Name: Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Aprende a fabricar chips de órgano microfluídicos elásticos con doble canal mediante moldes impresos en 3D. Este método permite recrear funciones orgánicas in vitro con estiramiento mecánico y perfusión.

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Agradecemos a M. Rousseau y S. Kroll para obtener ayuda con la fotografía y videografía Ingram M., J. Nguyen, D. Shea y Wen N. contribuciones al desarrollo de protocolo de fabricación inicial. Esta investigación fue patrocinada por el Instituto Wyss para biológicamente inspirado de ingeniería en la Universidad de Harvard y la Defense Advanced Research Projects Agency bajo acuerdos cooperativo #W911NF-12-2-0036 y #W911NF-16-C-0050 y FDA concesión # HHSF223201310079C, subvenciones de NIH R01-EB020004 # y #UG3-HL141797-01, y la Fundación Bill y Melinda Gates concede #OPP1163237 y #OPP1173198 a DEI. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no debe interpretarse como que representa la política oficial, ya sea expresa o implícita, de la Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, la Institutos nacionales de salud, o el gobierno de Estados Unidos.

1. general preparación
<ol><li>Para evitar desperdicios, limpiar área de trabajo con cinta de embalaje y limpiar con trapo para salas blancas y alcohol isopropílico.</li>
	<li>Para todos los pasos que requieren PDMS, mezcla de PDMS en una proporción 10:1 (10 g de Cruz enlazan a agente, 100 g de elastómero base). Mezcle a mano o con un mezclador disponible en el mercado. Utilizar un mezclador planetario centrífugo aquí: mezclar durante 2 minutos a 2000 rpm, luego desgasificar el PDMS por 2 minutos a 2200 rpm.</li>
	<li>Limpia todos los moldes con pistola de aire para soplar antes de utilizar los desechos. PRECAUCIÓN: No use pinzas metálicas para quitar escombros, ya que dañarán la superficie de los moldes.</li>
</ol>2. superior canal preparación
<ol><li>Limpie el lado brillante de cada pieza de poliuretano con etanol y sala limpia. Asegúrese de que todos etanol residual se seca de la superficie del poliuretano.</li>
	<li>Coloque el lado brillante de poliuretano sobre el lado abierto del molde para crear un sello en la parte abierta del molde, dejando sólo una apertura bien-como en la parte superior del molde para verter PDMS MiP. Nota: Verifique que cada molde es cubierto firmemente por pieza de poliuretano o el PDMS presentarán fugas de moldes durante el vertido.</li>
	<li>Coloque el molde y poliuretano asambleas en una plantilla del MiP, con el lado texturizado contra el extremo de la plantilla de MiP. Continuar haciendo esto hasta que los moldes se han colocado en la plantilla.</li>
	<li>Ajuste la plantilla de MiP girando la palanca con una llave hasta que el espacio de la plantilla es de 25 mm de ancho.</li>
	<li>Hacer un barco de papel de aluminio alrededor de la plantilla de MiP para evitar exceso PDMS de fugas sobre las superficies.</li>
	<li>Vierta PDMS en cada uno de los moldes bien hasta completa. Nota: Cada componente superior del chip requiere aproximadamente 3 mL de PDMS.</li>
	<li>Una vez que se llena la plantilla entera, coloque la plantilla en el desecador de vacío. Tirar al vacío a-80 kPa durante 1 h a degas PDMS.</li>
	<li>Después de 1 h, retire la plantilla de MiP del desecador y colocar en horno de 60 º C durante al menos 4 horas curar PDMS.</li>
	<li>Desmontar la plantilla de MiP con una llave, afloje la plantilla girando la manija hacia la izquierda. Una vez libres de compresión moldes, sacar moldes de plantilla.</li>
	<li>Retire las tiras de poliuretano de cada molde y deseche.</li>
	<li>Con cuidado desmoldar piezas de PDMS de sus moldes y ponen característica hacia arriba.</li>
	<li>Alinee la hoja de rascador de azulejo en la posición de final ficha y cortar cada extremo que separarán los componentes principales.</li>
	<li>Revise las partes de cualquiera de los siguientes modos de fallo y descarte cualquier parte insatisfactoria: rasguños en el canal principal, basura grande encima de la zona del canal, las burbujas grandes, deformados canales de vacío.</li>
	<li>Almacenar piezas acabadas en cajas Petri cuadrada dentro de armarios positivos de presión a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. fondo canal preparación
<ol><li>Vierta aproximadamente 10,5 g de PDMS en moldes hasta que el PDMS alcanza la parte superior de la cavidad.<ol>
<li>Inspeccione el molde de canal inferior para PDMS curada hasta el fondo del molde.</li>
		<li>Si está sucio, raspar PDMS viejo desde el fondo del molde ya que una superficie irregular en la parte inferior del molde puede causar desigual espesor de las piezas finales. Nota: para los pequeños < 2 cm2 áreas al descubierto, la pistola de aire se pueden utilizar muy suavemente a mover PDMS sobre el espacio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque los moldes en desecador de vacío de 1 h.</li>
	<li>Después de 1 h, mover los moldes en un horno de nivel 60 º C durante > 4 h.</li>
	<li>Coloque el molde sobre la mesa en campana de flujo laminar. Afloje el PDMS de un extremo del molde.</li>
	<li>Agarre una esquina y retire suavemente el PDMS de la superficie del molde.</li>
	<li>Cuando quita completamente, coloque en la superficie de trabajo, de manera que características del canal son cara arriba.</li>
	<li>Piezas cortadas a lo largo de los bordes exteriores con cortadores de azulejos, colocación de azulejo de cuchilla en PDMS con muescas como en el paso 2.12.</li>
	<li>Haceos partes laterales de la función en la cinta para quitar cualquier residuo.</li>
	<li>Eliminar parte de la cinta del embalaje. Arrastre el extremo suelto de la parte a través de la diapositiva. El extremo suelto se laminado con el vidrio. Nota: Es fundamental para evitar la parte de estiramiento mientras lo establecen. Si la burbuja está atrapada entre la parte y el vidrio, suavemente Levante la pieza con las pinzas y volver a poner.</li>
	<li>Realizar inspección de control de calidad de piezas. Revise las partes de cualquier modo de falla y deseche cualquier parte insatisfactoria, los que contengan rayones en el canal principal, basura grande, grandes burbujas o canales de vacío deformados incluyendo.</li>
	<li>Cubrir funciones con cinta.</li>
	<li>Guarde las piezas en un gabinete a temperatura ambiente la presión positiva.</li>
</ol>4. preparación de membranas PDMS
<ol><li>Compruebe que las obleas estén libres de PDMS en la parte posterior.</li>
	<li>Coloque cada oblea de membrana en las ranuras en las bandejas AMF.</li>
	<li>Utilice la jeringa de 1 mL para colocar 0,09 mL de PDMS en el centro de cada arreglo de discos de membrana oblea post. Deje PDMS para un mínimo de 5 minutos para permitir que el PDMS difundir a lo largo de los postes de la oblea de la membrana. Nota: No vaya al paso siguiente hasta cubrir al menos el 75% de la matriz de correos en PDMS. Mejora de la calidad de las membranas más se permite que el PDMS mecha en la región de post por lo que se prefieren los tiempos de espera más largos en este paso.</li>
	<li>Plasma tratar la tira de policarbonato en 20 W de 45 s, O2 gas a 0.80 mbar en una máquina de plasma.</li>
	<li>Retire la hoja del policarbonato de la máquina de plasma y utilizar tijeras para cortar las hojas de policarbonato en 45 x 45 mm cuadrados. Nota: Minimizar el contacto con el plasma de la superficie tratada para evitar que el polvo se pegue al policarbonato.</li>
	<li>Suavemente Coloque el lado de plasma Tratado de los cuadrados de policarbonato en el PDMS líquido centrado en la oblea de la membrana. Asegúrese de que el policarbonato y el PDMS están en contacto. Nota: Evitar bolsas de aire entre el policarbonato y el PDMS.</li>
	<li>Coloque al espaciador PDMS cortado en el centro de la Plaza de policarbonato.</li>
	<li>Coloque la lámina de policarbonato con textura corta en el bloque PDMS para mantener a la Asamblea de la Unión a la placa de compresión.</li>
	<li>Inserte la bandeja para que bandeja 3 está en la parte trasera, bandeja 2 está en el centro y bandeja 1 está en la parte delantera. La bandeja 1 tiene una muesca de alineación.</li>
	<li>Abra la válvula de presión de salida y abrir muy lentamente la válvula de presión de entrada. Sólo entonces cerrar la válvula de presión de salida. Nota: Esto es para que la salida de 4 kg de fuerza se aplica gradualmente a cada oblea de membrana frente al instante, que puede romper las obleas.</li>
	<li>Llevar el interruptor de AMF en ON para comenzar el ciclo de curado. Curar la oblea debajo de 4 kg (16 kPa) de compresión y un ciclo de temperatura rampa enumerados en la tabla 1.</li>
</ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:323px;" width="322"><colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="39">
<td height="39" style="height:39px;width:91px;">Paso</td>
			<td style="width:131px;">Temperatura (° C)</td>
			<td style="width:101px;">Duración (min)</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">1</td>
			<td align="right">20</td>
			<td align="right">20</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">2</td>
			<td align="right">35</td>
			<td align="right">10</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">3</td>
			<td align="right">45</td>
			<td align="right">10</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">4</td>
			<td align="right">50</td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">5</td>
			<td align="right">60</td>
			<td align="right">120</td>
		</tr>
<tr height="18">
<td align="right" height="18" style="height:19px;">6</td>
			<td align="right">20</td>
			<td>Mantenga</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1 - membrana de curado en condiciones
<ol start="12"><li>Cierre la válvula de presión de entrada y abrir la válvula de presión de salida para liberar la presión de los cilindros de aire.</li>
	<li>Retire las bandejas y llevarlos a la campana de flujo laminar.</li>
	<li>Cuidadosamente retire el policarbonato con textura y cuidadosamente retirar al espaciador de PDMS. Nota: Ver el separador PDMS para asegurar no también pelar apagado el portador de policarbonato, en este caso comienzo peeling desde una esquina diferente.<ol>
<li>Inspeccione la membrana PDMS, a través de la compañía de policarbonato para las áreas con orificios y use un marcador para trazar el contorno de la zona por el agujero y Marque cualquier agujeros o defectos en las membranas.</li>
		<li>Con oblea manejo de pinzas, afloje las obleas de la bandeja.</li>
		<li>Retire cada membrana de la oblea y colocar en placa de Petri. Nota: La membrana PDMS se desmoldar de la oblea de la membrana y se adhirió al copia de seguridad de policarbonato. Si PDMS empieza a separar de la compañía de policarbonato, pele de una región diferente.</li>
		<li>Almacenar las membranas y obleas en cajas Petri en un gabinete a temperatura ambiente la presión positiva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. montaje y preparación de la tapa
<ol><li>Usa cinta de mate, limpiar las membranas PDMS, así como los interiores de la caja Petri para eliminar los desechos.</li>
	<li>Fondo de cinta al lado de la función de cada componente superior para eliminar la suciedad.</li>
	<li>Coloque el canal superior parte ("top") característica lado arriba en placa de Petri con membrana PDMS. Nota: Tenga en cuenta que algunas membranas pueden utilizarse para la parte superior uno o dos dependiendo del tamaño de la superficie útil. Los canales principales de cada parte superior deben encajar dentro de la zona de la membrana.</li>
	<li>Cargue los platos Petri en la máquina de plasma.</li>
	<li>Plasma tratar la membrana y la parte superior a 20 W de 45 s, O2 gas a 0.80 mbar.</li>
	<li>Una vez finalizado el ciclo de vinculación, retire los platos y establecer las partes activadas lado característica sobre la membrana y asegurar parte completamente laminada con membrana sin burbujas.</li>
	<li>Coloque las partes en el horno de 60 º C por al menos 2 h para templar.</li>
	<li>Con un bisturí, trace una línea alrededor del perímetro de la parte superior de servidumbre para separar el conjunto membrana arriba del portador de policarbonato. Nota: No corte el portador.</li>
	<li>Una vez que el artículo está trazado, pelar la Asamblea en el policarbonato. La membrana PDMS que se enlaza a la parte superior debe pelar del portador.</li>
	<li>Utilizando pinzas con punta afiladas, retire la membrana de los puertos que acceder al canal de la parte inferior y retire cualquier residuo o polvo con fórceps bajo un estereoscopio. Nota: No deje ninguna parte de la membrana que cubre el puerto de acceso.</li>
</ol>6. chip Asamblea
<ol><li>Característica hacia arriba, asambleas de tratar de plasma con los componentes de la parte inferior en las condiciones de paso 5.5.</li>
	<li>Bajo un microscopio invertido, alinee el conjunto superior con portaobjetos en la parte inferior media.</li>
	<li>Colocar en horno de 60 º C durante al menos 2 h.</li>
	<li>Chip de Control de calidad inspección Nota: Preste especial atención a los principales puertos y de la viruta. Busque los modos de falla por el ojo y también bajo el microscopio.<ol>
<li>Para comprobar que el chip está totalmente consolidado, tire ligeramente en cada esquina del chip para comprobar piezas delaminating.</li>
		<li>Buscar en el canal del chip para comprobar si una membrana arrugada o flácida, que aparecerá como un patrón ondulado o una ligera desviación en el canal.</li>
		<li>Realizar una inspección de microscopio para inspeccionar la suciedad en el canal principal. Nota: Desechos en áreas no críticas, como los canales de vacío son aceptable.</li>
		<li>Con el chip en el microscopio invertido, inspeccione el canal principal y canales de vacío para exfoliación. Nota: Delaminación en áreas no críticas (por ejemplo, el borde del chip) es aceptable.</li>
		<li>Verificar que los canales principales se alinean para dentro de 50-60 μm (1-2 poros de membrana). Nota: Es fundamental que los canales no se solapan con los canales de vacío.</li>
		<li>Compruebe que la membrana entre los canales principales y los canales de entrada y salida está intacta sin ningún aparente agujeros. Nota: Cualquier agujero en la membrana puede conducir a un chip con fugas o crecimiento celular fuera de los canales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tienda de chips en placas de Petri en un gabinete a temperatura ambiente la presión positiva.</li>
</ol>

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</ol>

D.E.I. es fundador y tiene acciones en emular, Inc. y preside su Consejo Asesor científico. J.P. es actualmente un empleado de emular, Inc. R.N., Y.C., J.P., y D.E.I. son inventores sobre propiedad intelectual que ha sido licenciada a emular, Inc.

El proceso de fabricación se basa en moldes impresos 3D de alta resolución al patrón el PDMS superior e inferior órgano cuerpo componentes junto con membranas PDMS porosas micromolded. Este enfoque crítico fue seleccionado debido a la facilidad de prototipos combinado con la rápida transición hacia mayor fabricación y sustitución de herramientas. Los moldes principales componentes están diseñados para puertos de patrón en lugares precisos con perfiles definidos durante la etapa de fundición. Esto no sólo evita la mano de...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58151/scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ">Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips</a>.  The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
<img alt="Papp formula for permeation rate analysis in a scientific study, featuring equation variables." src="/files/ftp_upload/58151/58151eq1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1">
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Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
<img alt="Permeability coefficient equation, Papp, showing variables for diffusion analysis." src="/files/ftp_upload/58151/58151eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1">
The References section has been updated from:
<ol start="19">
	<li>Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at &lt;http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf&gt; (2007).</li>
	<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
	<li>Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
	<li>Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).</li>
	<li>Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).</li>
</ol>
to:
<ol start="19">
	<li>Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).</li>
	<li>Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
	<li>Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).</li>
	<li>Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58151/scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ">Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips</a>.&#160; The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.

Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Aquí, describimos la fabricación de doble canal, dispositivos de cultura microfluídicos de órgano-en-un-Chip (Chip de órgano) vascularizados mediante un protocolo escalable dispuesto para el uso de grupos de investigación que carecen de acceso a salas blancas y herramientas de litografía blanda tradicional. Estos dispositivos se han desarrollado para recapitular humanas funciones órgano de comprensión normal y fisiología de la enfermedad, así como droga las respuestas in vitro1,2. Crítica a la ingeniería de esta funcionalidad son dos canales de microfluidos perfundidos, separados por una membrana semipermeable (figura 1). Este diseño permite la recreación de interfaces tejido entre al menos dos tipos de tejidos, por lo general células parenquimatosas de órganos en un lado de la membrana porosa y endotelio vascular en el otro, así como su exposición al flujo de fluidos. Además, porque el polímero elastomérico, poly (siloxano dimethyl) (PDMS), se utiliza para fabricar el cuerpo del órgano Chip y componentes de la membrana, tensiones mecánicas cíclicas pueden aplicarse a toda la ingeniería del tejido interfaz vía el elástico membrana para imitar el microambiente físico natural de los órganos de la vida, como respiración movimientos en el pulmón y la peristalsis en el intestino.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58151/58151fig1.jpg"> Figura 1: sección de órgano Chip. Órgano Chips consisten en dos canales separados por una membrana porosa y elástica que puede ser sembrada con células en ambos lados. Canal superior las secciones transversales son 1 mm de ancho x fondo alto, 1 m m del canal transversal secciones son 1 mm de ancho x 0.2 mm alto y vacío canales ambos y partes inferiores son de 0,3 mm de ancho, 0,5 mm de altura y espaciados 0,3 mm de los canales fluídicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58151/58151fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Estos estirable, doble canal, órgano Chips han sido utilizados para demostrar el impacto de la respiración el movimiento en la absorción de nanopartículas en el pulmón y el edema pulmonar inducido por drogas3,4; efectos del movimiento peristáltico en diferenciación5 y sobrecrecimiento bacteriano en el intestino5,6,7; y la influencia de las deformaciones cíclicas debido a las pulsaciones del corazón en la diferenciación y maduración de los podocytes glomerulares en el riñón8. Además, estos dispositivos de dos luces que contienen un canal vascular endotelio alineado, separado por una matriz extracelular (ECM)-membrana revestida de células parenquimatosas en un canal de acceso por separado están bien adaptadas para caracterización de drogas PK parámetros y nuevo descubrimiento de blanco, que ha sido limitado en perfusión única canal de sistemas. Por otra parte, múltiples Chips de órgano puede vincularse a través de sus canales vasculares para efectivamente crear un humano cuerpo-on-chips, que podrían ofrecer una plataforma atractiva humanos en vitro para el desarrollo de la terapéutica9, 10. A diferencia de micro-fisiológico más sistemas (MPS)11,12,13, las virutas de órgano contienen dos canales de microfluidos separados por una membrana porosa que facilita interacciones vascular parénquima recapitular en vivo la función del órgano. Esto no sólo simplifica la vinculación de los diferentes órganos juntos por perfundiendo un medio común a través de los canales vasculares, pero la compartimentalización de tejidos y fluidos imita en vivo las funciones y soporta experimentación farmacocinético y modelado y en vitro-en vivo extrapolación9,10 que es difícil o imposible en solo canal MPS14,15,16. La popularidad de PDMS en dispositivos microfluídicos ha llevado al desarrollo de herramientas para superar la capacidad inherente del material para absorber moléculas pequeñas10,17. Sin embargo, el gran número de fichas necesario para los estudios biológicos, donde el uso de agentes microbianos y compuestos absorbentes de PDMS que reutilizar fichas órgano difícil requiere un proceso de fabricación escalable incluso para grupos pequeños. El protocolo descrito aquí presenta un método para la fabricación de dispositivo adecuado para el uso en laboratorios académicos, los que carecen de acceso a salas limpias y litografía blanda incluidos. Este protocolo tiene como objetivo ampliar el acceso a fichas de órgano por una amplia gama de investigadores que buscan utilizar los dispositivos elásticos, canales para explorar procesos biológicos básicos, así como desarrollo terapéutico traslacional.
Aprovechando las mejores prácticas de microfabricación campos juntados con el diseño para la fabricación, un robusto enfoque fue desarrollado para la fabricación de dispositivos de Chip de órgano en grandes cantidades con rendimiento y alta reproducibilidad. El protocolo de fabricación descrito aquí proporciona un método escalable para la producción de la viruta del órgano. Describimos el uso de un opcional molde en lugar plantilla (MiP, detalles de diseño en Materiales complementarios) juntada con las tiras de poliuretano Junta para ampliación de bastidor componentes PDMS. El lado brillante de las tiras de poliuretano produce piezas PDMS ópticamente lisas mientras que el lado texturado facilita el desmoldeo. También describimos el uso de una opcional automática membrana fabricante (AMF) que proporciona la compresión uniforme de moldes de oblea de membrana durante el curado para la fabricación de hasta 24 membranas por lote. El diseño es ampliamente aplicable para estudios de órganos que se componen de tejidos que experimentan tensiones mecánicas y la perfusión, y estos chips se pueden producir con poca variabilidad de chip a chip en cantidades necesarias para satisfacer las necesidades de pequeñas y grandes grupos de investigación por igual. El flujo de trabajo es susceptible de un formato por lotes o línea de montaje y fácilmente compatible con protocolos de evaluación de calidad para el control de procesos de producción, formación de personal y resolución de problemas capacidad de respuesta. Esperamos que este protocolo ampliará acceso a las capacidades de doble canal, estirable, Chips de órgano para la investigación básica y traslacional.

<table><tbody><tr><td>Equipo de protección individual</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Redecilla para el cabello</td><td>VWR</td><td>89107-770</td><td></td></tr><tr><td>Bata de laboratorio Tyvek</td><td>VWR</td><td>13450-506</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de puño extendido</td><td>VWR</td><td>89521-898</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapete de corte</td><td>VWR</td><td>102096-430</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de azulejos</td><td>McMaster-Carr</td><td>26765A31</td><td></td></tr><tr><td>Moldes superiores de molde en el lugar (MIP)</td><td>Protolabs, Inc.</td><td>impreso a medida</td> en moldes <td>inferiores Prototherm 12120</td></tr><tr><td>Mold-in-place (MIP)</td><td>Protolabs, Inc.</td><td>impreso a medida</td><td>en Prototherm 12121</td></tr><tr><td>Pinza curva Pico de pato</td><td>VWR</td><td>63041-864</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de punta afilada</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>Espátula metálica</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-528</td><td></td></tr><tr><td>Grabado iónico reactivo profundo (DRIE)&nbsp; obleas de matriz de pilares</td><td>Sensera, Inc.</td><td>Personalizado</td><td>Cuatro matrices de pilares de 50 x 50 mm por oblea; pilares de 7 mmm de ancho, 50 mmm de alto, espaciados hexagonalmente a 40 mm</td></tr><tr><td>de distancia Policarbonato texturizado de .01" de espesor</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K33</td><td>cortado a bloques</td></tr><tr><td>cuadrados de PDMS de 45 mm (40 x 40 x 5 mm)</td><td>n/a</td><td>Campana</td> de flujo laminar personalizada <td></td></tr><tr>BVBI <td>fundido internamente</td><td></td><td>Germfree</td><td>BVBI</td> Pistola</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de aire comprimido60 y grados; Horno</td><td></td><td></td><td></td>de nivel C</tr><tr><td>Desecador</td><td></td><td></td><td></td>de vacío</tr><tr><td>Precisión del balance</td><td></td><td></td> de masa <td>de hasta 0,1 g</td></tr><tr><td>Máquina de plasma</td><td>Diener</td><td>La</td><td>capacidad de plasma de nano oxígeno es crítica</td></tr><tr><td>Suministros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 poly (dimetilsiloxano) (PDMS) base/kit de agente de curado</td><td>Ellsworth Adhesives& nbsp;</td><td></td><td></td>4019862</tr><tr><td>Vaso</td><td></td><td></td> mezclador <td>Garantice una ventilación adecuada al manipular prepolímeros debido a los bajos niveles de etilbenceno</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>VWR</td><td>10099-395</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas para salas limpias</td><td>VWR</td><td>TWTX1080</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm portaobjetos de microscopio de vidrio VWR</td><td></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de embalaje</td><td>VWR</td><td>500043-724</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>VWR</td><td>500026-873</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de poliuretano (PU) troqueladas Atlantic</td><td>Gasket, Inc.</td><td>Personalizado: AGWI2X3</td><td>&nbsp; 1/8" grueso; Poliuretano negro de 60 durómetros; 2" x 3"</td></tr><tr><td>Película de policarbonato de .005" de espesor</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K102</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri cuadradas cuadradas de 100 x 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>60872-480</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Papel</td><td></td><td></td><td></td> de aluminio</tr><tr><td>Opcional Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thinky Mezclador PDMS</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Plantilla de molde en el lugar (MIP)</td><td>Plantilla de</td><td>compresión de abrazadera de tornillo</td>interna <td></td></tr><tr><td>Fabricante automatizado de membranas (AMF)</td> <td>Matriz de pistones de compresión neumática interna</td><td></td><td></td> con calentador programable</tr></tbody></table>

fabricación escalable de elástico, doble canal, chips microfluídicos órgano

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Un número importante de compuestos de plomo falla en la tubería farmacéutica porque estudios en animales a menudo no logran predecir la respuesta clínica en pacientes humanos. Humanos órgano-en-un-Chip (Chip de órgano) de la célula cultura dispositivos microfluídicos, que proporcionan una plataforma experimental en vitro para evaluar la eficacia, toxicidad y perfiles farmacocinéticos (PK) en seres humanos, pueden ser mejores predictores de eficacia terapéutica y seguridad en la clínica en comparación con los estudios en animales. Estos dispositivos pueden utilizarse para modelar la función de prácticamente cualquier tipo de órgano y fluídicamente pueden vincularse a través de microcanales de revestimiento de endotelio común para llevar a cabo estudios en vitro en fisiología humana nivel de órgano y conjunto a nivel de cuerpo sin tener que realizar experimentos en la gente. Estos Chips de órgano consisten en dos canales de microfluidos perfusión separados por una membrana elastomérica permeable con células parenquimatosas de órganos específicos en un lado y el endotelio microvascular, que puede estirar cíclicamente para proporcionar órgano-específicas señales mecánicas (p. ej., respiración de movimientos en el pulmón). Este protocolo detalla la fabricación de canal dual, flexible, Chips de órgano a través de la fundición de piezas utilizando 3D impreso moldes, permitiendo la combinación de varios casting y pasos de procesamiento posterior. Polietileno poroso (siloxano dimethyl) membranas (PDMS) se echan con micrómetro de tamaño agujeros utilizando silicio Pilar bajo compresión. Fabricación y montaje de órganos consiste en equipos y medidas que pueden aplicarse fuera de una sala tradicional. Este protocolo ofrece a los investigadores acceso a tecnología de Chip de órgano en vitro estudios a nivel de órganos y cuerpo en el descubrimiento de medicamentos, seguridad y eficacia de prueba, así como estudios mecanicistas de los procesos biológicos fundamentales.

El protocolo que presentamos describe la fabricación escalable de PDMS órgano Chips. Estos dispositivos permiten el cultivo de dos tipos de distintos tejidos perfundidos en una membrana porosa elástico (figura 1). Los canales PDMS son fundición utilizando moldes de impresión 3D, que acelera la creación de prototipos de nuevos diseños (figura 2A y 2B). Canales superiores se echan en los moldes por compresión contr...

Aquí, presentamos un protocolo que describe la fabricación de elástico, doble canal, órgano chip microfluídico célula cultura dispositivos Recapitulando a nivel órgano funcionalidad in vitro.

Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

El objetivo general de este protocolo es describir la fabricación de dispositivos microfluídicos astillados de órganos para recapitular la funcionalidad a nivel de órgano in vitro. Este protocolo describe una manera de fabricar dispositivos de organización astillados recapitulando la función a nivel de órgano in vitro. El func, los dispositivos, como estos, en realidad se fabrican utilizando moldes impresos en 3D de una goma de silicio suave.Este caucho nos permite realmente impregnar estos dispositivos con señales mecánicas que nos permite estirar el tejido como se puede entrar digamos un pulmón o un intestino. También añadimos profusión, que imita el flujo sanguíneo y el flujo de otros fluidos corporales dentro de los sistemas de órganos. Ahora, juntos, estos dispositivos nos permiten recrear y tratar de entender la compleja fisiología que sucede in vivo.Pero haz esto in vitro. Así que esencialmente estamos experimentando con humanos, pero no con personas. Y por lo tanto es una manera muy eficaz de salvar la brecha entre los estudios en animales, que siempre se hacen en el desarrollo preclínica de la terapia, y luego antes de los estudios en humanos, que se llaman ensayos clínicos, donde hay un riesgo mucho mayor para el ser humano, para la seguridad humana.Así que estos dispositivos ayudan a salvar la brecha y realmente nos permiten desarrollar nuevas terapias y entender la biología básica que realmente sucede en sistemas complejos como el humano. Preparación del canal superior. Limpie el lado brillante de cada pieza de poliuretano con etanol y toallitas limpias.Coloque el lado brillante del poliuretano sobre el lado abierto del molde en su lugar. Coloque los conjuntos de molde y poliuretano en la plantilla, el lado texturizado contra el extremo de la plantilla. Continúe haciendo esto hasta que todos los moldes se hayan colocado dentro de la plantilla.Apriete la plantilla girando su asa con una llave, hasta que el espaciado de la plantilla sea de 25 milímetros de ancho. Hacer un barco de papel de aluminio que rodea el molde en su lugar plantilla. Vierta PDMS en el pozo de cada molde hasta que esté lleno.Una vez que se llene toda la plantilla, coloque la plantilla en el desecador de vacío. Después de una hora, retirar del desecador. Y colocar en horno centígrado de 60 grados durante al menos cuatro horas.Desmontar la plantilla con una llave inglesa. Retire las tiras de poliuretano de cada molde. Y desechar.Desmoldar cuidadosamente las piezas DE PDMS de sus moldes y ponerlas de lado hacia arriba. Alinee la hoja del rascador de azulejos en la muesca de la pestaña final. Y corte cada extremo para cingular los componentes superiores.Almacene las piezas terminadas en platos cuadrados de Petri. Almacene las piezas en gabinetes de presión positiva a temperatura ambiente. Preparación del canal inferior.Vierta 10,5 gramos de PDMS en el molde. La pistola de aire se puede utilizar muy suavemente para mover el PDMS sobre el espacio. Coloque los moldes en el desecador de vacío.Después de una hora, mueva los moldes a un horno centígrado de nivel 60 grados. Coloque el molde sobre la mesa en una campana de flujo laminar. Afloje el PDMS del borde del molde.Agarre una esquina y despegue suavemente los PDMS de la superficie del molde. Cuando se retire por completo, invierta y acuda en la superficie de trabajo para que las entidades de canal estén boca arriba. Corte a lo largo de los bordes exteriores con cortador de baldosas.Con fórceps de paleta plana, las piezas la puestas se presentan en la cinta para eliminar los desechos. Retire la pieza de la cinta de embalaje. Arrastre el extremo suelto de la pieza a través de la diapositiva.El cabo suelto se laminará con el vidrio. Características de la cubierta con cinta escocesa. Almacene las piezas en gabinetes de presión positiva a temperatura ambiente.Preparación de membranas PDMS. Compruebe que las obleas están libres de PDMS en la parte posterior. Coloque cada oblea de membrana en las ranuras designadas.Utilice la jeringa de un ml para colocar 09 ml de PDMS en el centro de cada matriz de poste de obleas de membrana. Deje que PDMS se siente durante un mínimo de cinco minutos. Permita que PDMS se propague por todo el poste de la oblea de membrana.No continúe con el paso siguiente hasta que al menos el 75% de la matriz de mensajes esté cubierta por PDMS. El plasma trata la tira de policarbonato siguiendo las condiciones descritas en el protocolo. Retire la lámina de policarbonato de la máquina de plasma y utilice tijeras para cortar las láminas de policarbonato en cuadrados de 45 milímetros por 45 milímetros.Coloca el lado tratado con plasma de los cuadrados de policarbonato sobre el PDMS, centrado en la oblea de membrana. Coloque el espaciador PDMS en el centro del cuadrado de policarbonato. A continuación, coloque el policarbonato texturizado precortado.Inserte las bandejas de modo que la bandeja tres esté en la parte posterior, la bandeja dos está en el centro y la bandeja uno está en la parte delantera. La bandeja uno tiene una muesca para la alineación. Abra la válvula de presión de salida y abra muy lentamente la válvula de presión de entrada.Esto es para que los cuatro kilogramos de fuerza se apliquen gradualmente a cada oblea de membrana, a diferencia de instantáneamente que puede romper las obleas. Gire el interruptor AMF para iniciar el ciclo de curado. A continuación, cierre la válvula de presión de entrada y abra las válvulas de presión de salida para liberar la presión de los cilindros de aire.Retire las bandejas y lléelas a la campana de flujo laminar. Pelar cuidadosamente el policarbonato texturizado. Retire con cuidado el espaciador PDMS.Inspeccione la membrana PDMS en busca de áreas con orificios pasantes. Utilice un marcador para trazar el contorno del área de taladro pasante. También marque cualquier agujero o defecto en las membranas.Este es un ejemplo de una membrana sin marcar y marcada. Con pinzas de manipulación de obleas, afloje las obleas de la bandeja. Retire cada membrana de la oblea y colóquela en la placa De Petri.La membrana PDMS se desmoldeará de la oblea y se unirá al respaldo de policarbonato. Almacene las piezas en gabinetes de presión positiva a temperatura ambiente. Montaje y preparación superior.Con cinta escocesa con acabado mate, limpie las membranas PDMS, así como el interior de la placa Petri para eliminar los residuos. Pegue a fondo el lado de la entidad de cada parte superior de cada canal alto para eliminar los desechos. Coloque las tapas en el plato Petri con membrana PDMS.Tenga en cuenta que algunas membranas pueden tomar una o dos partes superiores. Los canales principales de cada parte superior deben caber dentro del área marcada dentro de la membrana. Cargue los platos de Petri en el plasma.Plasma tratar la membrana y la parte superior de acuerdo con el protocolo escrito. Una vez finalizado el ciclo de unión, retire los platos y colóquelos en la membrana. Colocar en horno centígrado de 60 grados durante al menos dos horas.Usando un bisturí, trace alrededor del perímetro de la parte superior unida para separarlo del portador de policarbonato. Una vez trazada la pieza, pele la parte superior del policarbonato. La membrana PDMS que se ha unido a la parte superior debe pelar del portador también.El uso de pinzas elimina la membrana de los puertos que acceden al canal inferior. No deje ninguna parte de la membrana que cubra el puerto de acceso. Además, retire los restos o el polvo con pinzas.Montaje de virutas. Lado de la característica hacia arriba, plasma tratar los conjuntos superiores con los fondos. Bajo un microscopio invertido, alinee el conjunto superior con la mitad inferior.Colocar en horno centígrado de 60 grados durante al menos dos horas. Resultados. El protocolo presentado aquí describe la fabricación escalable de los chips de órganos PDMS. Estos dispositivos permiten el cultivo de dos tipos distintos de tejidos profusos en una membrana porosa elástica.Los canales PDMS se convierten utilizando moldes impresos en 3D, lo que acelera la creación de prototipos de nuevos diseños. Los canales superiores se funden en moldes bajo compresión contra una junta de poliuretano compatible para producir componentes con puertos moldeados. Mientras que los componentes del canal inferior se funden en bandejas y se manejan en el respaldo de la diapositiva del microscopio.Este enfoque de fabricación combina el patrón multiescala de las piezas en un solo paso, lo que ahorra tiempo, mejora la reproducibilidad y la trazabilidad, y reduce los residuos generados por el punzonado por puerto y múltiples pasos de corte. Las membranas porosas son fundamentales para la función del chip de órgano, y el enfoque de fabricación basado en la fundición contra obleas de silicio patrón resulta en membranas de espesor consistente y acabado superficial. La manipulación mediante soportes de policarbonato permite una mayor producción y almacenamiento de lotes.El chip de órgano montado consta de dos canales de profusión en un paquete ópticamente transparente. En la región superpuesta, una membrana porosa PDMS permite la interacción tejido-tejido de metabolitos, proteínas, terapias, patógenos y células para recapitular la función de la viruta del órgano, mientras que dos canales paralelos a ambos lados se utilizan para proporcionar tensión mecánica, utilizando la acción de vacío cíclico. La porosidad de la membrana PDMS apoya biomédricamente el flujo de metabolitos, factores de crecimiento e incluso células entre la vasculatura y el parénquima de órganos.La permeabilidad aparente de la membrana se determinó utilizando la di-concentración en los canales de salida con y sin células intestinales Caco-2. Las capas de células de la viruta intestinal proporcionan una barrera significativamente mayor a la permeabilidad. El chip de órgano se puede accionar utilizando los canales de vacío paralelos para aplicar cuantitativa y reproduciblemente la carga de cepa cíclica a la membrana y, por lo tanto, los tejidos cultivados.Esta cepa cíclica combinada con la profusión de medios apoya la diferenciación celular para imitar mejor la fisiología del órgano in vivo, como la formación de vellosidades en el chip intestinal. Usando el protocolo descrito aquí, ahora debería ser capaz de fabricar un chip de órgano PDMS elástico.

scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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