Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las comunicaciones intercelulares sobre las interacciones recíprocas paracrinas versus yuxtacrinas entre dos tipos de células. La principal ventaja de este método es que es una técnica muy simple y reproducible que captura con precisión la señalización paracrina en condiciones típicas de cultivo y, al mismo tiempo, evita la señalización efectiva de yuxtacrina. Las implicaciones de esta técnica se extienden a una mejor comprensión del mecanismo de la diafonía entre las células cancerosas y el microambiente tumoral.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre las células cancerosas y el estroma tumoral, también se puede aplicar a otros sistemas, como la cicatrización de heridas y la angiogénesis. Comience separando las células de cáncer de ovario de una mezcla confluente al 80% con un mililitro de tripsina al 0,25% durante 40 a 60 segundos, seguido de la neutralización de la reacción con seis mililitros de medio de crecimiento completo. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio de crecimiento completo fresco.

Después de contar, diluya las células a 100.000 células de cáncer de ovario por mililitro de concentración completa de medio de crecimiento y coloque tres insertos de cultivo celular de membrana de policarbonato tratado con cultivo de tejido de poro invertido de 0,4 micrómetros por condición experimental en una placa de cultivo de tejido estéril de tamaño adecuado. Etiquete los insertos de acuerdo con la condición experimental y pipetee cuidadosamente las células cancerosas en la parte inferior de cada inserto en círculos concéntricos, comenzando desde el centro de la membrana y moviéndose hacia afuera para formar una cúpula de 800 microlitros. Tenga mucho cuidado al sembrar las células en la superficie inferior del inserto para que la cúpula del medio que contiene las células no se salga de los bordes del inserto durante la incubación.

Cuando se hayan sembrado todos los insertos, cubra el plato y coloque con cuidado los insertos en la incubadora de cultivos celulares. Después de aproximadamente cuatro horas, separe el HPMC con dos mililitros de tripsina al 0,25% durante uno o dos minutos, seguido de la neutralización de la reacción con 12 mililitros de medio de crecimiento completo. Recoja el HPMC por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de crecimiento completo para contar.

Diluya las células a 300.000 HPMC por mililitro de medio de crecimiento completo y agregue 2,5 mililitros de medio de crecimiento completo fresco a cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos. Con pinzas estériles, coloque cada inserto con el lado derecho hacia arriba en cada pocillo de la placa de seis pocillos para que las superficies adheridas a las células de cáncer de ovario inferiores se sumerjan en el medio. A continuación, siembre 1,5 mililitros de HPMC en el pocillo de cada inserto.

A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante 72 horas. Al final de la incubación, retire con cuidado los insertos de cada pocillo y enjuague ambos lados de los insertos con PBS. Coloque cada inserto en una nueva placa de seis pocillos y agregue 0,5 mililitros de tripsina a los pocillos de inserción y dos mililitros de tripsina a los pocillos inferiores.

Después de dos minutos a 37 grados centígrados, agregue un mililitro de medio de crecimiento completo a cada inserto y pipetee cuidadosamente la solución varias veces sin rasgar la membrana ni derramar la suspensión celular en el pocillo de abajo. Durante el pipeteo, se debe tener cuidado para evitar la contaminación cruzada de las células de una cámara con las demás. Transfiera las células resuspendidas a un tubo de recolección marcado y neutralice aún más la tripsina con dos mililitros adicionales de medio de crecimiento completo.

Para recoger las células en la parte inferior de los insertos, enjuague la parte inferior de las membranas dos o tres veces con los dos mililitros de tripsina del pocillo correspondiente de la placa de seis pocillos para que las células desprendidas queden atrapadas en el fondo de los pocillos apropiado. Cuando se hayan desprendido todas las células, neutralice la tripsina en cada pocillo con seis mililitros de medio de crecimiento fresco y transfiera las suspensiones celulares a tubos de recolección marcados. A continuación, recoja todas las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en 0,7 mililitros de reactivo de lisis a base de fenol y guanidina tiocianato por tubo para la extracción y el aislamiento del ARN según los protocolos estándar.

El cultivo proximal de HPMC con células de cáncer de ovario da como resultado un aumento de la expresión de fibronectina y factor de crecimiento transformante o TGF beta uno en comparación con HPMC de control sembrado en insertos en ausencia de células cancerosas. La expresión de fibronectina y TGF beta uno también aumenta significativamente en las células de cáncer de ovario tras el cultivo proximal con HPMC en comparación con las células ováricas de control cultivadas en ausencia de HPMC. Por el contrario, las células de cáncer de ovario tratadas con un medio condicionado por HPMC muestran una expresión de fibronectina significativamente reducida sin cambios en la expresión de TGF beta uno.

Sin embargo, el bloqueo de TGF beta one con un anticuerpo neutralizante da lugar a una disminución significativa de la expresión de TGF beta one en células de cáncer de ovario en cultivo proximal con HPMC. Curiosamente, se observa un ligero aumento en la expresión de TGF beta one en células de cáncer de ovario no cultivadas proximalmente, probablemente como respuesta compensatoria. El cultivo proximal con células de cáncer de ovario aumenta ligeramente la expresión de E-cadherina en las HPMC, mientras que se observa una marcada disminución de la E-cadherina en las células de cáncer de ovario cultivadas en proximidad con las HPMC en comparación con los controles, lo que demuestra aún más la eficacia del sistema de cultivo proximal para estudiar la señalización paracrina entre las células de cáncer de ovario y las células normales en el sitio de la metástasis.

Al intentar este procedimiento, es importante optimizar el número de células sembradas y la duración del cultivo proximal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunotransferencia, para responder preguntas adicionales sobre los cambios en la expresión de proteínas y la activación de las vías de señalización de procesamiento posteriores durante el cocultivo de células mesoteliales de células tumorales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del microambiente tumoral, la inmunología y la biología del desarrollo exploraran las interacciones paracrinas recíprocas entre las células a través de factores secretados.