Name: Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende la inmovilización covalente de proteínas en superficies de óxido de silicio mediante silanos heterobifuncionales para espectroscopia de fuerza de molécula única con microscopía de fuerza atómica.

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TB y HG reconocen apoyo financiero a través del Consejo Europeo de investigación "Cellufuel, avanzado beca Nº 294438". HCS reconoce el apoyo financiero del Ministerio Federal de educación e investigación a través de la proteína de Technofunktionale de Innovationsallianz (TeFuProt), SS reconoce financiera apoyo del ministerio bávaro de estado de educación y ciencia mediante el enfoque de la investigación "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Agradecemos a Conny Hasselberg-Christoph y Martina Hörig para soporte técnico

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Los autores no tienen nada que revelar.

Desde la introducción del AFM basado en SMF, convertido en una técnica ampliamente utilizada para directamente sonda intra e intermoleculares fuerzas de proteínas individuales, ácidos nucleicos y otras biomoléculas3,4,5. Exitosos experimentos de SMF, una superficie apropiada estrategia de acoplamiento es un requisito previo. A prueba las fuerzas intramoleculares en polímeros naturales y sintéticos, los polímeros pueden acoplarse directamente a la superficie del sustrato y AFM punta36,38,39,40,41. Para la investigación de interacciones inter moleculares, tales como enlaces moleculares, sin embargo, es recomendable utilizar moléculas linker flexible como hetero-bifuncional enlazadores de PEG, o cadenas polipeptídicas, para unir a los socios de la interacción a la extremidad AFM y la superficie del sustrato, para permitir la correcta orientación de los socios de la Unión, para superar las fuerzas superficiales de corto alcance y para evitar la desnaturalización y desdoblamiento de las proteínas21,22,23, 24,25,26,27,42. Por lo tanto, nos describe un protocolo simple y sencillo para la inmovilización covalente de las proteínas a través de sus aminas primarias accesibles utilizando a espaciadores PEG hetero-bifuncional.
Hemos demostrado su aplicabilidad en la investigación de la interacción fuerzas entre la adhesina de RrgA de S. pneumoniae y la proteína de matriz extracelular Fn, como recientemente descrito en detalle en otra parte13.
La química superficial está bien establecida y enfoques analizados y similares se han utilizado con éxito en múltiples funciones experimentos19,42,43,44,45. El silylether utilizado para el acoplamiento con el polímero de silano a la superficie, está sujeto a hidrólisis. El grado de hidrólisis depende de la cantidad de bonos de siloxano formado, que pueden ser controlados durante el proceso de silanización. Si las fuerzas de interacción alto (≥ 1000 pN) se espera que durante las mediciones de la SMF, la silanización debe ser realizada a través de fase de vapor deposición30 que resulta en la formación de una capa continua de siloxanos. En cuanto a muchos experimentos (por ejemplo, muchas proteínas – las interacciones entre proteínas), las fuerzas de interacción están en el rango de unos cientos pN y el procedimiento descrito, en que siloxano formación se realiza por la deposición de una fase acuosa y desatada Organo-silanos son cuidadosamente lavada con etanol (paso 1.1.7) seguido por el curado con calor (paso de 1.1.8), es suficientes.
Otro paso importante es lavar la EDC restantes y moléculas NHS fuera de la superficie (paso 1.2.3), como sobras dará lugar a la activación de grupos carboxilo de las proteínas. Esto puede cualquier resultado en la reticulación de proteínas en la misma superficie, que pueden alterar su funcionalidad o covalente pareja activa proteínas a otras proteínas en la superficie opuesta. Esto puede conducir a la fijación de las proteínas entre la superficie y la punta AFM, que se traduce en fuerzas de ruptura alta posiblemente acompañadas por el despliegue de dominio (ver figura 3b, rastro 1, 4 y 5, despliegue de dominios Fn)46. Puede ocurrir el mismo problema, si los activos ésteres de NHS del espaciador PEG quedan insaturados. Por lo tanto, la incubación con solución salina tamponada con Tris se recomienda (paso 1.2.6), como la amina primaria de Tris sacia los aminos grupos reactivos restantes.
Siguiendo el protocolo paso a paso conduce a una distribución homogénea de Fn en el vidrio silanizada de la superficie (ver figura 2), dejando una forma dimérica de la proteína. Esto se asemeja a la estructura de Fn´s en solución y es consistente con los datos anteriores AFM en otros muestra superficies37. Además, se obtiene una concentración adecuada de RrgA en la punta AFM, que genera un valor objetivo de ~ 20% de los eventos de interacción bien definida durante las mediciones de SMF (figura 3 y figura 4). Otra forma elegante de controlar la cantidad de moléculas junto a la punta del sustrato y voladizo de muestra además variando los tiempos de la concentración o incubación de la proteína, es la combinación de silano-agentes con diferentes grupos funcionales secundarios. Cambiando la relación de grupos reactivos de la proteína que se extiende desde los polímeros de PEG, el número de proteínas inmovilizadas puede ser controlados15,16,17,18.
El protocolo descrito aquí puede también utilizarse para inmovilizar otras moléculas que contienen -NH2 o ajustarse a las proteínas par a otra superficie de óxido de silicio además de nitruro de silicio y vidrio. Dependiendo del diseño de la proteína, el grupo carboxyl reactivos de Amina se puede cambiar a un grupo reactivo sulfhidrilo (p. ej., maleimida o ortho-piridil disulfuro) para acoplar la proteína a través de su libre – grupos SH. Para Fn, esto resulta en una orientación predefinida13,17,20.
En Resumen, este protocolo puede ajustarse para atender a diferentes requerimientos y es adecuado para otras aplicaciones biofísicas además de experimentos de espectroscopia de fuerza sola molécula.

Al lado de pinzas ópticas y magnéticas, la fuerza atómica (AFM) de microscopio1,2 ha surgido como una herramienta útil para analizar y manipular moléculas y probe sus propiedades y funciones, incluyendo su respuesta a la fuerza externa3 ,4. En cambio métodos como el enzima del inmunosorbente enlazado ensayo (ELISA), superficie de resonancia de plasmon (SPR) o cristal de cuarzo las configuraciones de microbalanza (QCM), AFM permite medir las interacciones a nivel de célula única (FCE)6 y sola molécula (SMF)5 . Estas tecnologías dado información valiosa sobre mecanismos vinculantes como los bonos de captura para la interacción de e. coli proteína pilus que fimh con manosa7, o el tándem β-cremallera repite formada por proteínas de unión de Fn de S. aureus en enlace a Fn8. Recientemente pudimos demostrar que la adhesina de pilus-19,10 de la bacteria grampositiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 es capaz de unirse a fibronectina12 RrgA con sus dos dominios terminales. Esto reveló un nuevo mecanismo de unión de dos dominios que difiere el tándem β-cremallera y puede permitir que los neumococos piliated formar y mantener un host contacto que contiene fibronectina transitoria superficies13.
El éxito de los experimentos de SMF depende críticamente de la inmovilización funcional y nativa de las biomoléculas en las superficies sólidas y puntas de AFM. Como las fuerzas altas pueden ocurrir durante las mediciones de la SMF, las proteínas deben preferiblemente covalente acoplarse a la superficie. Hay un gran número de métodos de acoplamiento para la inmovilización de proteínas y otras biomoléculas, así como células enteras en superficies sólidas (inorgánicas), nano-partículas y aparatos descritos en la literatura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Estos protocolos suelen hacen uso de sustancias peligrosas, son difíciles de realizar y requieren de equipo especial (por ejemplo, limpiador de plasma). Una manera simple de moléculas de pareja al vidrio es adjuntar una capa más gruesa del polímero de heterobifunctional reticulados con un grupo silano reactivo en un lado y un grupo amina reactiva en su otro lado. Dependiendo de la aplicación, pueden constar de los agentes de acoplamiento flexibles hidrocarburo cadenas de longitud variable, por ejemplo., polietilenglicol (PEG). Suprimir las interacciones no específicas de las superficies modificadas (por ejemplo, hidrofóbicas, electrostáticas e interacciones de van-der-Waals) y puede proporcionar la libertad rotacional de la molécula acoplada.
Aquí, describimos un protocolo general para el acoplamiento covalente de las proteínas que contienen uno o más grupos amino libres (-NH2) superficies de vidrio y puntas de nitruro de silicio AFM vía un heterobifunctional etoxi silano-PEG-carboxilo (-COOH). Este protocolo se puede utilizar en experimentos de SMF, que ejemplo es basados en la interacción de la proteína de matriz extracelular Fn y RrgA (ver figura 1 para un resumen).
El primer paso es la silanización de la superficie28,29,30,31. Consiste en la hidrólisis de los grupos etoxi del agente de acoplamiento para formar grupos de SiOH altamente reactivos. Estos pueden reaccionar con los grupos de SiOH sobre el sustrato. En una condensación primaria paso, estos enlaces de hidrógeno de forma silanoles y difunda en el sustrato. En una reacción de condensación secundario (que requiere generalmente calor o vacío para eliminar el agua), se forman enlaces siloxano. Esto resulta en una capa de silano de organo covalentemente unido.
El segundo paso es el acoplamiento de las proteínas a la funcional (-COOH) grupos que se extienden desde el polímero32. En primer lugar, se convierte el ácido en un éster N-hydroxysuccinimid (NHS) reactivo intermedio, que es adquirido a través de la NHS/EDC bien establecida (1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimid química33 y se somete a sustitución nucleofílica para finalmente formar un enlace amida con aminas primarias de las proteínas.
De esta manera, RrgA fue junto a puntas de AFM de nitruro de silicio y humano Fn a substratos de vidrio en una orientación al azar y se analizaron sus fuerzas de interacción en el nivel de molécula única. Nuestros resultados demuestran que la química superficial descrita conduce a una distribución homogénea de la Fn en la superficie de vidrio y a una concentración adecuada de RrgA en la punta, evidente por el valor objetivo de un 20% de los eventos de interacción durante las mediciones de SMF. Esta química reduce las interacciones de fondo no específica, está sujeto a poca alteración durante la adquisición de datos y por lo tanto ideal para experimentos precisos de SMF.

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; pureza analítica</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>doblemente destilada</tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td> <td>y ge; 99,8 %; pureza analítica</td></tr><tr><td>Etoxisilano polietilenglicol ácido</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; para síntesis</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Molécula de sonda e.g. Fibronectina, plasma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Molécula de sonda p. ej. RrgA</td><td></td><td></td><td>Producido en laboratorio</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %; TRIS; Grado de amortiguación</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte>Vasos de</td> precipitados <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de vidrio Correderas de vidrio</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de gas inerte</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard Software SPM y DP</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno de laboratorio</td><td>Aglutinante Agitador</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnético</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro espátula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>microcentrífuga</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>M Marca</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td><td></td>de Petri</tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 y micro; l, 50-200 y micro; l, 100-1000 &nbsp; y micro; l</td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voladizo de nitruro de silicio - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S Constante de resorte</td><td></td><td>&le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Baño de sonicación</td><td>Bandelín</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tarro</td><td></td><td></td><td></td>de tinción</tr><tr><td>Microscopio estereoscópico - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td> Barra <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>de agitación</tr><tr><td>Toallitas de precisión de la ciencia</td><td>Kimtech, Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, UV, PenRay</td><td>, UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Espectro de mercurio con la energía primaria a 254&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Desecador</td><td></td><td></td><td></td>de vacío</tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td></td>de vacío</tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de pesaje</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

En los últimos años, microscopía de fuerza atómica (AFM) basado en espectroscopia de fuerza sola molécula (SMF) ampliada nuestra comprensión de las propiedades moleculares y funciones. Nos dio la oportunidad de explorar una multiplicidad de mecanismos biofísicos, por ejemplo, cómo bacteriana adhesinas atar a receptores de superficie de host más detalladamente. Entre otros factores, el éxito de los experimentos de SMF depende la inmovilización funcional y nativa de las biomoléculas de interés sobre las superficies sólidas y puntas de AFM. Aquí, describimos un protocolo sencillo para el acoplamiento covalente de las proteínas a las superficies de silicio utilizando silano-PEG-carboxyls y la química de N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) establecida en orden para explorar la interacción de la adhesina de pilus-1 RrgA la bacteria grampositiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) con la matriz extracelular proteína fibronectina (Fn). Nuestros resultados muestran que la funcionalización superficial conduce a una distribución homogénea de la Fn en la superficie de vidrio y a una concentración adecuada de RrgA en la punta del voladizo AFM, evidente por el valor objetivo de hasta un 20% de los eventos de interacción en SMF mediciones y reveló que RrgA se une a Fn con una fuerza media de 52 pN. El protocolo puede ajustarse a la pareja a través de sitio específico libre grupos tiol. Esto resulta en una orientación predefinida de proteína o molécula y es adecuado para otras aplicaciones biofísicas además las SMF.

El protocolo había descrito aquí resultados de una inmovilización covalente de las proteínas a través de sus aminas primarias accesibles con orientación al azar (figura 1). Figura 2 muestra una imagen AFM de una superficie de vidrio silanizada con (izquierda) y sin (derecha) Fn inmovilizada, grabado después de la deshidratación de las muestras bajo una corriente suave de nitrógeno. La capa de polímero del silane muestra sólo pequeñas corrugaciones superficiales con una altura de aproximadamente 2-5 nm (figura 2, derecha), mientras que en la superficie funcionalizada con Fn, aproximadamente 10 nm alta Fn moléculas son evidentes (figura 2, izquierda). En primeros planos, se puede reconocer la estructura dimérica del Fn. Las moléculas de Fn parecen ser compacto, con una altura de 4-5 nm por encima de la capa superficial de la PEG con una longitud de ~ 120 nm (ver insertos).
Para investigar las fuerzas de interacción de RrgA con Fn, que recientemente fue descrita en detalle por nuestro grupo13, RrgA fue acoplada a una punta AFM de nitruro de silicio y humano Fn para el substrato de cristal (figura 3a). Consejo representativo la figura 3 muestra las curvas de separación de la muestra de la interacción de RrgA con Fn grabado a una velocidad de tracción de 1 μm s-1. La química de superficies usada conducido a una interacción de bajo fondo y eventos bien en forma individual (o doble) interacción (figura 3a), que fueron cabidos con un gusano extensible como modelo de la cadena (eWLC) (curvas rojas). Trazar los resultados del ajuste (fuerza de ruptura y longitud, ver figura 4) muestra que después de superar la interacción superficial inespecífica entre Punta AFM y sustrato y estirar los enlazadores de PEG (&gt; 70 nm), hasta ~ 19% de las curvas de fuerza presentó ruptura eventos con una ruptura media fuerza para RrgA - interacción de Fn de ~ 52 pN en una punta-muestra distancias de unos 100 nm. En contraste, una química superficial inaplicable (aquí, amortiguamiento omitida con Tris amortiguada salina figura 3b) obstaculizará una evaluación clara de los eventos de interacción único debido a las interacciones inespecíficas, múltiples proteína vinculante (trace 2 y 3) o acoplamiento covalente de proteínas entre la superficie de la muestra y la punta AFM voladizo. Esto nos lleva a las fuerzas de ruptura alta (trace 1) posiblemente acompañadas por el despliegue de los dominios de la proteína (Fn) (rastro 4 y 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figura 1: Resumen sobre la química superficial. La hidrólisis de etoxi silano-PEG-carboxilo es seguida por su condensación en la superficie hidratada y la formación de reticulaciones de siloxano. La reacción de EDC con los grupos carboxilo resulta en un reactivo o- acylisourea, un intermedio reactivo amina con una vida media muy corta en solución acuosa (hidrólisis). El intermedio es estabilizado por la formación de un éster de NHS que se somete a sustitución nucleofílica para finalmente formar un enlace amida con aminas primarias de las proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figura 2: Inmovilización de fibronectina en un cristal substrato vía heterobifunctional etoxi silano PEG agente del acoplador del carboxilo. Superficies de imágenes AFM de vidrio funcionalizado con (izquierda) y sin (derecha) FN números indican las moléculas individuales del Fn, que se distribuyen homogéneamente en la superficie del sustrato (insertos). Las moléculas adoptan una estructura dimérica y compacta con una altura de 4-5 nm por encima de la clavija de capa y una longitud de &gt; 100 nm. Esto se asemeja a la estructura del Fn en la solución y es consistente con los datos anteriores AFM en otras superficies, por ejemplo, la mica (barra de escala de incrustaciones = 500 nm)37. Por debajo de la AFM imágenes son perfiles de altura a lo largo de la línea indicada en las imágenes AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figura 3: ilustración de un experimento de SMF y el representante de la fuerza las curvas de distancia de RrgA - interacción Fn. (a) RrgA y Fn fueron covalentemente enlazados por el silano de etoxi heterobifunctional PEG agente del acoplador del carboxilo a un nitruro de silicio AFM voladizo de punta y una superficie de vidrio, respectivamente. Representante SMFS distancia se muestran curvas obtenidas de RrgA - interacción Fn a una velocidad de retracción de 1 μm s-1 con la inmovilización descrita de RrgA y Fn de la fuerza. Curvas de rojo representan los ajustes extensible gusano-como cadena para obtener longitudes y fuerzas de ruptura. Se ha modificado la figura de Becke, et al., ACSnano 201813. (b) el representante SMFS fuerza curvas de distancia obtenidas de RrgA - interacción Fn sin amortiguamiento con tampón Tris salino. En este caso, la amina primaria de Tris estuvo ausente por lo que permanecen activos ésteres NHS quedaron insaturados durante el experimento. Esto condujo a múltiples proteínas vinculantes (trace 2 y 3) y la fijación de proteínas entre la superficie y la punta AFM que dio lugar a la ruptura alta las fuerzas de dominio acompañado por (Fn) despliegue (rastro 1, 4 y 5; tenga en cuenta las diferentes escalas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figura 4: distribución de fuerza y longitud de RrgA sola - interacciones Fn. Ruptura fuerza y correspondientes histogramas de longitud de ruptura de RrgA - mediciones de la interacción de funciones Fn (n = 1400) a una velocidad de retracción de 1 μm s-1. Los histogramas muestran un más probable ruptura fuerza fMP de 51,6 pN (ajuste de Gauss, línea negra) y una acumulación de longitudes de ruptura alrededor de 100 nm. Se ha modificado la figura de Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica, como la fuerza de una sola proteína en las interacciones proteicas. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para inmovilizar una amplia gama de biomoléculas diferentes. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque el manejo de la sonda en voladizo del microscopio de fuerza atómica y el funcionamiento del microscopio de fuerza atómica en sí mismo pueden ser un desafío.Para empezar, póngase guantes resistentes a los ácidos, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Debajo de una campana extractora, use isopropanol en toallitas de precisión sin pelusa. Elimine el polvo grueso y las impurezas de varios portaobjetos de vidrio.Transfiera los portaobjetos limpios a un frasco de pie lleno de ácido clorhídrico diluido con agua doblemente destilada. Selle el frasco con una tapa adecuada y colóquelo en un baño ultrasónico durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera las sondas en voladizo AFM de nitruro de silicio a un portaobjetos de vidrio limpio con la punta hacia arriba.Transfiera el portaobjetos a una cámara impermeable a la luz ultravioleta e irradie el portaobjetos con luz ultravioleta desde arriba durante al menos 90 minutos. Después de esto, reemplace el ácido clorhídrico en el frasco de tinción con agua doblemente destilada, asegurándose de no dejar que la superficie del vidrio se seque. Selle el frasco con la tapa y vuelva a colocarlo en el baño ultrasónico durante otros 10 minutos.Mientras tanto, disuelva el ácido etoxisilano polietilenglicol en una mezcla de etanol y agua doblemente destilada hasta una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro. Selle herméticamente esta solución para evitar la evaporación del etanol. Cuando esté listo, vierta la solución de silano en dos placas de Petri separadas.Coloque los portaobjetos de vidrio limpios en una placa de Petri y el voladizo en la otra. Usando parafilm, selle herméticamente ambas placas para evitar que el etanol se evapore. Incube las placas estacionarias durante 90 minutos a temperatura ambiente.Después de esto, use tres vasos de precipitados consecutivos que contengan etanol puro para lavar tanto el voladizo como los portaobjetos de vidrio. Coloque el voladizo lavado en un portaobjetos de vidrio limpio. Transfiera los portaobjetos de vidrio funcionalizado al frasco de tinción.Curamos ambos en un horno a 110 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, almacene las muestras de vidrio silanizado y el voladizo en un desecador al vacío hasta por una semana. Cuando esté listo para comenzar la inmovilización aleatoria de proteínas, prepare una solución que contenga EDC y NHS en solución salina estándar tamponada con fosfato, como se describe en el protocolo de texto.Cubra los portaobjetos de vidrio recubiertos de silano con esta solución. Coloque las sondas en voladizo silanizadas en una gota de la solución ECD/NHS. Incuba ambos durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, enjuague tanto el voladizo como los portaobjetos en tres vasos de precipitados consecutivos para lavar completamente cualquier exceso de EDC/NHS. Transfiera los portaobjetos de vidrio activado a una placa de Petri equipada con un pañuelo húmedo. Agregue una gota de la solución de proteína deseada al área activada por EDC/NHS de los portaobjetos de vidrio y selle la placa de Petri con parafilm e incube las sondas a temperatura ambiente.Agregue una gota de la solución de proteína deseada a la caja en voladizo equipada con un pañuelo húmedo. A continuación, lave bien las sondas en voladizo con PBS. Coloque las sondas en la gota de la caja y cierre la caja.Incubar las sondas a temperatura ambiente. Después de esto, marque el área de la gota de proteína en la parte posterior de los portaobjetos del vaso. Lave a fondo tanto los portaobjetos de vidrio como las sondas en voladizo con tres vasos de precipitados consecutivos llenos de PBS.Coloque las sondas lavadas en un recipiente que contenga solución salina tamponada con Tris durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave a fondo los portaobjetos de vidrio y las sondas en voladizo con PBS. Guárdelos en placas de Petri separadas cubiertas con PBS hasta que estén listos para usar.Fije un portaobjetos de vidrio recién limpio en el portamuestras AFM y cúbralo con tampón PBS. A continuación, fije la sonda en voladizo preparada en el soporte del voladizo y colóquela en el cabezal AFM. Humedezca cuidadosamente el voladizo con una gota de tampón PBS.Mueva lentamente el voladizo hacia la superficie de calibración hasta que el voladizo esté completamente sumergido en el tampón PBS, pero aún lejos de la superficie de calibración. Utilice el microscopio óptico de vista superior o el microscopio invertido del AFM para colocar el láser en la parte posterior del voladizo. Coloque el punto láser cerca del extremo del voladizo, cerca de donde se encuentra la punta, y ajuste la posición en el fotodiodo detector de cuatro cuadrantes del AFM, de modo que el rayo láser reflejado se coloque en el centro del fotodiodo.A continuación, abra el administrador de calibración en el software AFM. Para comenzar a calibrar la sensibilidad del voladizo y la constante del resorte, acérquese cuidadosamente a la superficie del sustrato y registre una curva de fuerza-distancia. Ajuste una línea recta a la parte más empinada de la curva de fuerza de retracción donde la punta está en contacto con la superficie del sustrato para determinar la sensibilidad de la palanca óptica.Retraiga el voladizo de la superficie de la muestra y registre varios espectros de ruido térmico con el voladizo a una distancia mínima de 100 micras de la superficie y ajuste un oscilador armónico, proporcionado por el software AFM, a los espectros de ruido térmico para determinar la constante de resorte del voladizo. Después de esto, retraiga lentamente el voladizo y retírelo de la solución. Retire la superficie de vidrio utilizada para la calibración en voladizo y reemplácela con la superficie de muestra que contiene las proteínas inmovilizadas.Mueva lentamente el voladizo húmedo hacia la superficie de la muestra hasta que el voladizo esté completamente cubierto por el tampón PBS, pero aún lejos de la superficie del sustrato. Acérquese a la superficie y registre múltiples curvas de distancia de fuerza en diferentes ubicaciones de la superficie de la muestra con una fuerza de contacto de 250 piconewtons, un tiempo de contacto de un segundo, una longitud de retracción de dos micrómetros y una velocidad de retracción de un micrómetro por segundo. En el software de procesamiento de datos, seleccione el icono Abrir lote de Escaneo de fuerza para abrir los archivos de la curva de fuerza medida.Seleccione el icono Recalibrar la diflexión en V ajustando la sensibilidad en la constante de resorte para convertir la diflexión en voladizo en la fuerza directamente proporcional. A continuación, seleccione el icono "Sustracción de línea base" para restar la línea base del canal de retracción en una región de la curva de fuerza alejada de la superficie, que también establece el nivel de fuerza cero. Seleccione el icono "Determinación del punto de contacto" para definir el punto en el que la punta entra en contacto con la muestra.Seleccione el icono "Separación de muestras de puntas" para convertir la señal de altura en separación de muestras de puntas. Además de restar la posición del punto de contacto, se resta la flexión en voladizo para calcular la distancia entre la superficie del sustrato y la punta del AFM. Seleccione el icono Ajustar un modelo de cadena de polímero y elija el modelo de cadena helicoidal extensible para filtrar las trazas de distancia de fuerza en busca de picos de fuerza que se produzcan en longitudes de ruptura superiores a 70 nanómetros.Clasifique las interacciones no específicas y aplique el modelo de cadena helicoidal extensible a los picos seleccionados. En este estudio, las proteínas se inmovilizan covalentemente con orientación aleatoria a través de sus aminas primarias accesibles. Una imagen AFM de la capa de polímero silanizado muestra solo pequeñas ondulaciones superficiales con alturas que oscilan entre aproximadamente dos y cinco nanómetros.Sin embargo, se observa que la superficie funcionalizada con fibronectina tiene moléculas de fibronectina de unos 10 nanómetros de altura. Una inspección más cercana revela que se puede reconocer la estructura dimérica de las moléculas. Estas moléculas parecen ser compactas, con una altura de cuatro a cinco nanómetros por encima del recubrimiento superficial de PEG y una longitud de aproximadamente 120 nanómetros.A continuación, se investigan las fuerzas de interacción de RRGA con la fibronectina. Las curvas representativas de separación de muestras de punta registradas a una velocidad polar de una micra por segundo mostraron una baja interacción de fondo y eventos de interacción bien formados, que luego se ajustan utilizando un modelo de cadena extensible en forma de gusano. El trazado de los resultados de este ajuste muestra que, después de superar las interacciones superficiales no específicas en el estiramiento de los enlazadores PEG, hasta el 19% de las curvas de fuerza tienen eventos de ruptura con una fuerza de ruptura media de 52 piconewtons para la interacción de fibronectina RRGA y a una distancia de muestra de punta de aproximadamente 100 nanómetros.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, dependiendo de configuraciones como el tiempo de contacto o la velocidad de retracción, los datos de la espectroscopia de fuerza de una sola molécula contienen información múltiple y que este protocolo solo puede ser un primer paso hacia un análisis de datos completo. Si bien este método puede proporcionar información sobre las interacciones de una sola molécula, también se puede utilizar para estudiar las interacciones a nivel de una sola célula. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectroscopia de fuerza de una sola célula, para responder a preguntas adicionales como cómo interactúan las células enteras con las superficies recubiertas de proteínas.No olvide que trabajar con ácidos y luz ultravioleta puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como guantes resistentes a los ácidos y una cámara impermeable a la luz ultravioleta al realizar este procedimiento.

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

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La unión covalente de moléculas de sonda a puntas voladizas de la microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica esencial para la investigación de sus propiedades físicas. Esto nos permite determinar la fuerza de estiramiento, la fuerza de desorción y la longitud de los polímeros a través de la espectroscopia de fuerza de molécula única basada en AFM con alta reproducibilidad.

Adjunto covalente de moléculas únicas para espectroscopia de fuerza basada en AFM

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aprende la inmovilización covalente de proteínas en superficies de óxido de silicio mediante silanos heterobifuncionales para espectroscopia de fuerza de molécula única con microscopía de fuerza atómica.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

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