movible de la semilla, retire el inserto del envase utilizando pinzas estériles y colóquela invertida en una placa de cultivo estéril 15 cm.</li>
		<li>Use un plato de 15 cm, ya que tiene la profundidad para acomodar la inserción invertida o sustituirlo con cualquier contenedor estéril apropiado. Según el experimento, colocar el número de inserciones en el plato de 15 cm.</li>
		<li>Etiquetar los tres controles y tres condiciones experimentales por consiguiente con un marcador en el borde de los insertos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de las células cancerosas
	<ol>
<li>Trypsinize las células HeyA8 cultivadas en confluencia del 80% en un matraz de2 de 25 cm (~ 2 x 106 células), agregar 1 mL de tripsina (0,25%) para 40 a 60 s y neutralizar la tripsina con 6 mL de medio de cultivo completo.</li>
		<li>Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente (RT) por 3 min, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL de medio de cultivo completo. Contar las células vivas utilizando el método de exclusión de colorante azul de trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Siembra de las células cancerosas
	<ol>
<li>Suspensión 100.000 células/mL de células vivas de la HeyA8 en medio de cultivo completo. Cuidadosamente semillas 80.000 HeyA8 las células suspendidas en 800 μL de medio de cultivo completo en la parte inferior del parte movible (que ahora es hacia arriba, ya que se invierte).</li>
		<li>Semilla de las células para formar una bóveda-como así las células permanecen en el inserto (figura 1). Desde el centro de la membrana y mover hacia afuera en círculos concéntricos mientras lentamente el pipeteo. Evite pasar más de 3 mm desde el borde para evitar cualquier derrame del medio. Nota: El número de células sembradas dependerá de la tasa de crecimiento de las células y la duración del experimento. El número de células de HeyA8 sembrado para esta cultura proximal fueron optimizado y las células será confluente de 80-90% al final del tercer día.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Accesorio de la célula de cáncer
	<ol>
<li>Cubrir el plato de 15 cm y mueva con cuidado el plato que contenga los insertos a la incubadora de CO2 . Es fundamental no perturbar la gota del medio y las células de la cubierta en este paso. Salir de las células a 37 ° C durante 4 horas permitir que las células cancerosas sujetar a la pieza de inserción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de las células mesoteliales
	<ol>
<li>Después de alrededor de 4 h, trypsinize HPMCs crecidos en confluencia 100% en un matraz de2 75 cm (~ 4 x 106 células) con 2 mL de tripsina (0,25%) durante 1-2 min y neutralizar la tripsina con 12 mL de medio de cultivo completo.</li>
		<li>Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente durante 3 min., Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo completo y contar las células vivas utilizando el método de exclusión de colorante azul de trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Siembra de las células mesoteliales
	<ol>
<li>Suspender 300.000 células/mL de HPMCs vivo en medio de cultivo completo. Añadir 2,5 mL de medio fresco crecimiento completo a cada pocillo de una placa de 6 pozos. Llevar con cuidado el plato de 15 cm que contenga los insertos a la campana de bioseguridad. Utilizando pinzas estériles, tapa el relleno y colocar en el pozo de la placa de 6 pozos para que sea vertical, con las células de HeyA8 Unidas a la superficie más baja en el medio de cultivo completo (figura 1).</li>
		<li>Semilla 450.000 HPMCs suspendidos en 1,5 mL de medio de cultivo en el interior de los rellenos con las células de HeyA8 fijadas a la superficie hacia el fondo del pozo (figura 1) o con insertos sin las células HeyA8 de los controles de la HPMC. Añadir 1,5 mL de medio de cultivo sin las células a los controles de HeyA8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Creciente cultura proximal
	<ol>
<li>Dejar la cultura proximal crecer en el CO2 incubadora a 37 ° C y 5% CO2 para 72 h. Si es necesario, el medio puede ser reemplazado como sigue.<ol>
<li>Para el interior del inserto, 750 μl de quitar y añadir 750 μl de medio de cultivo completo fresco.</li>
			<li>Para el exterior de la estufa (placa de 6 pozos), sacar 1 mL y añadir 1 mL de medio completo fresco. 1 mL fue elegido para la conveniencia de cambiar el medio en un solo paso. Si lo desea, 1,25 mL puede ser quitado y substituido en su lugar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de las células
	<ol>
<li>Recoger las células después de 72 h de la próxima cultura. Tenga especial cuidado en este paso para evitar la contaminación cruzada de las células HeyA8 y HPMCs. Trypsinize las células de centrífuga les y lyse la pastilla en vez de lisis de las células en la membrana para evitar una contaminación cruzada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing las células
	<ol>
<li>Enjuague ambos lados de la plaquita con PBS 1 x.</li>
		<li>Los insertos de la transferencia a un nuevo pozo y añadir tripsina. Agregar 0,5 mL de tripsina en el interior del inserto y agregar 2 mL de tripsina a la placa de 6 pozos para trypsinize las células cancerosas a la parte inferior del parte movible. Incubar la placa por 2 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neutralización de la tripsina
	<ol>
<li>Añadir 1 mL de medio de cultivo completo en el interior del relleno para neutralizar la tripsina, pipeta hacia arriba y hacia abajo y luego tomar las células y transferirlos a un tubo de recogida etiquetados. Agregar un adicional 2 mL de medio de cultivo completo para una neutralización completa. Debe tener cuidado de no perforar la membrana mientras que pipetear para evitar una contaminación cruzada de las células.</li>
		<li>Para recoger las células en la parte inferior del parte movible, pipetear la tripsina de 2 mL que se agregó en el paso 12.2 sobre la superficie inferior 2 – 3 x para que las células caigan en la parte inferior de la placa de 6 pozos. Neutralizar la tripsina en la parte inferior de la placa con 6 mL de medio de crecimiento y transferir el contenido de la placa a un tubo de recogida etiquetados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recogida y lisis de las células
	<ol>
<li>Centrifugar las células a 500 x g durante 3 min y aspirar los medios de comunicación. Suspender y lyse los pellets de células con 0,7 mL de fenol y guanidina-tiocianato-basada en el reactivo de lisis para la extracción de RNA. Aislar el RNA usando cualquier kit adecuado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cuantitativa de polimerasa en tiempo real la reacción en cadena
Nota: Los pasos siguientes describen una reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para estudiar los cambios de expresiones de genes como resultado de la cultura proximal.
<ol><li>Preparar el cDNA de las muestras de RNA para qPCR. Use cualquier conveniente de la transcriptasa inversa con un tampón correspondiente y cartillas al azar para asegurar la transcripción reversa del mRNA todos (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Evaluar los cambios en los niveles de expresión de mRNA de fibronectina (FN1) y E-cadherina (CDH1) y transformar el factor de crecimiento beta 1 (TGFβ1) por qPCR con gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno. Es posible utilizar estandarizadas ensayos de expresión genética disponible en el mercado (véase Tabla de materiales) o para el diseño de primers.</li>
	<li>Comparar las células HeyA8 cultivadas en cultura proximal con HPMCs con los controles HeyA8 y HPMCs crecidos en cultura proximal con los controles de la HPMC.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Entender el mecanismo de paracrina, yuxtacrina señalización entre las células es esencial para el desarrollo de un mejor conocimiento del tejido normal homeostasis y enfermedad condiciones7,8. Paracrina la mayoría señalización estudios se llevan a cabo recogiendo acondicionado medio de una célula tipo y usarlo para tratar a otro tipo de célula. Este método tiene una ventaja en su simplicidad inherente. Sin embargo, no precisa recapitular las concentraciones local...

El papel de productivas interacciones recíprocas entre células cancerosas y el microambiente tumoral en la progresión tumoral ha sido bien establecido y se ha convertido en un importante foco de investigación en cáncer biología1. Casos similares de señalización bidireccional son cruciales durante la cicatrización, respuesta inmune, angiogénesis, nichos de células madre y en desarrollo2,3,4,5,6 , 7 , 8. un tema común en todos estos procesos biológicos es que las células responden de diversas maneras a las señales extracelulares de su microambiente que determinan el destino celular, fisiología de tejidos y progresión de la enfermedad. Por lo tanto, el enfoque se ha convertido cada vez más hacia el desarrollo de una mejor comprensión de los mecanismos implicados en las comunicaciones de la célula. La mayoría de estas interacciones implican paracrina o yuxtacrina señalización entre las células. Señalización paracrina consiste en la secreción de factores específicos de la señalización por una célula que se perciben por los receptores correspondientes en otra célula en las proximidades, desencadenando una respuesta en él9,10, mientras que yuxtacrina señalización requiere contacto directo entre los componentes celulares de las dos células implicadas11,12.
Dicha señalización es un componente vital en la homeostasis del tejido, así como en el microambiente del tumor. Las células de cáncer se benefician de los factores paracrinos y yuxtacrina de células en el estroma del tumor, incluyendo fibroblastos asociada al cáncer (CAFs), las células inmunes y adipocitos13,14,15,16. Paracrina de señalización puede estar mediado por citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, etc., mientras que la señalización yuxtacrina implica yuxtapuestas ligandos y receptores como en señalización de Notch, o interacción entre las integrinas y sus respectivas proteínas de matriz extracelular. Hemos demostrado la importancia de las interacciones recíprocas entre las células de cáncer de ovario y CAF en progresión y metástasis de tumor14. Del mismo modo, las interacciones de extenderse por metástasis de las células de cáncer de ovario con las células mesoteliales que cubren el sitio de la metástasis regulan microRNAs claves y factores de transcripción en las células de cáncer que promueven la colonización metastásica17, 18.
Mayoría de los estudios sobre la señalización paracrina implica el uso de un medio condicionado de tipo de una célula para tratar el segundo tipo de célula con. Mientras que este enfoque ha sido ampliamente utilizado, efectivamente reproduce los niveles de alta concentración localizados del factor secretado en el microambiente de la célula receptora. También es incapaz de reproducir la cinética del flujo continuo del factor secretado producido por una célula y recibido por la célula vecina. Paracrina de señalización es eficaz en distancias cortas como los factores secretados en las concentraciones requeridas sólo en las proximidades de la célula de origen y tienden a difundir y diluir a medida que aumenta la distancia. Esta alta concentración localizada de la factor secretado es esencial para desencadenar una respuesta en la célula del receptor. Por otra parte, la respuesta en las células del receptoras también es dependiente en el equilibrio de los factores recién secretados y su agotamiento continuo a través de degradación, vinculante y la internalización en las células del receptoras y difusión de la célula de origen. Medio condicionado puede ser concentrado para tener en cuenta las altas concentraciones localizadas presentes en el microambiente, pero que no pueden replicar con precisión las concentraciones exactas. Por otra parte, no puede imitar la cinética natural de la producción y el agotamiento del factor implicado. Para mayor precisión replicar señalización paracrina y separarlo de los mecanismos de señalización yuxtacrina, hemos ideado un método de cultura próxima novela, que implica el crecimiento de los dos tipos celulares en cualquier superficie de una membrana porosa. Los poros son lo suficientemente pequeños para prevenir interacciones yuxtacrina y todavía permiten el intercambio de factores secretados a altas concentraciones localizadas. De esta manera, este sistema conserva la cinética de la producción y el agotamiento de los factores paracrinos.

<table><tbody><tr><td>Soporte permeable Transwell de 24 mm con 0,4 y micro; m Inserto de membrana de policarbonato para poros</td><td>Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&bull; 10 &micro; membrana de policarbonato translúcido de m de espesor &bull; Tratamiento para una fijación óptima de las células &bull; Empaquetado 6 insertos en una placa de 6 pocillos, 4 placas por caja &bull; La membrana debe teñirse para la visibilidad de la célula &bull; Esterilizado por radiación gamma</td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>Fondo plano, tratado con TC, estéril, con tapa</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 15 cm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Placa de cultivo celular estéril tratada con TC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino no esencial ácidos</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitaminas</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td></td><td></td><td>Cualquier marca está bien</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> de CO2 <td>Cualquier marca está bien</td></tr><tr>Gabinete <td></td><td></td><td>de bioseguridad de nivel II</td><td>Cualquier marca está bien</td></tr><tr><td>Ensayo de expresión génica FN1 TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 Ensayo de expresión génica TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 Ensayo de expresión génica TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Expresión génica TaqMan Ensayo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit de aislamiento de ARN</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>Células de cáncer de ovario HeyA8</td><td>Obtenido del Laboratorio de Ernst Lengyel, Universidad de Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; Anticuerpo neutralizante</td><td>R& Sistemas D</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de cultura proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Interacciones intercelulares juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la progresión del tumor, respuesta inmune, angiogénesis y desarrollo. Paracrina o señalización yuxtacrina interviene en tales interacciones. El uso de un medio condicionado y cocultivo estudios son los métodos más comunes para discriminar entre estos dos tipos de interacciones. Sin embargo, el efecto de las altas concentraciones localizadas de factores secretados en el microambiente durante las interacciones paracrinas no es exactamente recapitulado por medio condicionado y, por lo tanto, puede conducir a conclusiones imprecisas. Para superar este problema, hemos ideado un método de cultivo próximo para estudiar la señalización paracrina. Los dos tipos celulares son cultivados en cualquier superficie de una membrana de policarbonato de espesor μm 10 con 0,4 μm poros. Los poros permiten el intercambio de factores secretados y, al mismo tiempo, inhiben la señalización yuxtacrina. Las células pueden ser recogidas y lisis en el criterio de valoración para determinar los efectos de la señalización paracrina. Además de permitir para gradientes de concentración localizados de factores secretados, este método es sensible a los experimentos que implican largos períodos de la cultura, así como el uso de inhibidores. Mientras que utilizamos este método para estudiar las interacciones entre las células de cáncer de ovario y las células mesoteliales que se encuentran en el sitio de metástasis, puede ser adaptado a cualquier dos tipos de células adherentes a los investigadores estudiar paracrina señalización en varios campos, incluyendo el desarrollo, Inmunología y microambiente tumoral.

Extenderse por metástasis de las células de cáncer de ovario encuentran células mesoteliales en el sitio de la metástasis en la cavidad peritoneal19. Interacciones paracrinas y yuxtacrina productivas con la ayuda de células mesoteliales en la inducción de respuestas adaptativas en las células de cáncer de ovario, que permiten la metástasis exitosa17,18,20,<sup c...

Paracrina y yuxtacrina interacciones celulares juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la progresión del tumor, respuesta inmune, angiogénesis y desarrollo. Aquí, un método de cultura proximal se utiliza para el estudio de señalización paracrina donde se mantienen las concentraciones localizadas de los factores secretados evitando contacto celular directo.

Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las comunicaciones intercelulares sobre las interacciones recíprocas paracrinas versus yuxtacrinas entre dos tipos de células. La principal ventaja de este método es que es una técnica muy simple y reproducible que captura con precisión la señalización paracrina en condiciones típicas de cultivo y, al mismo tiempo, evita la señalización efectiva de yuxtacrina. Las implicaciones de esta técnica se extienden a una mejor comprensión del mecanismo de la diafonía entre las células cancerosas y el microambiente tumoral.Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre las células cancerosas y el estroma tumoral, también se puede aplicar a otros sistemas, como la cicatrización de heridas y la angiogénesis. Comience separando las células de cáncer de ovario de una mezcla confluente al 80% con un mililitro de tripsina al 0,25% durante 40 a 60 segundos, seguido de la neutralización de la reacción con seis mililitros de medio de crecimiento completo. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de crecimiento completo fresco.Después de contar, diluya las células a 100.000 células de cáncer de ovario por mililitro de concentración completa de medio de crecimiento y coloque tres insertos de cultivo celular de membrana de policarbonato tratado con cultivo de tejido de poro invertido de 0,4 micrómetros por condición experimental en una placa de cultivo de tejido estéril de tamaño adecuado. Etiquete los insertos de acuerdo con la condición experimental y pipetee cuidadosamente las células cancerosas en la parte inferior de cada inserto en círculos concéntricos, comenzando desde el centro de la membrana y moviéndose hacia afuera para formar una cúpula de 800 microlitros. Tenga mucho cuidado al sembrar las células en la superficie inferior del inserto para que la cúpula del medio que contiene las células no se salga de los bordes del inserto durante la incubación.Cuando se hayan sembrado todos los insertos, cubra el plato y coloque con cuidado los insertos en la incubadora de cultivos celulares. Después de aproximadamente cuatro horas, separe el HPMC con dos mililitros de tripsina al 0,25% durante uno o dos minutos, seguido de la neutralización de la reacción con 12 mililitros de medio de crecimiento completo. Recoja el HPMC por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de crecimiento completo para contar.Diluya las células a 300.000 HPMC por mililitro de medio de crecimiento completo y agregue 2,5 mililitros de medio de crecimiento completo fresco a cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos. Con pinzas estériles, coloque cada inserto con el lado derecho hacia arriba en cada pocillo de la placa de seis pocillos para que las superficies adheridas a las células de cáncer de ovario inferiores se sumerjan en el medio. A continuación, siembre 1,5 mililitros de HPMC en el pocillo de cada inserto.A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante 72 horas. Al final de la incubación, retire con cuidado los insertos de cada pocillo y enjuague ambos lados de los insertos con PBS. Coloque cada inserto en una nueva placa de seis pocillos y agregue 0,5 mililitros de tripsina a los pocillos de inserción y dos mililitros de tripsina a los pocillos inferiores.Después de dos minutos a 37 grados centígrados, agregue un mililitro de medio de crecimiento completo a cada inserto y pipetee cuidadosamente la solución varias veces sin rasgar la membrana ni derramar la suspensión celular en el pocillo de abajo. Durante el pipeteo, se debe tener cuidado para evitar la contaminación cruzada de las células de una cámara con las demás. Transfiera las células resuspendidas a un tubo de recolección marcado y neutralice aún más la tripsina con dos mililitros adicionales de medio de crecimiento completo.Para recoger las células en la parte inferior de los insertos, enjuague la parte inferior de las membranas dos o tres veces con los dos mililitros de tripsina del pocillo correspondiente de la placa de seis pocillos para que las células desprendidas queden atrapadas en el fondo de los pocillos apropiado. Cuando se hayan desprendido todas las células, neutralice la tripsina en cada pocillo con seis mililitros de medio de crecimiento fresco y transfiera las suspensiones celulares a tubos de recolección marcados. A continuación, recoja todas las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en 0,7 mililitros de reactivo de lisis a base de fenol y guanidina tiocianato por tubo para la extracción y el aislamiento del ARN según los protocolos estándar.El cultivo proximal de HPMC con células de cáncer de ovario da como resultado un aumento de la expresión de fibronectina y factor de crecimiento transformante o TGF beta uno en comparación con HPMC de control sembrado en insertos en ausencia de células cancerosas. La expresión de fibronectina y TGF beta uno también aumenta significativamente en las células de cáncer de ovario tras el cultivo proximal con HPMC en comparación con las células ováricas de control cultivadas en ausencia de HPMC. Por el contrario, las células de cáncer de ovario tratadas con un medio condicionado por HPMC muestran una expresión de fibronectina significativamente reducida sin cambios en la expresión de TGF beta uno.Sin embargo, el bloqueo de TGF beta one con un anticuerpo neutralizante da lugar a una disminución significativa de la expresión de TGF beta one en células de cáncer de ovario en cultivo proximal con HPMC. Curiosamente, se observa un ligero aumento en la expresión de TGF beta one en células de cáncer de ovario no cultivadas proximalmente, probablemente como respuesta compensatoria. El cultivo proximal con células de cáncer de ovario aumenta ligeramente la expresión de E-cadherina en las HPMC, mientras que se observa una marcada disminución de la E-cadherina en las células de cáncer de ovario cultivadas en proximidad con las HPMC en comparación con los controles, lo que demuestra aún más la eficacia del sistema de cultivo proximal para estudiar la señalización paracrina entre las células de cáncer de ovario y las células normales en el sitio de la metástasis.Al intentar este procedimiento, es importante optimizar el número de células sembradas y la duración del cultivo proximal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunotransferencia, para responder preguntas adicionales sobre los cambios en la expresión de proteínas y la activación de las vías de señalización de procesamiento posteriores durante el cocultivo de células mesoteliales de células tumorales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del microambiente tumoral, la inmunología y la biología del desarrollo exploraran las interacciones paracrinas recíprocas entre las células a través de factores secretados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, desarrollamos un modelo de cocultivo proximal de células de cáncer de ovario y células mesoteliales humanas primarias. Este modelo fisiológicamente relevante permite el estudio de la señalización paracrina, donde se mantienen las concentraciones localizadas de los factores secretados al tiempo que se evita el contacto celular directo.

Sistema de cultivo proximal: una técnica de cultivo in vitro para estudiar la señalización paracrina entre células

Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.

Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Se describe un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia, lo que permite la disección de la señalización de vías en el endotelio, músculo liso, o entre el endotelio y músculo liso (el cruce de myoendothelial). Puede utilizar la aplicación selectiva de agonistas o aislamiento de la proteína, microscopia electrónica o inmunofluorescencia usando este modelo de cultura de célula.

Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia

Presentamos un protocolo para investigar la diafonía entre Caco-2 irradiadas por rayos X y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El protocolo comienza con la irradiación de Caco-2 y puesta en marcha de la cultura junto con PBMC; Posteriormente, trans epitelial resistencia eléctrica se mide regularmente durante 48 h y occidental la mancha blanca /negra en Caco-2 y PBMC.

Un método de cultura cooperación para investigar la interferencia entre rayos x irradia PBMC y células Caco-2

Ofrecemos protocolos para la evaluación de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental e interacciones de la célula de cáncer de próstata basadas en métodos directos e indirectos de la cultura Co. Condición media y trans-bien membranas son adecuadas analizar actividad paracrina indirecta. Siembra diferencialmente teñidas células juntos es un modelo apropiado para la interacción directa de la célula.

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.

Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

El presente estudio describe un método altamente reproducible y manejable para estudiar eventos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro.  Este protocolo se aplicó para evaluar el impacto de la señalización paracrina Wnt5a en células murinas de la cresta neural y mioblastos.

Modelado de señalización Wnt no canónica paracrina in vitro

En este trabajo, se presenta un inserto impreso en 3D de nuevo diseño como modelo de cocultivo y se valida mediante el estudio de la comunicación intercelular paracrina entre las células endoteliales y los queratinocitos.

Un innovador inserto impreso en 3D diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2D y 3D

Pruebas de sensibilidad visual de las lagartijas con un paradigma de condicionamiento operante que utiliza la reproducción de vídeo de puntos aleatorios kinematograms e invertebrados generadas por ordenador.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Aprenda un método de cultivo proximal para estudiar la señalización paracrina entre células de cáncer de ovario y HPMCs. Esta técnica simple y reproducible captura interacciones paracrinas sin contacto directo celular.

Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

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