Name: Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprende a cuantificar la efagocitosis de células apoptóticas mediante microscopía de fluorescencia en macrófagos humanos y células Jurkat. Este protocolo permite evaluar vías de señalización y la captación parcial de células.

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Este estudio fue financiado por los institutos canadienses de Health Research (CIHR) operación Grant MOP-123419, ciencias naturales, ingeniería investigación Consejo de Canadá Discovery Grant 418194 y Ontario Ministerio de investigación e innovación temprana investigación Premio a BH. DGW contribuido algunas de las imágenes presentadas, a la optimización de los protocolos y a la escritura del manuscrito; él fue financiado por una subvención de cebado de la bomba de la Universidad de Liverpool. CY es financiado por una beca postgrado Vanier y beca de MD/PhD de CIHR. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Los métodos establecidos en este protocolo permiten la proyección de imagen y cuantificación del proceso dinámico efferocytic, utilizando enfoques células fijas y células vivas. Estos enfoques ofrecen varias ventajas sobre los métodos basados en citometría de flujo comúnmente empleadas23,24. El uso de adentro hacia fuera manchas con muestras fijadas proporciona una cuantificación más robusta y precisa de la tasa y el grado de efferocytosis, de hecho, muchos métod...

Apoptosis o muerte celular programada, es un proceso fisiológico altamente regulado que ocurre en la mayoría de los organismos multicelular y es crucial para su desarrollo y homeostasis1. Además de estar involucrado en el recambio celular normal y el desarrollo embrionario, la apoptosis permite la eliminación de las células infectadas o dañadas de los tejidos y puede activarse en respuesta a infección, inflamación, cáncer y también por las intervenciones médicas como radioterapia o esteroides1. Células apoptóticas exponen "comer-me" señales en su superficie celular que son reconocidas por receptores en una gama de los fagocitos profesionales y no profesionales, denominadas colectivamente como "efferocytes". Participación de estos receptores induce la captación y degradación de la célula apoptótica por el efferocyte a través de un proceso conocido como efferocytosis2,3. Fosfatidilserina es el mejor caracterizado comer-me efferocytosis conducción de la señal. Normalmente se limita a la hoja interna de la membrana plasmática, con apoptosis activando un scramblase lípidos que interrumpe esta asimetría de la membrana, exponiendo fosfatidilserina en la superficie de la célula4. Fosfatidilserina se encuentra en la superficie extracelular de algunas células no apoptóticas, tales como los macrófagos maduros y activa las plaquetas. Sin embargo, estas células no son efferocytosed debido a la presencia de "no me come" señales, como la CD47, en sus células superficiales5,6,7. Fosfatidilserina expuesto es reconocido por una variedad de receptores de efferocytic de efferocytes. Unión de estos receptores a fosfatidilserina, ya sea directamente o a través de la ayuda de opsoninas, activa vías de señalización que promueven la inmersión de la célula apoptótica en una vacuola membrana-limitan como el efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. el efferosome funde secuencialmente con endosomas y lisosomas, que entregan la maquinaria molecular necesaria para acidificar el efferosome y degradar la apoptosis de la célula de carga13,14. Una vez degradado, los materiales derivados de la célula apoptótica son traficados para el endosome reciclaje — un proceso que limita la respuesta inmune a antígenos derivados de células apoptóticas, y que pueden permitir la recuperación de nutrientes de la apoptosis de la célula13, 15. Un fracaso en los resultados de la efferocytosis en la separación deteriorada de células apoptóticas; Estas células someterse eventualmente a necrosis secundaria. Células necróticas liberan contenido citosólico pro-inflamatoria, patógenos y autoantígenos en el medio extracelular, así el conducir una variedad de enfermedades infecciosas, inflamatorias y autoinmunes16,17. Juntos, apoptosis y efferocytosis facilitan la eliminación de células muertas y moribundas y permiten el mantenimiento de la homeostasis del tejido.
Investigar los mecanismos moleculares subyacentes a efferocytosis requiere de métodos que permiten una cuantificación clara de captación de apoptosis celular. Esta cuantificación es complicada por el hecho de que a diferencia de la absorción de otros mecanismos tales como endocitosis y fagocitosis18,19, efferocytosis no pueden resultar en la inmersión de la célula objetivo intacto, dando por resultado la absorción gradual de la célula apoptótica por el efferocyte20. El protocolo descrito en este documento describe un ensayo en vitro efferocytosis que proporciona la delineación exacta de la internalizada versus no internalizan las porciones de células apoptóticas individuales y se puede combinar con una variedad de células fijas y métodos de microscopía de células vivas. Ensayos de fagocitosis tradicional añadir anticuerpos específicos al objetivo fagocítico al final del experimento para objetivos no interiorizado, la etiqueta donde como nuestro método diferencia por etiquetado el objetivo de la apoptosis con biotina covalentemente ligado21 , 22. mientras que los anticuerpos específicos de la célula apoptótica pueden ser utilizados en este análisis, el enfoque de Biotinilación permite para que cualquier destino de proteína lleva a etiquetarse y evita posibles problemas con reactividad cruzada del anticuerpo secundario si se realiza inmunotinción . En particular, describiremos la preparación de las células de Jurkat apoptotic que han sido doble tinción con un colorante de seguimiento de la célula y la biotina. La célula de seguimiento de tinte permite apoptotic mástil-célula-derivados materiales rastreados en efferocytosis, mientras que permite la discriminación de Biotinilación superficial internalizado desde porciones no interiorizada de las células apoptotic efferocytosed. También describimos la cultura y la preparación de líneas celulares de J774.2 y THP-1 para uso como efferocytes murino y humano, macrófagos derivados de monocitos de M2 como un ejemplo de celulares primarios de células efferocytosis y células de Jurkat para el uso como blancos de efferocytic. Estos métodos pueden aplicarse fácilmente a otras líneas celulares o células primarias, células diana sometidos a cualquier forma de muerte celular (por ejemplo , la necrosis y la apoptosis necroptosis) e imitadores de tamaño micrométrico que simulan células apoptóticas a través de capas de lípidos o capa con ligandos específicos de un receptor de efferocytic de interés.
El método descrito en el presente Protocolo tiene varias ventajas sobre los métodos de flujo cytometry basado comúnmente utilizados en el campo23,24. Por proyección de imagen directamente la interacción de la célula fagocito-apoptotic, combinada con un etiquetado claro de tanto material total y no interiorizados apoptotic de la célula, se pueden hacer medidas cuantitativas de efferocytosis. Por otra parte, el uso de fluoróforos pH insensible limita factores de confusión tales como la supresión de la fluorescencia de GFP y FITC a pH lisosomal que confunde algunos métodos alternativos25. Por último, aunque no se describe en detalle, estos métodos pueden emplearse utilizando efferocytes expresar transgenes marcada con fluorescencia, o con inmunotinción posteriores a la fijación, para permitir la cuantificación de la actividad de la molécula de señalización y control de la procesos celulares durante la efferocytosis.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Wisent</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>18 mm cubreobjetos de vidrio circulares #1.5 espesor</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>72290-08</td><td>El tamaño y la forma del cubreobjetos no son críticos, pero 18 mm caben en los pocillos de una placa estándar de 12 pocillos, lo que simplifica el cultivo celular</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>Disolver en DMSO a 1 mM (1,000x solución madre)</td></tr><tr><td>Anexina V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>Almacenar en un desecador. No prepare una solución madre.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Naranja</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>Medio de secración de células linfolíticas y polilinfolíticas</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 Línea celular de macrófagos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Línea celular de monocitos humanos</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular T Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Estudiar la regulación de la efferocytosis requiere de métodos que son capaces de cuantificar con precisión la absorción de células apoptóticas y los procesos de señalización y celulares que controlan el efferocytosis la punta de prueba. Esta cuantificación puede ser difícil de realizar como células apoptóticas son a menudo efferocytosed paulatinamente, así que los métodos que se pueden delinear con precisión entre la porción efferocytosed de un objetivo de apoptosis versus residual celular unengulfed los fragmentos. El enfoque descrito en el presente documento utiliza doble etiquetado enfoques para cuantificar con precisión la dinámica de la capacidad efferocytosis y efferocytic de efferocytes tales como los macrófagos. El citosol de la célula apoptótica se etiqueta con un tinte de seguimiento de la célula para permitir el seguimiento de todos los apoptóticos mástil-célula-derivados materiales, mientras Biotinilación superficial de la célula apoptótica permite diferenciar entre internalizada y no internalizan fracciones de la célula apoptótica. La capacidad de efferocytic de efferocytes se determina tomando imágenes fluorescentes de células vivas o fijas y cuantificar la cantidad de consolidados versus objetivos internalizados, como diferenciadas por la coloración de estreptavidina. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos tales como la citometría de flujo, es decir, la delineación precisa de no efferocytosed versus efferocytosed apoptóticos fracciones celulares, la capacidad de medir la dinámica efferocytic por microscopía de células vivas y la capacidad para realizar estudios de señalización celular en las células que expresan los transgenes marcada con fluorescencia. Combinados, los métodos establecidos en este protocolo sirven como base para un enfoque experimental flexible que puede utilizarse para cuantificar con precisión la actividad efferocytic e interrogar vías de señalización celulares activas durante efferocytosis.

Noche de cultura de células Jurkat con resultados de estaurosporina de 1 μm en la apoptosis de &gt; 95% de las células, que pueden confirmarse con anexina V tinción (figura 1). Otros tipos de células pueden ser utilizados para estos experimentos, aunque la concentración de estaurosporina y la duración del tratamiento de estaurosporina necesitará optimizarse para cada línea celular. Para la detección confiable y cuantificación de efferocytosis, &gt; 80% de las...

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la eferrocitosis, como el papel de las moléculas de señalización en la mediación de la absorción de células apoptóticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una cuantificación clara de la captación de células apoptóticas, incluida la captación parcial o fragmentada de células apoptóticas, lo que no siempre es evidente con otros métodos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la eferocitosis de las células inmunitarias, también se puede aplicar a otros tipos de células, como las células epiteliales o cancerosas.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad de optimizar los ajustes de adquisición del microscopio. Después de preparar los macrófagos humanos y las células Jurkat apoptóticas, use un hemocitómetro para contar las células apoptóticas. A continuación, transfiera una cantidad suficiente de células apoptóticas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Granule las células de Jurkat mediante centrifugación a 500 veces g durante cinco minutos. A continuación, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS. Mientras las células Jurkat están en la centrífuga, alícuota 10 microlitros de DMSO en un nuevo tubo de microcentrífuga.A continuación, disuelva una cantidad mínima de NHS-Biotin en el DMSO. Después de esto, transfiera 500 microlitros de la célula apoptótica y la suspensión de PBS al tubo que contiene DMSO y NHS-Biotina. Luego, diluya un tinte de seguimiento celular adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Incubar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Luego, agregue un volumen igual de RPMI 1640 con 10% de FBS e incube la suspensión a temperatura ambiente en la oscuridad durante cinco minutos adicionales. Después de esto, granule las células mediante centrifugación a 500 veces g durante cinco minutos.A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células teñidas en 100 microlitros de RPMI 1640 con 10% de FBS. Agregue 100 microlitros de suspensión celular teñida gota a gota a cada pocillo de macrófagos. A continuación, centrifugar la placa a 200 veces g durante un minuto.Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5%CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos. Después del período de incubación adecuado, retire las células de la incubadora. A continuación, lavar las células dos veces con un mililitro de PBS.Después de esto, agregue estreptavidina diluida conjugada con FITC a cada pocillo. E incubar la placa durante 20 minutos en la oscuridad. Lave las células tres veces con un mililitro de PBS y agite suavemente las muestras durante cinco minutos después de cada enjuague.A continuación, fije las células con un 4% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague las celdas una vez con PBS para eliminar el exceso de PFA. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de diagnóstico por imágenes y transfiera el portaobjetos a un microscopio de fluorescencia.Capture pilas Z de un número suficiente de celdas para la cuantificación. Es fundamental establecer la distancia entre dichas secciones de manera que se detecte todo el material apoptótico engullido. La distancia máxima entre dichas secciones no debe ser mayor que la profundidad focal de la lente del objetivo, generalmente de 0,5 a un micrómetro.Cargue una de las pilas Z en el software utilizando la función Importar. A continuación, seleccione Densidad integrada como opción de medición en el panel Establecer mediciones. El análisis es más fácil de realizar si los canales de estreptavidina y colorante de seguimiento celular se muestran como una superposición.Cualquier objeto con tinción de estreptavidina en cualquier lugar a lo largo de una circunferencia debe considerarse estreptavidina positiva y, por lo tanto, no debe cuantificarse como estreptavidina negativa. Una vez cargada la imagen, usando la estreptavidina y la herramienta de selección de polígonos o mano alzada, encierre en un círculo todo el material negativo de estreptavidina positivo para colorantes de seguimiento de celdas en un solo plano de la pila Z. A continuación, mida la intensidad integrada del tinte de seguimiento celular en la región.En la misma sección Z, use la tinción de estreptavidina y la herramienta de selección a mano alzada o polígono para rodear todo el material positivo para estreptavidina con colorante de seguimiento celular. Por último, medir la intensidad integrada de esta región. Con este procedimiento, más del 95% de las células Jurkat tratadas con estaurosporina sufrieron apoptosis.En la mayoría de los experimentos, la fracción de células apoptóticas que se eferrocistan aumentó de forma dependiente del tiempo. Al optimizar este protocolo para diferentes tipos de células eferocíticas, o diferentes dianas de células apoptóticas, es importante probar el rango de proporciones de células apoptóticas a células eferocíticas. Por lo general, las proporciones de 10 a uno o de 30 a uno funcionan mejor.Este procedimiento se puede modificar fácilmente para rastrear la activación de la molécula de señalización, o el tráfico intracelular mediante la expresión de genes reporteros fluorescentes en las células eferocíticas, lo que permite obtener imágenes de estos procesos durante la eferocitosis.

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos el ensayo de eferocitosis para estudiar el aclaramiento de células apoptóticas utilizando microscopía confocal. La eferocitosis es un proceso de varios pasos en el que las células apoptóticas son engullidas por fagocitos y degradadas dentro de vesículas llamadas eferosomas. Este protocolo proporciona un método para visualizar porciones internalizadas y no internalizadas de células apoptóticas individuales y cuantificar la eferocitosis.

Ensayo de eferocitosis de células fijas: un método para estudiar la absorción eferocítica de células apoptóticas por macrófagos mediante microscopía de fluorescencia

Este video muestra un método para cuantificar la fagocitosis de esporas de hongos patógenos marcados con FITC por leucocitos humanos. Las esporas fagocitadas se distinguen de las esporas adherentes a las células mediante la contratinción, seguida de un análisis de citometría de flujo.

Medición cuantitativa por citometría de flujo de la fagocitosis de esporas fúngicas por fagocitos humanos

El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.

Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

Este artículo describe un protocolo de citometría de flujo basado en FRET para cuantificar el autoensamblaje de proteínas en células De. cerevisiae y HEK293T.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.

Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal

Aquí presentamos el protocolo para la reconstitución escalonada de células presentadoras de antígenos sintéticos utilizando bicapas lipídicas soportadas por perlas y su uso para interrogar la salida sináptica de las células T activadas.

Preparación de bicapas lipídicas soportadas por perlas para estudiar la producción de partículas de las sinapsis inmunes de células T

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

Aprende a cuantificar la efagocitosis de células apoptóticas mediante microscopía de fluorescencia en macrófagos humanos y células Jurkat. Este protocolo permite evaluar vías de señalización y la captación parcial de células.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

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