Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica, como la fuerza de una sola proteína en las interacciones proteicas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para inmovilizar una amplia gama de biomoléculas diferentes. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque el manejo de la sonda en voladizo del microscopio de fuerza atómica y el funcionamiento del microscopio de fuerza atómica en sí mismo pueden ser un desafío.

Para empezar, póngase guantes resistentes a los ácidos, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Debajo de una campana extractora, use isopropanol en toallitas de precisión sin pelusa. Elimine el polvo grueso y las impurezas de varios portaobjetos de vidrio.

Transfiera los portaobjetos limpios a un frasco de pie lleno de ácido clorhídrico diluido con agua doblemente destilada. Selle el frasco con una tapa adecuada y colóquelo en un baño ultrasónico durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera las sondas en voladizo AFM de nitruro de silicio a un portaobjetos de vidrio limpio con la punta hacia arriba.

Transfiera el portaobjetos a una cámara impermeable a la luz ultravioleta e irradie el portaobjetos con luz ultravioleta desde arriba durante al menos 90 minutos. Después de esto, reemplace el ácido clorhídrico en el frasco de tinción con agua doblemente destilada, asegurándose de no dejar que la superficie del vidrio se seque. Selle el frasco con la tapa y vuelva a colocarlo en el baño ultrasónico durante otros 10 minutos.

Mientras tanto, disuelva el ácido etoxisilano polietilenglicol en una mezcla de etanol y agua doblemente destilada hasta una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro. Selle herméticamente esta solución para evitar la evaporación del etanol. Cuando esté listo, vierta la solución de silano en dos placas de Petri separadas.

Coloque los portaobjetos de vidrio limpios en una placa de Petri y el voladizo en la otra. Usando parafilm, selle herméticamente ambas placas para evitar que el etanol se evapore. Incube las placas estacionarias durante 90 minutos a temperatura ambiente.

Después de esto, use tres vasos de precipitados consecutivos que contengan etanol puro para lavar tanto el voladizo como los portaobjetos de vidrio. Coloque el voladizo lavado en un portaobjetos de vidrio limpio. Transfiera los portaobjetos de vidrio funcionalizado al frasco de tinción.

Curamos ambos en un horno a 110 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, almacene las muestras de vidrio silanizado y el voladizo en un desecador al vacío hasta por una semana. Cuando esté listo para comenzar la inmovilización aleatoria de proteínas, prepare una solución que contenga EDC y NHS en solución salina estándar tamponada con fosfato, como se describe en el protocolo de texto.

Cubra los portaobjetos de vidrio recubiertos de silano con esta solución. Coloque las sondas en voladizo silanizadas en una gota de la solución ECD/NHS. Incuba ambos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, enjuague tanto el voladizo como los portaobjetos en tres vasos de precipitados consecutivos para lavar completamente cualquier exceso de EDC/NHS. Transfiera los portaobjetos de vidrio activado a una placa de Petri equipada con un pañuelo húmedo. Agregue una gota de la solución de proteína deseada al área activada por EDC/NHS de los portaobjetos de vidrio y selle la placa de Petri con parafilm e incube las sondas a temperatura ambiente.

Agregue una gota de la solución de proteína deseada a la caja en voladizo equipada con un pañuelo húmedo. A continuación, lave bien las sondas en voladizo con PBS. Coloque las sondas en la gota de la caja y cierre la caja.

Incubar las sondas a temperatura ambiente. Después de esto, marque el área de la gota de proteína en la parte posterior de los portaobjetos del vaso. Lave a fondo tanto los portaobjetos de vidrio como las sondas en voladizo con tres vasos de precipitados consecutivos llenos de PBS.

Coloque las sondas lavadas en un recipiente que contenga solución salina tamponada con Tris durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave a fondo los portaobjetos de vidrio y las sondas en voladizo con PBS. Guárdelos en placas de Petri separadas cubiertas con PBS hasta que estén listos para usar.

Fije un portaobjetos de vidrio recién limpio en el portamuestras AFM y cúbralo con tampón PBS. A continuación, fije la sonda en voladizo preparada en el soporte del voladizo y colóquela en el cabezal AFM. Humedezca cuidadosamente el voladizo con una gota de tampón PBS.

Mueva lentamente el voladizo hacia la superficie de calibración hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el tampón PBS, pero aún lejos de la superficie de calibración. Utilice el microscopio óptico de vista superior o el microscopio invertido del AFM para colocar el láser en la parte posterior del voladizo. Coloque el punto láser cerca del extremo del voladizo, cerca de donde se encuentra la punta, y ajuste la posición en el fotodiodo detector de cuatro cuadrantes del AFM, de modo que el rayo láser reflejado se coloque en el centro del fotodiodo.

A continuación, abra el administrador de calibración en el software AFM. Para comenzar a calibrar la sensibilidad del voladizo y la constante del resorte, acérquese cuidadosamente a la superficie del sustrato y registre una curva de fuerza-distancia. Ajuste una línea recta a la parte más empinada de la curva de fuerza de retracción donde la punta está en contacto con la superficie del sustrato para determinar la sensibilidad de la palanca óptica.

Retraiga el voladizo de la superficie de la muestra y registre varios espectros de ruido térmico con el voladizo a una distancia mínima de 100 micras de la superficie y ajuste un oscilador armónico, proporcionado por el software AFM, a los espectros de ruido térmico para determinar la constante de resorte del voladizo. Después de esto, retraiga lentamente el voladizo y retírelo de la solución. Retire la superficie de vidrio utilizada para la calibración en voladizo y reemplácela con la superficie de muestra que contiene las proteínas inmovilizadas.

Mueva lentamente el voladizo húmedo hacia la superficie de la muestra hasta que el voladizo esté completamente cubierto por el tampón PBS, pero aún lejos de la superficie del sustrato. Acérquese a la superficie y registre múltiples curvas de distancia de fuerza en diferentes ubicaciones de la superficie de la muestra con una fuerza de contacto de 250 piconewtons, un tiempo de contacto de un segundo, una longitud de retracción de dos micrómetros y una velocidad de retracción de un micrómetro por segundo. En el software de procesamiento de datos, seleccione el icono Abrir lote de Escaneo de fuerza para abrir los archivos de la curva de fuerza medida.

Seleccione el icono Recalibrar la diflexión en V ajustando la sensibilidad en la constante de resorte para convertir la diflexión en voladizo en la fuerza directamente proporcional. A continuación, seleccione el icono "Sustracción de línea base" para restar la línea base del canal de retracción en una región de la curva de fuerza alejada de la superficie, que también establece el nivel de fuerza cero. Seleccione el icono "Determinación del punto de contacto" para definir el punto en el que la punta entra en contacto con la muestra.

Seleccione el icono "Separación de muestras de puntas" para convertir la señal de altura en separación de muestras de puntas. Además de restar la posición del punto de contacto, se resta la flexión en voladizo para calcular la distancia entre la superficie del sustrato y la punta del AFM. Seleccione el icono Ajustar un modelo de cadena de polímero y elija el modelo de cadena helicoidal extensible para filtrar las trazas de distancia de fuerza en busca de picos de fuerza que se produzcan en longitudes de ruptura superiores a 70 nanómetros.

Clasifique las interacciones no específicas y aplique el modelo de cadena helicoidal extensible a los picos seleccionados. En este estudio, las proteínas se inmovilizan covalentemente con orientación aleatoria a través de sus aminas primarias accesibles. Una imagen AFM de la capa de polímero silanizado muestra solo pequeñas ondulaciones superficiales con alturas que oscilan entre aproximadamente dos y cinco nanómetros.

Sin embargo, se observa que la superficie funcionalizada con fibronectina tiene moléculas de fibronectina de unos 10 nanómetros de altura. Una inspección más cercana revela que se puede reconocer la estructura dimérica de las moléculas. Estas moléculas parecen ser compactas, con una altura de cuatro a cinco nanómetros por encima del recubrimiento superficial de PEG y una longitud de aproximadamente 120 nanómetros.

A continuación, se investigan las fuerzas de interacción de RRGA con la fibronectina. Las curvas representativas de separación de muestras de punta registradas a una velocidad polar de una micra por segundo mostraron una baja interacción de fondo y eventos de interacción bien formados, que luego se ajustan utilizando un modelo de cadena extensible en forma de gusano. El trazado de los resultados de este ajuste muestra que, después de superar las interacciones superficiales no específicas en el estiramiento de los enlazadores PEG, hasta el 19% de las curvas de fuerza tienen eventos de ruptura con una fuerza de ruptura media de 52 piconewtons para la interacción de fibronectina RRGA y a una distancia de muestra de punta de aproximadamente 100 nanómetros.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, dependiendo de configuraciones como el tiempo de contacto o la velocidad de retracción, los datos de la espectroscopia de fuerza de una sola molécula contienen información múltiple y que este protocolo solo puede ser un primer paso hacia un análisis de datos completo. Si bien este método puede proporcionar información sobre las interacciones de una sola molécula, también se puede utilizar para estudiar las interacciones a nivel de una sola célula. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectroscopia de fuerza de una sola célula, para responder a preguntas adicionales como cómo interactúan las células enteras con las superficies recubiertas de proteínas.

No olvide que trabajar con ácidos y luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como guantes resistentes a los ácidos y una cámara impermeable a la luz ultravioleta al realizar este procedimiento.