Modelo de pulmón acelular y celular para el estudio de metástasis de Tumor

Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la progresión tumoral. El modelo pulmonar acelular y celular ex vivo permite la formación de tumor primario que crece con el tiempo y forma células tumorales circulantes y lesiones metastásicas. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar la progresión del cáncer en un tiempo abreviado y el crecimiento de diferentes tipos de células cancerosas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a nuestra terapia personalizada, ya que las células tumorales de los pacientes se pueden utilizar en el modelo para evaluar la eficacia de los fármacos terapéuticos, incluidas las células inmunitarias. Comienza con una rata profundamente anestesiada. Afeitarse el pecho y el abdomen, y limpiar la piel con un hisopo de clorhexidina.

Después de abrir la cavidad torácica, realice una toracotomía bilateral cortando la cara anterior de la caja torácica a la izquierda en el lado derecho del diafragma. Sostenga la caja torácica e inyecte dos mililitros de 1000 unidades por mililitro de heparina en el ventrículo derecho del corazón que late con una aguja de calibre 27 para evitar la formación de coágulos de sangre en el pulmón. Después de extraer la caja torácica, coloque una aguja de calibre 18 en el ventrículo izquierdo como un orificio de ventilación para permitir la salida de la sangre, luego use una aguja de calibre 25 para inyectar 15 mililitros de 12.5 unidades por mililitro de PBS heparinizado en el ventrículo derecho.

A continuación, corte la tráquea en la base de la tiroides y retire con cuidado la aorta descendente a nivel de la vena hemiazygos y las ramas de la aorta en el arco. Después de retirar el bloqueo corazón-pulmón de la cavidad torácica, corte la mitad de los ventrículos derecho e izquierdo y luego coloque una cánula de aguja de acero inoxidable de calibre 18 hecha a medida a través del ventrículo derecho hasta la arteria pulmonar principal. Asegure la cánula con la brida de seda 2-0 y exponga cuidadosamente el ventrículo derecho y la aurícula.

Comience por hacer pasar PBS heparinizado a una presión de perfusión fisiológica de 30 milímetros de mercurio hasta que fluya libremente hacia el frasco de la unidad de descelularización, luego conecte el bloqueo corazón-pulmón a la unidad de descelularización en el extremo de la arteria pulmonar a través de la cánula de la arteria pulmonar. Después de 15 minutos de lavado con PBS heparinizado, reemplace el frasco de PBS heparinizado por uno que contenga dodecil sulfato de sodio al 0,15% y agua desionizada, y perfunda el pulmón durante dos horas para la descelularización. Después de la descelularización, perfundir agua desionizada esterilizada en autoclave a través del andamio pulmonar durante 15 minutos, seguida de detergente no iónico al 1% en agua desionizada durante 10 minutos.

Finalmente, reemplace el frasco con 500 mililitros de PBS esterilizado en autoclave suplementado con antibióticos. Haga funcionar la bomba a seis mililitros por minuto y perfunda los pulmones durante 72 horas, después de lo cual el pulmón acelular está listo para su uso inmediato. Rocíe etanol al 70% en el cartucho de la bomba y configure el oxigenador conectando el extremo de salida del oxigenador al tubo de la bomba y el otro extremo a un tubo de 1,5 pies en el biorreactor.

Coloque la botella del biorreactor en una cabina de bioseguridad en condiciones asépticas. Conecte una llave de paso de tres vías a la cabeza de una esclusa Luer hembra para controlar el flujo a través de la arteria pulmonar, luego conecte una llave de paso unidireccional a otro mamparo de esclusa Luer hembra para la siembra de células a través de la tráquea. Conecte un tubo de dos pulgadas en el exterior y un tubo de seis pulgadas en el interior de la botella para hacer circular el medio.

Prepare el tubo para conectar la botella del biorreactor al oxigenador. Coloque un bloqueo Luer macho en un tubo de dos pies y conecte un estilo de orejeta Luer hembra para proporcionar accesibilidad, y conecte un bloqueo Luer macho y un bloqueo Luer hembra a dos tubos de pie. Agregue el medio de cultivo celular y transfiera el biorreactor a la incubadora.

Conecte el tubo oxigenador a los dos extremos abiertos para convertirlo en un biorreactor de circuito cerrado. Vuelva a hacer funcionar la bomba a seis mililitros por minuto para llenar el oxigenador y los tubos con medio de cultivo para que no queden burbujas de aire en el tubo. Una vez que los tubos estén llenos de medio, cierre la llave de paso y desconecte los oxigenadores de ambos extremos de la botella del biorreactor.

Coloque la botella del biorreactor en el gabinete de bioseguridad, pase el medio de cultivo a través de la llave de paso y conecte la cánula pulmonar del andamio pulmonar. Si trabaja con el modelo de pulmón celular, omita la descelularización. El pulmón extraído se puede colocar diádicamente en el biorreactor.

Vuelva a pasar el medio de cultivo a través de la llave de paso unidireccional para eliminar el aire y ate la cánula traqueal con un hilo de seda a la tráquea, luego cierre la tapa de la botella del biorreactor. Transfiera el biorreactor a la incubadora y encienda la bomba. Ejecute el medio de cultivo durante 10 a 15 minutos para asegurarse de que todos los lóbulos se inflen y que el pulmón se vea en buena forma.

Modifique el andamio pulmonar acelular o celular de la siguiente manera para el modelo metastásico. Abra la tapa del biorreactor con el andamio pulmonar colgante y use una jeringa Luer lock para pasar cinco mililitros de medio de cultivo a través de la tráquea. Use pinzas angulares para pasar seda 2-0 a través de la tráquea en el punto de bifurcación.

Ate la tráquea que va al pulmón derecho en el punto de bifurcación y verifique el flujo libre de medios a través de la tráquea hasta el pulmón izquierdo pasando el medio de cultivo. Prepare un volumen de 50 mililitros de células de cáncer de pulmón como A549 o H1299 en un medio de cultivo completo RPMI 1640 a una concentración de dos a tres millones de células por mililitro. Coloque una jeringa Luer lock de 20 mililitros encima de la cánula traqueal y agregue 15 mililitros de células a la jeringa.

Permita que la suspensión celular pase a través de los lóbulos pulmonares por gravedad. Agregue el resto de las celdas antes de que pasen las burbujas de aire. Una vez sembrado, retire la jeringa y espere 15 minutos, luego agregue medio fresco al biorreactor.

Devuélvalo a la incubadora y, después de eliminar las burbujas de aire, perfunda el andamio pulmonar a seis mililitros por minuto. La histopatología de un pulmón intacto muestra los alvéolos y los neumocitos. Como se ve aquí, la descelularización conduce a la eliminación completa de las células pulmonares, y la histopatología de los pulmones acelulares revela una membrana basal intacta.

La tinción de pentacromo y elastina de Movat de un pulmón descelularizado revela la presencia de colágeno, fibrina y elastina con vasculatura y bronquios intactos. El análisis de ADN del pulmón descelularizado muestra una reducción en el contenido de ADN de más del 99%El pulmón acelular se puede utilizar directamente en el biorreactor para el cultivo celular. Un análisis histológico muestra la presencia de crecimiento tumoral.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar inyectar la heparina en el ventrículo derecho del corazón. Tras este desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran las alteraciones genéticas y epigenéticas que conducen a la metástasis de las células tumorales en el cáncer de pulmón.