Name: Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Aprende a medir el flujo de calcio de alto rendimiento en células HEK 293 para estudiar la actividad de receptores NMDA y evaluar moduladores moleculares. Este método facilita el desarrollo de tratamientos para enfermedades neurológicas.

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Los autores desean dar las gracias a la oficina del programa de Post bachillerato académicos e institutos de Novartis para la investigación biomédica en su conjunto para la financiación de este estudio.

1. preparación de las células
Nota: Este protocolo, incluyendo la generación de datos, utiliza las células HEK293 transduced con un baculovirus codificación NR1 y NR2A las células.
<ol><li>Semillas el número apropiado de células HEK293 y añada el virus NR1 y NR2A las concentraciones finales apropiadas (1.00 μl cada una). Para una placa de 384 pozos, utilice 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μl.</li>
	<li>Como alternativa, las células HEK293-NR1-NR2A en el número de células adecuado y el volumen (para una placa de 384 pozos, uso 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μL) de la semilla. Añadir tetraciclina en una concentración de 2 μg/mL inducen la expresión de NR2A y agregar la protección compuesta (100 μm MDL105, 519 o 5 μm CGP07066724).</li>
	<li>Nota: El baculovirus codificación NR1 y N2 deben tener un título aproximado entre 5 x 109 - 10 x 109 infecciosas unidad por mililitro24.</li>
</ol>2. medición de la actividad del receptor de NMDA
<ol><li>Preparar una placa de 384 pocillos con células HEK293 transduced con células HEK293-NR1-NR2A NR1/N2 en presencia de cualquier compuesto de protección. Utilice un fondo claro, marco negro, placa revestida poly-D-lisina. Nota: Protección con 100 μm MDL105, 519 se utiliza para conferir sensibilidad a glicina, mientras que 5 μm CGP070667 se utiliza para conferir sensibilidad al glutamato.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO2 para 16 horas (noche).</li>
	<li>Retire la placa de la incubadora y deseche suavemente los medios de comunicación celular, retardando la placa de los bancos sobre un contenedor de residuos biológicos compatibles. Golpear suavemente la placa sobre papel absorbente para limpiar los medios de comunicación fuera de los bordes de la placa y drenar cualquier medio restante.</li>
	<li>Para preparar el tinte calcium6 solubilización de un frasco de tintura de calcium6 (1 tamaño de la placa) en 10 mL de tampón de incubación (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, probenecid 1 mM). Incube la placa durante 2 horas a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Retire la placa de la incubadora y dejar que las células a ajustar a la temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Verter suavemente el tinte de calcium6 como se describe en el paso 2.3 y añadir 30 μl de tampón de ensayo (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, probenecid 1 mM).</li>
	<li>Repita el paso 2.6 dos veces para un total de 3 lavados. Dejar 30 μl de tampón de ensayo en las células después del último lavado.</li>
	<li>Que las células reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la placa de ligando, haciendo un caldo 4 veces de 400 μm glicina y el glutamato 400 μm (concentración final de 100 μm, concentración óptima de ligandos que se determinará como se describe a continuación). Transferencia de un mínimo de 25 μl del stock de ligando en una placa de 384 pocillos V-inferior.</li>
	<li>Cargue la placa celular y placa de ligando en la FDSS (sistema de detección de drogas funcional).</li>
	<li>Medir la fluorescencia basal (Fo) de la placa celular durante 30 segundos. Transferir 10 μl de la acción del ligando en la placa de la célula usando la función dispensadora FDSS y mida el flujo de calcio mediante el registro de fluorescencia calcium6-colorante durante 5 minutos.</li>
	<li>Calcular el cociente de la fluorescencia máxima dividiendo la fluorescencia máxima obtenida por la fluorescencia basal (Fmáx/fo).</li>
</ol>3. optimización de los niveles de expresión de NMDAR
<ol><li>Para determinar la cantidad óptima de baculovirus para utilizar, realizar una titulación de virus NR1 y NR2A. Prepare una placa de 384 pocillos con células HEK293 (recomendación de 10.000 células/pozo, 30 μl de medios de comunicación) e incluyen los compuestos de protección tal como se describe en el paso 2.1.</li>
	<li>Añadir cantidades variables del virus NR1 en filas diferentes de la placa (por ejemplo: agregar 0 μL 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0.25 μL en filas A-E, respectivamente). Agregar duplicados para la exactitud de los datos.</li>
	<li>Añadir cantidades variables del virus NR2A en diferentes columnas de la placa (por ejemplo: agregar 0 μL 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0.25 μL en filas A-E, respectivamente). Agregar duplicados para la exactitud de los datos.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO2 para 16 horas (noche).</li>
	<li>Determinar la relación óptima y la cantidad de los virus de NR1/NR2A realizando una medición del flujo de calcio en la FDSS (véase arriba).</li>
</ol>4. ligando titulación
<ol><li>Preparar las células como se describe en el paso 2.3.</li>
	<li>Preparar diluciones de cada ligando en presencia de concentraciones (100 μm) se satura de otro ligando como una solución madre 4 veces. Por ejemplo: para una concentración de prueba final de 10 μm de glicina, prepare una solución stock de 40 μm de glicina como 400 μm glutamato.</li>
	<li>Proceder con la medición de la FDSS como se describe en el paso 2.11.</li>
</ol>5. compuesto de prueba
<ol><li>Preparar las células como se describe en el paso 1.</li>
	<li>Preparar la placa de ligando con una 5-fold acción de la concentración de ligando final en el tampón de ensayo.</li>
	<li>Preparar la placa de compuestos con el caldo 4 veces de la concentración final deseada de compuestos en el tampón de ensayo. Para una concentración final compuesta de 10 μm en el tampón de ensayo, preparar una solución stock de 40 μm.<ol>
<li>Mantener la concentración de dimetilsulfóxido (DMSO) constante a través de todas las muestras mediante la preparación de una dilución previa del compuesto en DMSO antes de la mayor dilución en el tampón de ensayo.</li>
		<li>Para una respuesta a la dosis del compuesto en el ensayo final que oscila entre 3 y 30 μm, preparar una dilución previa del compuesto en DMSO que van desde 1 mm a 10 mM. Diluir en el tampón de ensayo a la concentración de acción 4 veces. La concentración final del DMSO no debe exceder 0.5%. Nota: Es aconsejable probar cada muestra en triplicado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cargue la placa celular, ligando y compuesto en FDSS.</li>
	<li>Medir la fluorescencia basal durante 30 segundos.</li>
	<li>Añadir 10 μl de caldo compuesto y medir la fluorescencia durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir 10 μl del stock de ligando y medir la fluorescencia durante 5 minutos.</li>
	<li>Determinar la integral de la relación de fluorescencia calculando el área bajo la curva de los cocientes fluorescentes durante los últimos 5 minutos de la medida. Nota: Alternativamente, el cociente máximo de fluorescencia después de la adición de ligandos puede utilizarse para el análisis.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores tienen ningún conflicto de intereses y nada que revelar.

El éxito de este ensayo depende en gran medida la salud de las células HEK. Las células que experimentan un crecimiento exponencial y con número de paso bajo se debe utilizar. Este análisis implica a muchos traslados y adiciones de soluciones, así que con cuidado asegurarán una mayor precisión en sus resultados. Concentraciones de compuestos y otros reactivos deben ser también revisado en cruz para minimizar los errores. Al sustituir los medios de comunicación de la célula con el tampón de ensayo para el análisis del flu...

Con los avances actuales en la medicina, la esperanza de vida ha aumentado significativamente; sin embargo, tiene tan la prevalencia de enfermedades relacionadas con la edad. Enfermedades del sistema nervioso central (SNC) tales como esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, entre otros, no son la excepción y se han proyectado para aumentar durante el próximo decenio1, 2 , 3. el mal funcionamiento de receptores de glutamato ionotrópicos conocido como receptores N-metil-D-Aspartato (NMDAR) se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, diabetes y glaucoma entre otros, que garantiza la necesidad de estudiar su biología para el desarrollo de terapias eficaces, modificadores de la enfermedad4,5,6,7.
NMDARs se componen de cuatro monómeros o subunidades4,8,9. La composición estructural de lo NMDAR muestra variabilidad regional y de desarrollo en el cerebro de7,10. NMDARs están implicados en la plasticidad sináptica, la cognición y la generación de los ritmos de respiración y locomoción11,12,13. Como un canal voltaje-bloqueado, es en gran parte no conductoras en el potencial de membrana de reposo (-70 mV) y es bloqueado por magnesio para evitar la penetración de los iones. El canal es activado por la Unión de dos ligandos, glutamato y glicina/D-serina y una simultánea despolarización en la membrana sináptica mediada por receptores AMPA, otra subclase de receptores de glutamato ionotrópicos. La despolarización elimina el bloqueo de magnesio de NMDAR, permitiendo la afluencia de cationes, particularmente calcio14,15,16. A pesar de que la activación de NMDAR es esencial para la supervivencia de la célula, activación excesiva puede conducir a la célula muerte17,18,19 por excitotoxicidad. Esto, además de la compleja naturaleza de los receptores, hace difícil realizar estudios necesarios para el desarrollo de terapias efectivas.
Se han desarrollado diferentes métodos para estudiar el NMDAR. Sin embargo, cada uno tiene acompañamiento de advertencias. Por ejemplo, una técnica ampliamente utilizada es un ensayo basado en la fluorescencia que mide los cambios de NMDAR mediada por calcio intracelular en una línea celular estable bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina (Tet-en)20. Sin embargo, en este sistema, las concentraciones de supramaximal de ligandos que se necesitan y el requisito de que los inhibidores de NMDAR están presentes durante la medición es casi imposible detectar la actividad del antagonista competitivo. En otros sistemas similares, la expresión del receptor funcional de causa toxicidad, requiriendo bloqueadores de los canales tales como ketamina21,22 para preservar los cultivos celulares. Estos bloqueadores de los canales se sientan en el corazón del receptor y son difíciles de lavar, sobre todo en un formato basado en la placa, para que interfieran con los estudios funcionales del receptor. Finalmente, en medidas electrofisiológicas como fijación con abrazadera del remiendo, hay limitado rendimiento, y estudios de gran escala son muy caro23. No obstante, los sistemas anteriores son insensibles a la estimulación de la glicina; por lo tanto, estudiando la actividad dependiente de la glicina de la NMDAR se convierte en un reto.
Aquí, describimos un nuevo enfoque para el estudio de NMDAR que supera las limitaciones discutidas. Nuestra técnica aprovecha el sistema de expresión de baculovirus para expresar el receptor a nivel funcional con una relación óptima de las subunidades en tan poco como 16 horas. Además, el uso de baculovirus permite un enfoque simple y combinatorio, que proporciona una caracterización amplia de los distintos subtipos NMDAR recombinantes. A diferencia de otros ensayos, este Protocolo no requiere bloqueadores de los canales por el uso de antagonistas débiles. Ventaja más fuerte del método es que lavado después de la débil antagonista, el receptor es sensible a la modulación de los sitios individuales de glicina y glutamato enlace además de doble modulación de D/glicina-serina y glutamato-ligando sitios. El ensayo recapitula conocido farmacología del receptor NMDAR y los efectos de sus conocidos moduladores positivos y negativos. Finalmente, la generación de este ensayo celular en vitro supera la toxicidad celular causada por la afluencia excesiva de calcio y permite estudios funcionales del receptor de la manera un alto rendimiento, que puede acelerar descubrimientos de moduladores NMDAR en Estados de enfermedad.

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de receptor NMDA (NR1/NR2A) humano</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Vector de expresión dual</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplaca de fondo plano claro de 384 pocillos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 6-QF Kit de ensayo</td><td>molecular Dispositivos</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Boston Bio Producto</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, medios GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>Sintetizado internamente</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>Sintetizado internamente</td><td></td></tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>Sintetizado internamente</td><td></td></tr></tbody></table>

un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores nmda con sensibilidad d/glicina-serina y glutamato

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) (NMDAR) se clasifican como receptores de glutamato ionotrópicos y tienen un papel crítico en el aprendizaje y la memoria. Mal funcionamiento NMDAR, expresado como sea sobre - o debajo - activity causada por mutaciones, expresión alterada, tráfico y localización, puede contribuir a numerosas enfermedades, especialmente en el sistema nervioso central. Por lo tanto, entender la biología del receptor, así como facilitar el descubrimiento de compuestos y moléculas pequeñas es crucial en los esfuerzos para combatir enfermedades neurológicas. Enfoques actuales del estudio de los receptores tienen limitaciones como bajo rendimiento, alto costo y la incapacidad para el estudio de sus capacidades funcionales debido a la necesaria presencia de bloqueadores de los canales para evitar la excitotoxicidad mediada de NMDAR. Además, los sistemas de análisis existentes son sensibles a la estimulación por el glutamato solo y carecen de sensibilidad a la estimulación por glicina, otro ligando co del NMDAR. Presentamos el primer ensayo de placa de base con la energía de alto rendimiento para el estudio de un receptor NMDA con sensibilidad a ligandos Co, glutamato y D-serina/glicina. Este enfoque permite el estudio de las diferentes composiciones de subunidad NMDAR y estudios funcionales del receptor en modos sensibles a glutamato y glicina. Además, el método no requiere la presencia de inhibidores durante las mediciones. Los efectos de los moduladores alostéricos positivos y negativos se pueden detectar con este ensayo y la farmacología conocida de NMDAR ha sido replicada en nuestro sistema. Esta técnica supera las limitaciones de los métodos existentes y es económica. Creemos que esta nueva técnica acelerará el descubrimiento de terapias para patologías de NMDAR-mediada.

Antes de probar los efectos de moléculas pequeñas, uno debe determinar los niveles de expresión óptima de NMDARs, así como las concentraciones de ligando óptima. Como se describe, las células fueron sembradas a 10.000 células por pocillo en una placa de 384 pozos, HEK293 en presencia de 5 μm CGP060667, luego transduced con cantidades variables de NR1 y NR2A virus. Después de incubación durante la noche, inducida por el ligando calcio se midió flujo (figura 1)...

El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Este método puede ayudar al descubrimiento de moduladores NMDA para tratar enfermedades neurológicas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio del fisso de la actividad del receptor NMDA, en respuesta a concentraciones de defensa o combinaciones de ligandos en compuestos. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la capacidad general del receptor NMDA.También se puede aplicar para estudiar subtipos específicos en biología y una sensibilidad del receptor NMDA, en respuesta a ligandos o compuestos. Para medir la actividad del receptor NMDA, prepare una placa de 384 pocillos, con células HEK 293, transducidas con células NR1, NR2 o HEK 293, NR1, NR2A en presencia de compuesto protector. Luego, incube la placa a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 16 horas.Al día siguiente, retire la placa de la incubadora y deseche suavemente los medios celulares, volteando lentamente la placa sobre un contenedor de residuos biológicos compatible. Golpee suavemente la placa sobre una toalla de papel para limpiar los medios de los bordes de la placa y drene los medios restantes. Posteriormente, prepare el colorante de calcio

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Este video ofrece un protocolo detallado para estudiar el perfil farmacológico de humanos TRPA1 canales a través de FlexStation 3. El protocolo cubre los detalles de la preparación de la célula, la carga de tinte y el funcionamiento del lector de microplacas, FlexStation 3.

Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

Aquí se describe una adaptación de los protocolos utilizados para inducir la plasticidad homeostática en las neuronas para el estudio de la plasticidad de los receptores acoplados a proteínas G astrocíticos. Recientemente se utiliza para examinar los cambios en el grupo I mGluRs astrocítica en ratones jóvenes, el método se puede aplicar para medir la escala de varios GPCRs astrocitos, en el tejido de los ratones adultos in situ e in vivo, y para obtener una mejor apreciación de la sensibilidad...

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

A continuación, describimos la configuración, software de navegación, y el análisis de datos de un método espacial y temporalmente precisa de medir tónico y cambios extracelulares de glutamato fásicas in vivo usando matrices de microelectrodos ligados a enzimas (MEA).

El uso de biosensores basados ​​en enzimas para medir tónica y fásica glutamato en modelos de ratones con Alzheimer

Puede modular la excitabilidad neuronal a través de un proceso dinámico de endo - y exocitosis de los receptores de glutamato ionotrópicos excitadores. Se describe aquí es un análisis accesible, de alto contenido para la cuantificación del receptor de superficie e interno población piscinas.

Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.

Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca2+ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aprende a medir el flujo de calcio de alto rendimiento en células HEK 293 para estudiar la actividad de receptores NMDA y evaluar moduladores moleculares. Este método facilita el desarrollo de tratamientos para enfermedades neurológicas.

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato (Video) | JoVE Journal

Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato

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