Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la eferrocitosis, como el papel de las moléculas de señalización en la mediación de la absorción de células apoptóticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una cuantificación clara de la captación de células apoptóticas, incluida la captación parcial o fragmentada de células apoptóticas, lo que no siempre es evidente con otros métodos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la eferocitosis de las células inmunitarias, también se puede aplicar a otros tipos de células, como las células epiteliales o cancerosas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad de optimizar los ajustes de adquisición del microscopio. Después de preparar los macrófagos humanos y las células Jurkat apoptóticas, use un hemocitómetro para contar las células apoptóticas. A continuación, transfiera una cantidad suficiente de células apoptóticas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Granule las células de Jurkat mediante centrifugación a 500 veces g durante cinco minutos. A continuación, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de PBS. Mientras las células Jurkat están en la centrífuga, alícuota 10 microlitros de DMSO en un nuevo tubo de microcentrífuga.

A continuación, disuelva una cantidad mínima de NHS-Biotin en el DMSO. Después de esto, transfiera 500 microlitros de la célula apoptótica y la suspensión de PBS al tubo que contiene DMSO y NHS-Biotina. Luego, diluya un tinte de seguimiento celular adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Incubar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Luego, agregue un volumen igual de RPMI 1640 con 10% de FBS e incube la suspensión a temperatura ambiente en la oscuridad durante cinco minutos adicionales. Después de esto, granule las células mediante centrifugación a 500 veces g durante cinco minutos.

A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células teñidas en 100 microlitros de RPMI 1640 con 10% de FBS. Agregue 100 microlitros de suspensión celular teñida gota a gota a cada pocillo de macrófagos. A continuación, centrifugar la placa a 200 veces g durante un minuto.

Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5%CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos. Después del período de incubación adecuado, retire las células de la incubadora. A continuación, lavar las células dos veces con un mililitro de PBS.

Después de esto, agregue estreptavidina diluida conjugada con FITC a cada pocillo. E incubar la placa durante 20 minutos en la oscuridad. Lave las células tres veces con un mililitro de PBS y agite suavemente las muestras durante cinco minutos después de cada enjuague.

A continuación, fije las células con un 4% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague las celdas una vez con PBS para eliminar el exceso de PFA. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de diagnóstico por imágenes y transfiera el portaobjetos a un microscopio de fluorescencia.

Capture pilas Z de un número suficiente de celdas para la cuantificación. Es fundamental establecer la distancia entre dichas secciones de manera que se detecte todo el material apoptótico engullido. La distancia máxima entre dichas secciones no debe ser mayor que la profundidad focal de la lente del objetivo, generalmente de 0,5 a un micrómetro.

Cargue una de las pilas Z en el software utilizando la función Importar. A continuación, seleccione Densidad integrada como opción de medición en el panel Establecer mediciones. El análisis es más fácil de realizar si los canales de estreptavidina y colorante de seguimiento celular se muestran como una superposición.

Cualquier objeto con tinción de estreptavidina en cualquier lugar a lo largo de una circunferencia debe considerarse estreptavidina positiva y, por lo tanto, no debe cuantificarse como estreptavidina negativa. Una vez cargada la imagen, usando la estreptavidina y la herramienta de selección de polígonos o mano alzada, encierre en un círculo todo el material negativo de estreptavidina positivo para colorantes de seguimiento de celdas en un solo plano de la pila Z. A continuación, mida la intensidad integrada del tinte de seguimiento celular en la región.

En la misma sección Z, use la tinción de estreptavidina y la herramienta de selección a mano alzada o polígono para rodear todo el material positivo para estreptavidina con colorante de seguimiento celular. Por último, medir la intensidad integrada de esta región. Con este procedimiento, más del 95% de las células Jurkat tratadas con estaurosporina sufrieron apoptosis.

En la mayoría de los experimentos, la fracción de células apoptóticas que se eferrocistan aumentó de forma dependiente del tiempo. Al optimizar este protocolo para diferentes tipos de células eferocíticas, o diferentes dianas de células apoptóticas, es importante probar el rango de proporciones de células apoptóticas a células eferocíticas. Por lo general, las proporciones de 10 a uno o de 30 a uno funcionan mejor.

Este procedimiento se puede modificar fácilmente para rastrear la activación de la molécula de señalización, o el tráfico intracelular mediante la expresión de genes reporteros fluorescentes en las células eferocíticas, lo que permite obtener imágenes de estos procesos durante la eferocitosis.