Name: Preparación de un cultivo de alta calidad primaria celular de peces Pituitaries (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda a preparar cultivos primarios de hipófisis de medaka (Oryzias latipes) con alta viabilidad celular. Este protocolo optimiza temperatura, osmolalidad y pH para estudiar función endocrina y regulación hormonal in vitro.

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Este proyecto fue financiado por la Universidad Noruega de Ciencias de la vida y el Consejo de investigación de Noruega, número de concesión 243811 y 244461 (programa de acuicultura). Agradecemos a Lourdes Carreon Tan en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida para el mantenimiento de las instalaciones de peces.

Los experimentos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por la Universidad Noruega de Ciencias de la vida, las siguientes pautas para el cuidado y bienestar de los animales de investigación.
1. preparación de soluciones
<ol><li>Calibrar los instrumentos de metro osmómetro y pH según las instrucciones del fabricante para asegurar medidas correctas.</li>
	<li>
Preparar 500 mL de Ca2 +- y Mg2 +-libre con tampón fosfato salino de Dulbecco (dPBS), ajustar el pH a 7.75 (paso 1.2.1) y la osmolalidad de 290 mOsm/kg (paso 1.2.2) antes de una filtración estéril (paso 1.2.3).
	<ol>
<li>Ajustar el pH a 7.75 con un medidor de pH calibrado añadiendo con cuidado gotas de una solución de NaOH de 1 M agitando cuidadosamente la solución.</li>
		<li>Medir la osmolalidad de la solución utilizando un osmómetro calibrado y calcular la cantidad de manitol necesario para aumentar la osmolalidad de 290 mOsm/kg. Añada la cantidad necesaria de manitol y luego medir la osmolalidad de la solución para asegurar el ajuste correcto. Nota: La cantidad de manitol necesitada depende de la osmolalidad medida, que generalmente varía entre diferentes lotes. Una molécula de manitol equivale a 1 partícula osmótica.</li>
		<li>Filtro estéril la solución dPBS usando un filtro de 0.2 μm. Nota: La solución puede almacenarse a 4 ° C durante al menos 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 500 mL de medio de cultivo de Leibovitz (L-15) sin L-glutamina y bicarbonato y complementar con 10 mM NaHCO3 (paso 1.3.1), 4,5 mM de glucosa (paso 1.3.2) y glutamina disponibles en el mercado de 2 mM (paso 1.3.3). Ajustar la solución a 290 mOsm/kg (paso 1.3.4), filtro estéril (paso 1.3.5) y añadir 2,5 mL de una solución de penicilina-estreptomicina (paso 1.3.6). Nota: La solución puede conservarse a 4 ° C durante al menos 4 semanas.<ol>
<li>Añadir 420 mg de NaHCO3 por 500 mL de medio de cultivo para lograr una solución de 10 mM.</li>
		<li>Añadir 405 mg de glucosa por cada 500 mL de medio de cultivo para lograr una solución de 4,5 mM.</li>
		<li>Añadir 5 mL de 100 acciones de x de una solución de glutamina en 500 mL de medio de cultivo para lograr una solución de 2 mM. Revolver hasta que los solutos se disuelven.</li>
		<li>Ajustar la solución a 290 mOsm/kg con manitol utilizando un osmómetro (ya que se realiza en el paso 1.2.2).</li>
		<li>Realizar una filtración estéril del medio L-15 usando un filtro μm 0.2.</li>
		<li>Después de la filtración estéril, añadir 2,5 mL de una solución de penicilina-estreptomicina, correspondiente a 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 50 mL de una solución de tripsina utilizando 1 mg/mL (0,1%) tipo de tripsina QUE II-S se disuelve en la dPBS modificado (preparado en el paso 1.2). Hacer alícuotas de 2 mL en tubos de plástico estériles y almacenarlos a-20 ° C hasta su uso. Nota: Partes alícuotas de 2 mL pueden almacenarse a-20 ° C durante al menos 3 meses.</li>
	<li>Preparar 50 mL de una solución de inhibidor de tripsina utilizando 1 mg/mL (0,1%) tripsina inhibidor tipo I-S y complementar con 2 μg/mL de DNasa disuelto en la dPBS modificado (preparado en el paso 1.2). Hacer alícuotas de 2 mL en tubos de plástico estériles y almacenarlos a-20 ° C hasta su uso. Nota: Partes alícuotas de 2 mL pueden almacenarse a-20 ° C durante al menos 3 meses.</li>
</ol>2. preparación de equipos
<ol><li>Pipetas de vidrio para preparar fuego pulido la punta para la disociación celular. Hacer sugerencias con 2 categorías de diverso tamaño (una abertura media de 0,6 – 0,8 μm y una pequeña abertura de 0,4 – 0,6 μm) jugando con el tiempo y la distancia de la llama mientras al mismo tiempo gira la pipeta. Colocar las pipetas de vidrio en un recipiente limpio de vidrio y autoclave (usando el modo sólido a 105 ° C por 45 min).</li>
	<li>Preparar una caja de poliestireno con hielo.</li>
	<li>Preparar un tubo de plástico con 1,5 mL de dPBS modificado (preparado en el paso 1.2) para transferir los pituitaries a durante la disección y mantenerlo en hielo.</li>
	<li>Preparar un tubo de 15 mL con 10 mL de dPBS modificado (preparado en el paso 1.2) y mantener en hielo hasta la disociación celular.</li>
	<li>Preparar frescos o descongelar las alícuotas de la tripsina y soluciones de inhibidor de tripsina (preparadas en pasos 1.4 y 1.5) y mantenerse en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Establecer el baño de agua a 26 ° C antes de iniciar la disección para permitir que el agua alcance la temperatura deseada antes de la disociación química de los pituitaries.</li>
	<li>Limpie todas las herramientas de disección con etanol al 70% antes, durante y después del uso, incluyendo Pinzas finas para utilizar para que la disección y agujas finas y una placa de cera para los peces. Usar guantes limpios (cambiar y limpiar con frecuencia) durante todo el procedimiento para evitar una posible contaminación de las células.</li>
</ol>3. pituitaria disección y disociación celular
<ol><li>Eutanasia el pescado sumergiéndolo en hielo molido (0 ° C). Dejar el pescado en hielo molido para al menos 1 minuto para un choque hipotérmico irreversible. Nota: Pérdida de equilibrio y la inmovilización se producirá después de unos segundos. Asegúrese de que el pescado esté totalmente sumergido en el agua con hielo y no mentir sobre el hielo, este último dará lugar a la asfixia y quemaduras de piel potenciales en lugar de un choque hipotérmico rápido y protectora de animales.</li>
	<li>Rápida transferencia de los peces en una red para una placa de cera bajo el microscopio de disección y destruir la espina dorsal por un golpe de la aguja a través del cuello.</li>
	<li>Perno de la cabeza de los peces a la placa de cera con agujas finas, insertando una aguja en la parte delantera (en la boca) y uno a cada lado de la cabeza (detrás del cerebro) para estabilizar la cabeza antes de la disección.</li>
	<li>Ver los peces bajo el microscopio de disección y Raspe suavemente las escamas en la parte superior de la cabeza con unas pinzas finas con una punta en ángulo.</li>
	<li>Cuidadosamente insertar la punta en ángulo de las pinzas finas debajo de la piel por el lado de la cabeza y quitar el techo del cráneo moviendo lentamente el fórceps en la dirección de la boca, mientras mantiene un agarre firme a las pinzas que encierra el techo del cráneo.</li>
	<li>Cortar la médula espinal completamente con unas pinzas con la punta en una ángulo. Nota: El tiempo es un factor importante, así que trabajar eficientemente y con precisión limitar el tiempo pasado de la disección de los pituitaries hasta que las células se platean en el plato. Después de alguna práctica, disección hipofisaria debe tomar alrededor de 2 a 3 minutos por peces, de los cuales sólo alrededor de 10 s se necesitan para la pituitaria cuando el cerebro ya está expuesto.</li>
	<li>Cuidadosamente voltee el cerebro a la boca para exponer la glándula pituitaria y diseccionar con pinzas limpias con una punta recta. Transferencia de la glándula pituitaria a un tubo plástico que contiene 1,5 mL modificado dPBS (para más detalles, consulte el paso 2.3) colocados en hielo. Compruebe la punta de las pinzas bajo el microscopio para asegurarse de que la hipófisis se agrega correctamente al tubo y nada queda en el fórceps. Nota: Disecar pituitaries tantas como sea necesario, dependiendo del número de platos de la cultura que van a ser preparados al mismo tiempo. Como regla general, calcular por lo menos 10 pituitaries de peces adultos por plato para tener una densidad adecuada de las células (que depende de la aplicación aguas abajo).</li>
	<li>Desactivación de los pituitaries en una centrífuga de mesa para 1 – 2 s a temperatura ambiente. Cuidadosamente Quite la dPBS utilizando una pipeta de vidrio y evitar retirar cualquier pituitaries.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la solución de tripsina (preparada en el paso 1.4) para lavar los pituitaries, los hace girar hacia abajo en una centrífuga de mesa para 1 – 2 s y eliminar la mayor parte del líquido con una pipeta de vidrio antes de agregar un 1 mL adicional de solución de tripsina.</li>
	<li>Incubar el tubo en un baño de agua a 26 ° C durante 30 minutos, preferiblemente con agitación suave, o alternativamente, mueva el tubo un par de veces durante el período de incubación.</li>
	<li>Desactivación de los pituitaries en una centrífuga de mesa para 1 – 2 s a temperatura ambiente y asegúrese de que pituitaries todos se encuentran en la parte inferior del tubo. Eliminar la mayor parte de la solución de tripsina con una pipeta de vidrio y añada 1 mL de la solución de inhibidor de tripsina (preparada en el paso 1.5) para inactivar la tripsina y lavar los pituitaries.</li>
	<li>Recoger los pituitaries en la parte inferior del tubo haciendo girarlos abajo en una centrífuga de mesa para 1 – 2 s a temperatura ambiente. Eliminar la mayor parte del líquido con una pipeta de vidrio y añada 1 mL de la solución de inhibidor de tripsina (preparada en el paso 1.5). Coloque el tubo en un baño de agua a 26 ° C durante 20 minutos, preferiblemente con agitación suave, o alternativamente, mueva el tubo un par de veces durante el período de incubación para inactivar la tripsina.</li>
	<li>Preparar una placa de cultivo celular poly-d-lisina-revestida de 35 mm con fondo de vidrio central agregando 2 mL de medio de L-15 y dejar incubar durante al menos 10 minutos a 26 ° C y con 1% de CO2 por lo que puede llegar a la temperatura y el pH antes de platear las células. Nota: Una placa de cultivo de células de plástico también puede ser utilizada. La principal ventaja de usar un plato con fondo de vidrio centralizado es que el área donde se platean las células es menor, y por lo tanto, menos las células pituitarias son necesarias por plato. Algunas aplicaciones posteriores pueden requerir también un fondo de cristal (es decir, algunas técnicas de imagen).</li>
	<li>Establecer la centrifugadora de enfriamiento de los tubos de 15 mL a 4 ° C permite alcanzar la temperatura deseada antes de iniciar la disociación mecánica.</li>
	<li>Recoger los pituitaries en la parte inferior del tubo de giro hacia abajo el tubo con la solución de inhibidor de tripsina (de paso 3.11) en una centrífuga de mesa para 1 – 2 s a temperatura ambiente y asegúrese de que pituitaries todos se encuentran en la parte inferior del tubo antes de cuidadosamente extracción de la mayor parte de la solución de inhibidor de tripsina utilizando una pipeta de vidrio. Nota: Realice todos los pasos del protocolo en un banco de flujo laminar (LAF) certificados para que el trabajo de la célula evitar la contaminación de las células.</li>
	<li>Añadir 1 mL de dPBS modificadas helados (preparado en el paso 2.4) a las piezas de tejido pituitario y aspirar suavemente las piezas de tejido arriba y abajo (6 – 7 x) en una pipeta de vidrio pulidas a fuego (preparada en el paso 2.1). Nota: La temperatura es un aspecto esencial, así que mantenga todas las soluciones a 4 º C. Partir de este momento, realizar todos los pasos en el hielo siempre que sea posible.</li>
	<li>Desactivación de las piezas de tejido en una centrífuga de mesa para 1 – 2 s a temperatura ambiente y transferir cuidadosamente la parte superior de la dPBS que contiene las células disociadas (casi 1 mL) a un nuevo tubo de 15 mL a hielo. Evite mover la pipeta hacia la parte inferior del tubo donde se dejan los pedazos de tejido.</li>
	<li>Repita el paso 3.16, 3.17, disociar las células en 1 mL de dPBS helada a la vez, hasta los 10 mL de dPBS. Comenzar a usar una pipeta de vidrio con una abertura de tamaño mediano y a una pipeta de vidrio con una abertura más pequeña hacia el final (para el último 3 – 4 mL de dPBS añadido) de la disociación. Si hay pedazos de tejido todavía visible hacia el final del procedimiento de disociación, aumentar el pipeteo de aproximadamente 10 x hacia los 2 últimos pasos de dPBS de disociación y finalmente dejar las piezas de tejido residual. Resuspender suavemente las células y evitar la creación de burbujas ya que puede causar daño celular cuando las células se unen a la superficie de las burbujas. Nota: Este es un paso crítico de este protocolo y requiere algo de entrenamiento para lograr un buen resultado.</li>
	<li>Equilibrar el tubo en la centrífuga (previamente enfriado a 4 ° C) y rotación de las células a 200 x g durante 10 min a 4 ° C. Asegúrese de marcar el lado del tubo donde va a ser el precipitado de células.</li>
	<li>Retire con cuidado el tubo de la centrífuga y suavemente transferir el sobrenadante con una pipeta de vidrio de un tubo de plástico vacía 15 mL directamente después de la centrifugación. Asegúrese de eliminar la mayor parte del sobrenadante, pero tenga cuidado de no perder el precipitado de células (a menudo invisible) pequeño.</li>
	<li>Con cuidado Resuspender el precipitado de células en 50 – 100 μl de medio de cultivo L-15. Nota: En este paso, es posible contar las células o realizar una prueba de viabilidad (por ejemplo, una celda de conteo en presencia de azul de tripano usando un hemocitómetro), pero ten cuidado que utilizando una parte de la suspensión celular para ello bajará el rendimiento. Evitar el uso de un volumen de suspensión grande como aumentará el riesgo de las células difunde fuera del centro del plato.</li>
	<li>Goteo con cuidado las células disociadas en el centro de la placa de cultivo celular que contiene 2 mL del medio L-15 (preparado en el paso 3.13). Permitir que las células se hunda hasta el fondo del plato durante aproximadamente 5 minutos antes de pasar a la incubadora, para evitar que las células de extensión fuera de la parte hundida de la parte inferior de cristal.</li>
	<li>Incubar la placa a 26 ° C y 1% de CO2 para permitir que todas las células hundirse completamente y colocar en el fondo del plato.</li>
	<li>Después de 30 minutos, mirar las células en el microscopio para asegurarse de que han unido a la placa de cultivo.</li>
	<li>Seguir a incubar las células en 26 ° C y 1% de CO2.</li>
	<li>Cuidadosamente cambiar la mayoría de (pero no todos) el medio cada 3-4 días. Nota: Evite cambiar el medio con mayor frecuencia, ya que puede alterar las células y hacerlos despegar de la parte inferior de cristal. Utilizar las células para los experimentos dentro de una semana después de la siembra les.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Sistemas de cultivo in vitro de la célula proporcionan potentes herramientas para los investigadores responder a una plétora de diferentes cuestiones biológicas si se utiliza en la forma correcta1. Es importante recordar que las células disociadas que han perdido sus conexiones con las células vecinas pueden han obtenido diferentes propiedades funcionales que originalmente tenían en vivo. Para evitar riesgo de malinterpretando los resultados obtenidos en experimentos en vitro...

Cultivo de células es uno de los principales instrumentos utilizados en la investigación biológica molecular, proporciona un sistema modelo excelente para responder a diferentes cuestiones biológicas que van desde la fisiología celular normal a drogas proyección y carcinogénesis1. Células primarias, aisladas de los tejidos animales mediante métodos enzimáticos o mecánicos, a menudo se consideran biológicamente más relevantes que las líneas celulares como la respuesta biológica puede estar más cerca de la situación en vivo . Protocolos para la preparación de cultivos celulares primarios deben ser optimizados para cada tipo de célula y especies de interés para imitar las características para que una célula se adapta y obtener resultado fisiológico significativo.
Numerosos protocolos describen las condiciones de cultivo para los sistemas de células de mamífero, mientras que protocolos similares que describen las condiciones de cultivo primario de células de peces son bastante escasos en comparación. Las células son vulnerables a cambios rápidos de temperatura, el pH y la osmolalidad y son particularmente frágiles durante el procedimiento de disociación. Soluciones de sal comerciales y medios de cultivo utilizados para los cultivos de células de mamífero no son óptimos para los peces teleósteos, especialmente en términos de sistemas tampón de pH y la osmolalidad. Por lo tanto, es importante medir y ajustar las soluciones a niveles fisiológicamente relevantes de estos parámetros en las especies de interés.
Se hicieron cultivos hipofisarios primarios de varias especies de peces teleósteos, como la carpa común (carpio de Cyprinus)2,3, hierba (Ctenopharyngodon idella)4, goldfish (Carassius auratus dela carpa )5, trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)6,7de anguila europea (Anguilla anguilla), tilapia (Oreochromis mossambicus)8, pez cebra (Danio rerio)9, y Bacalao Atlántico (Gadus morhua)10. Aparte de ajustar la temperatura de incubación para las especies de interés, varios de estos protocolos incuban las células en condiciones similares a mamíferos que pueden ser subóptimas para la especie de interés, con un pH de 7.2 a 7.5 en un ambiente humidificado que contiene 3-5% CO2. Además, es confuso si la osmolalidad de las soluciones utilizadas para la preparación de varios de estos cultivos celulares primarios de células se ajustaron y estable entre diferentes soluciones.
El actual protocolo se basa en trabajos previos con cultivos primarios de bacalao del Atlántico10 y cuenta con ajustes de temperatura de incubación, osmolalidad, pH y sistemas buffer de pH, incluyendo la presión parcial de dióxido de carbono (pCO2), a la fisiología de medaka (o. latipes). Medaka es pequeña (3 – 4 cm) pez de agua dulce, nativo de Asia oriental. Estos días, se utiliza como una especie de modelo en muchos laboratorios de investigación alrededor del mundo, ya que es relativamente fácil de criar y muy resistente a muchos comunes peces enfermedades11. Hay varias ventajas de utilizar medaka como un modelo, incluyendo una tolerancia a la temperatura de 4 – 40 ° C11, un tiempo de generación corto, embriones transparentes, una determinación de sexo genética12y un genoma secuenciado13, así como muchos otros recursos genéticos disponibles.
Las condiciones de cultivo primario en este protocolo están optimizadas para que coincida con la temperatura de 26 ° C que medakas se mantienen en el fondo de pescado. Además, la osmolalidad es reducida de 320 mOsm/kg de bacalao del Atlántico viven en agua salada a 290 mOsm/kg para medaka viven en agua dulce y está de acuerdo con la osmolalidad normal del plasma de medaka14. En comparación, el típico osmolalidad del plasma mamífero está en el rango de 275 a 295 mOsm15. Vive en una gran variedad de temperaturas los peces y tienen branquias que están en contacto directo con agua, lo que la capacidad tampón y pH de la sangre y el líquido extracelular en peces diferentes de los de mamíferos. Medios de cultivo de mamíferos suelen incluir sistemas de tampón que se producir en un pH de aproximadamente 7.4 los medios de comunicación están equilibrados para una atmósfera estándar de 5% CO2 en aire humidificado a 37 ° C. El pH es dependiente de la temperatura y el valor de pH neutro (en agua) aumenta con una disminución de la temperatura16. PH del plasma de peces teleósteos típico oscila entre 7.7 y 7.917. La optimización de este protocolo incluye una reducción de pH 7.85 bacalao mantenido a 12 º C a pH 7.75 medaka mantenida a 26 ° C al aumentar el CO2 de 0,5% a 1%.
Además, la capacidad de buffer de bicarbonato es muy diferente en los peces y mamíferos. CO2 se intercambian fácilmente por las branquias en los peces y la pCO2 en agua es sólo una pequeña fracción de la pCO2 en el pulmón18. Cambio de la temperatura o la pCO2 va a cambiar el pH y el tampón del medio. En consecuencia, ni el pH ni la pCO2 se recomienda para la incubación de células de mamíferos es óptimo para las células de los peces, y por lo tanto, los medios de cultivo debe ser optimizado con sistemas buffer que contiene los valores fisiológicamente relevantes para los peces y la especie particular de interés. Este protocolo describe cómo preparar cultivos celulares primarios de células de pituitaries medaka e incluir ajustes de la incubación temperatura, osmolaridad, pH y pH buffer sistema, además de otros parámetros importantes a considerar cuando se prepara la célula primaria cultivos de especies no mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (dPBS), sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>D8537</td><td>Ajuste la solución a un pH 7,75 con 1M de NaOH y 290 mOsm con manitol.</td></tr><tr><td>Medio L-15 (Leibovitz), sin L-glutamina</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>L5520</td><td>Suplemento 500 ml de medio de cultivo con 10 mM de NaHCO3, 4,5 mM de glucosa, 2 mM de Glutamax. Ajuste la solución a 290 mOsm con manitol y filtre la solución a través de un 0.2 &micro; m Filtro estéril de PES, antes de añadir 2,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina (ver más abajo para más detalles).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>S5881</td><td>Agregue gotas de solución 1 M para aumentar el pH de dPBS y el medio de cultivo a 7.75.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO3 equivale a 420 mg por medio de cultivo de 500 mL.</td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>63565</td><td>Uso para aumentar la osmolalidad del dPBS y el medio de cultivo. Calcule la cantidad correcta necesaria para alcanzar una osmolalidad de 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&nbsp; La D-glucosa equivale a 405 mg por 500 mL de medio de cultivo.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, Reino Unido)</td><td>35050-061</td><td>Alternativa a la L-glutamina, con mayor estabilidad. 2 mM de Glutamax equivalen a 5 ml de caldo 100x en medio de cultivo de 500 mL.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>P0781</td><td>Solución madre 10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina por ml. Utilice 2,5 mL de solución madre en medio L-15 de 500 mL (equivalente a 50 U/mL de penicilina y 50 & micro; g/mL de estreptomicina).</td></tr><tr><td>Tripsina tipo II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>T7409</td><td>Prepare 1 mg/mL en solución de dPBS.</td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina tipo I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>T6522</td><td>Preparar 1 mg/mL en solución de dPBS, complementar con 2 &micro; g/ml de Dnase I (ver detalles a continuación).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemania)</td><td>D5025</td><td>Uso en solución de inhibidor de tripsina (ver arriba).</td></tr><tr><td>0,2 y micro; m Sistema de filtro estéril de polietersulfona (PES)</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Uso para la filtración estéril de dPBS y medio L-15 después de los ajustes.</td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular de 35 mm con fondo de vidrio, recubierto de poli d-lisina</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>También se puede reemplazar por un plato de plástico, dependiendo de la aplicación posterior.</td></tr><tr><td>Pinzas finas Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Pinzas</td></tr><tr><td>finas Dumont #5/45 de punta recta</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Punta angulada de 45 grados</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokio, Japón)</td><td></td><td>Uso para la disección de hipófisis.</td></tr><tr><td>Centrufuga Alegra X-22R Beckman</td><td>Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>Con opción de refrigeración (similar al modelo actual XR-30).</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Techne (Staffordshire, Reino Unido)</td><td></td><td>Cualquier baño de agua con la posibilidad de ajustar la temperatura servirá.</td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio Pasteur</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Diámetro exterior 1,6 mm, pulido al fuego y autoclave antes de su uso.</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa Galaxy MiniStar</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Cualquier centrífuga de mesa pequeña servirá.</td></tr><tr><td>Agujas finas/alfileres para insectos</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diámetro 0,03 mm. En su lugar, se pueden utilizar otras agujas finas.</td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de cera <td>Hecho a medida agregando cera de parafina derretida en una placa de Petri grande.</td></tr></tbody></table>

preparación de un cultivo de alta calidad primaria celular de peces pituitaries

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Cultivo celular primario es una potente herramienta comúnmente utilizada por los científicos para estudiar propiedades celulares y mecanismos de las células aisladas en un entorno controlado. A pesar de grandes diferencias en la fisiología entre mamíferos y peces, protocolos de cultura de célula primaria del pescado se basan a menudo en condiciones de cultivo mamíferos, a menudo con sólo pequeñas modificaciones. Las diferencias ambientales afectan no sólo la temperatura corporal, sino también parámetros de suero de sangre como la osmolalidad, pH y capacidad amortiguadora de pH. Como medios de cultivo celular y similares soluciones de trabajo están pensadas para mímico las características del líquido extracelular y/o suero de la sangre a la que una célula se adapta, es crucial que estos parámetros se ajustan específicamente al animal en cuestión.
El protocolo actual describe las condiciones optimizadas en cultivo primario de medaka (Oryzias latipes). El protocolo proporciona pasos detallados sobre cómo aislar y mantener saludable disociaron las células pituitarias durante más de una semana e incluye los siguientes pasos: 1. la regulación de la osmolalidad a los valores encontrados en el plasma sanguíneo de medaka, 2. el ajuste de la temperatura de incubación a temperatura de medaka normal (aquí en las instalaciones de acuario) y 3. el ajuste del buffer de pH y bicarbonato a valores comparables a otras especies de peces que viven a temperaturas similares. Los resultados presentados utilizando el protocolo descrito promoción resultados fisiológicamente significativas de medaka y pueden ser utilizados como una guía de referencia por los científicos hacer cultivos celulares primarios de células de otras especies de animales no mamíferos.

Este protocolo describe la preparación de una cultura de célula primaria de pituitaries medaka y proporciona a las células sanas que se pueden mantener en una cultura de por lo menos una semana. El protocolo se basa en valores fisiológicos relevantes para medaka14 y además está optimizado para el tejido hipofisario en peces adultos, con un pH de 7.75 y una osmolalidad de 290 mOsm/kg durante todo el procedimiento de la recolección de tejido para el plateado células ...

Aquí se describe un protocolo para preparar y mantener cultivos primarios de células hipofisarias de medaka (Oryzias latipes). Las condiciones optimizadas en este protocolo consideren parámetros importantes como la temperatura, osmolaridad y pH imitando las condiciones fisiológicas de los peces, permitiendo resultados fisiológico más significativos.

Preparación de un cultivo de alta calidad primaria celular de peces Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la endocrinología sobre cómo funcionan e interactúan las células pituitarias en un entorno controlado. Las principales ventajas de esta técnica son que promueve resultados fisiológicamente significativos para medaka y proporciona una guía de referencia para hacer cultivos celulares primarios de otras especies. Comience asegurando la cabeza del medaka a la placa de cera con una aguja fina insertada sobre la boca y una a cada lado de la cabeza detrás del cerebro.Coloque el pez bajo un microscopio de disección y use pinzas finas con una punta en ángulo para raspar suavemente las escamas de la parte superior de la cabeza. Inserte con cuidado las pinzas debajo de la piel del costado de la cabeza y mueva lentamente las pinzas hacia la boca para quitar el techo del cráneo. Corte la médula espinal por completo con las pinzas y voltee cuidadosamente el cerebro hacia la boca para exponer la hipófisis.Extraiga la glándula con pinzas limpias con punta recta en un tubo de plástico que contenga 1,5 mililitros de DPBS modificado en hielo. Cuando se hayan recogido todas las pituitarias, centrifugar los tejidos con una microcentrífuga durante uno o dos segundos a temperatura ambiente y utilice una pipeta de vidrio para retirar cuidadosamente el DPBS, teniendo cuidado de no alterar la pastilla pituitaria. Lave el tejido con un mililitro de solución de tripsina durante uno o dos segundos más en la microcentrífuga y utilice la pipeta de vidrio para aspirar la mayor parte del sobrenadante.Cuando se haya eliminado toda la tripsina, agregue otro mililitro de tripsina a la muestra e incube el tejido en un baño de agua a 26 grados centígrados durante 30 minutos con movimientos suaves ocasionales. Al final de la incubación, centrifugar las hipófisis durante uno o dos segundos y utilizar una pipeta de vidrio para eliminar la mayor parte de la tripsina sin alterar el tejido. Luego, lave la muestra con un mililitro de solución de inhibidor de tripsina para inactivar la tripsina y centrifugar durante uno o dos segundos.Después de retirar el sobrenadante, agregue otro mililitro de solución inhibidora de tripsina al tubo e incube la muestra en un baño de agua a 26 grados centígrados durante 20 minutos con agitación. Mientras se incuba el tejido, agregue dos mililitros de medio L-15 a una placa de cultivo celular codificada con poli-D-lisina de 35 milímetros con un fondo de vidrio central y equilibre la placa a 26 grados Celsius y 1% de dióxido de carbono durante al menos 10 minutos. Al final de la incubación, centrifuga las hipófisis durante uno o dos segundos y aspira cuidadosamente toda la solución inhibidora de tripsina del tubo.En una campana de flujo laminar, agregue un mililitro de DPBS modificado con hielo a las piezas de tejido pituitario y use una pipeta de vidrio pulido al fuego para triturar suavemente los tejidos de seis a siete veces en hielo, teniendo cuidado de evitar burbujas. Después de otra centrifugación de uno a dos segundos, transfiera suavemente aproximadamente un mililitro de la celda disociada que contiene la capa superior de DPBS a un nuevo tubo de 15 mililitros en hielo. Repita la trituración y la recolección de células disociadas nueve veces más hasta que se hayan utilizado los 10 mililitros de DPBS, comenzando con la punta de pipeta con una abertura de tamaño mediano y cambiando a una punta de pipeta con la abertura más pequeña para los últimos tres o cuatro mililitros de DPBS.La disociación mecánica con una pipeta de vidrio es un paso crítico de este protocolo y requiere cierto entrenamiento para lograr un buen resultado. Pipetee la solución celular suavemente para evitar dañar las frágiles células disociadas. Después de la 10ª trituración, marque el lado de cada tubo donde estará el pellet y centrifuga la muestra en una centrífuga preenfriada.Al final de la centrifugación, retire con cuidado el tubo de la centrífuga y use una pipeta de vidrio para transferir inmediata pero suavemente el sobrenadante a un tubo de plástico de 15 mililitros, teniendo cuidado de eliminar la mayor parte del sobrenadante sin alterar el gránulo pequeño, frecuentemente invisible, luego vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en 50 a 100 microlitros de medio de cultivo L-15. Gotee con cuidado las células disociadas en el centro de la placa de cultivo celular previamente preparada y deje que las células se hundan hasta el fondo de la placa durante aproximadamente cinco minutos antes de mover la placa a la incubadora para evitar que las células se extiendan fuera del área hundida del fondo de vidrio. Después de 30 minutos a 26 grados centígrados y 1% de dióxido de carbono, revise las células mediante microscopía óptica para confirmar que se han adherido al fondo de la placa y devuelva el cultivo de células pituitarias disociadas a la incubadora durante no más de siete días.La cosecha de alrededor de 10 pituitarias medaka adultas generalmente da como resultado una densidad de alrededor de 50,000 a 100,000 células por plato después de la siembra. El número de células moribundas es casi constante a lo largo del tiempo, con más del 95% de las células viables después de un día y más del 90% aún vivas después de tres días, con una pequeña disminución de la viabilidad observada a la semana de cultivo. Los registros electrofisiológicos de las células gonadotrópicas de la hormona luteinizante GFP demuestran que las células pituitarias disociadas son capaces de disparar potenciales de acción espontáneamente después de cuatro días en cultivo.Además, tras la estimulación de la hormona liberadora de gonadotropina, una hiperpolarización transitoria inicial de la membrana celular es seguida por un aumento dramático en la frecuencia de disparo que es concomitante con la despolarización y una mayor duración de los potenciales de acción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar de manera precisa y eficiente para mantener las células pituitarias en un estado saludable. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la qPCR o técnicas de imagen avanzadas para responder preguntas adicionales sobre cómo los tratamientos específicos pueden alterar la fisiología de las células pituitarias.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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