Name: Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a producir triterpenos a escala preparativa mediante expresión transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana. Este método rápido y escalable utiliza co-infiltración de Agrobacterium para biosíntesis de compuestos de alto valor farmacéutico.

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Este trabajo fue financiado por una beca de Parque de investigación Norwich (JR), la ingeniería conjunta y Consejo de investigación de ciencias físicas/biotecnológicos y financiado por el BBSRC de Consejo de investigación de ciencias biológicas OpenPlant sintética biología centro de investigación conceden (BB L014130/1) (M.J.S., A.O.); un intercambio de conocimientos de centro John Innes y comercialización conceden (BB/KEC1740/1) (BB); y el Instituto BBSRC programa estratégico 'Las moléculas de la naturaleza' (BB/P012523/1) y el John Innes (A.O.). Nos gustaría agradecer a George Lomonossoff para proporcionar los vectores pEAQ y Andrew Davis para la fotografía.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Rendimiento alto vacío infiltración permite este protocolo a ser utilizado rutinariamente en nuestro laboratorio para la producción preparativa de triterpeno compuestos de interés para diferentes aplicaciones posteriores. El aparato de vacío de la infiltración que se describe aquí se reproducen fácilmente. Además del depósito vacío es aconsejable disminuir el tiempo necesario para tirar el vacío necesario, sin embargo, es posible reutilizar simplemente un horno de vacío sin modificar como la cámara de infiltración. La protección de la bomba de vacío vía la adición de un condensador adecuado es teóricamente razonable, pero en nuestro laboratorio hemos encontrado que sea innecesario.
Cobertura de infiltración se ve comprometida si las hojas no son completamente sumergidas en la suspensión de la infiltración. Este problema se reduce al mínimo asegurándose de que el nivel de la suspensión llega a la superficie superior del titular de la planta, y que el titular de la planta es un ajuste apretado para el baño de la infiltración. Nota de la figura 2 que la superficie superior del titular de la planta es empotrada en el baño de infiltración cuando en lugar. Esto se logra mediante paneles en los bordes mediados del titular de los que forman el punto de anclaje con la parte superior de la bañera de infiltración. La suspensión de infiltración requieren adiciones periódicas para mantener el nivel de suspensión. Esto se logra mejor por la adición de la suspensión de exceso de infiltración para evitar la reducción gradual de la OD600 en el transcurso de una gran infiltración batch-wise. Sin embargo, en nuestras manos, sustitución por agua no parecen tener un efecto notable en los rendimientos esperados a escala preparativa, aunque esto no ha sido posible investigar. Cuantas plantas se pueden infiltradas de un lote de suspensión de infiltración es todavía una cuestión abierta. Rutinariamente infiltran entre 100 y 200 plantas con un solo lote de suspensión de infiltración. Además, es normal que algunos suelo para lixiviación en la suspensión de infiltración a lo largo del proceso de infiltración. Esto no se ha encontrado para tener un efecto notable sobre la eficacia de la infiltración.
Durante la cosecha es recomendable (pero no fundamental) para cosechar solamente las hojas que se infiltraron (algunas hojas habrán crecido después de la infiltración). Cosecha selectiva evita la dilución con tejido improductivo, que de lo contrario aumentaría la proporción de impurezas endógenas en relación con el compuesto de interés. Esto tiene un impacto nominal en la facilidad de purificación de aguas abajo y aumenta la magnitud de estos procesos. Cuando se utiliza tHMGR para impulsar el suministro de precursores, un fenotipo necrosado se observa a menudo a desarrollar durante el período de crecimiento después de la infiltración. Esto es normal y realmente ayuda a la cosecha selectiva y el posterior proceso de secado. El polvo de hoja secas generalmente puede almacenarse en un recipiente hermético en un lugar fresco, seco y oscuro, pero idealmente en un desecador bajo vacío. Esto depende de la estabilidad del compuesto de interés. Tenga cuidado si decide almacenar en un congelador de-80 ° C. Asegurarse de que las secas hojas están en un recipiente resistente al agua y en salida de almacén, permite este contenedor a temperatura ambiente antes de su apertura. No hacerlo resultará en remojo de las hojas, dificultando el proceso corriente abajo.
Los pasos posteriores a la cosecha en este protocolo se proporcionan con fines ilustrativos y para ayudar a aquellos investigadores que pueden haber limitado química práctica de la experimentan. Puede ser sustituidas por muchas otras técnicas de extracción/purificación de productos naturales. Como se indica en la introducción, PSE tiene muchas ventajas, sin embargo el capital coste de aparatos disponibles en el mercado de PSE puede ser prohibitivo, y no es esencial. Tratamiento de la resina básica de intercambio iónico es un método muy conveniente para reemplazar a saponificación tradicional seguido por partición líquido-líquido. Sin embargo, no es conveniente para los productos que contienen grupos de ácido carboxílico o grupos funcionales que se hidroliza bajo condiciones básicas, tales como esteres. Estos productos se espera a ser retenidos en la resina básica de intercambio iónico. Sin embargo, hay potencial para explotar esto para una captura y liberación de procedimiento (no documentado aquí). Donde saponificación tradicional sería apropiado, tratamiento de resina de intercambio iónico básicas sirve como una alternativa conveniente. El método de cromatografía se describe en el paso 9, se ha encontrado para ser generalizable para los compuestos descritos en la figura 3. Sin embargo, compuestos de polaridad creciente pueden requerir un largo periodo de elución 100% acetato de etilo. Paso 9.2, purificación fina descendente es enteramente compuesto específico y también es dependiente de la escala. Reiteradas rondas de cromatografía flash de pequeña escala con gradientes optimizados, es suficiente para lograr una pureza adecuada para el análisis de NMR. En escalas más grandes, la cristalización es a menudo una alternativa conveniente. En casos difíciles, preparativa o semi-preparativa alta cromatografía líquida (HPLC) se puede emplear dependiendo de la cantidad deseada de compuesto aislado. Ejemplos de procesos de purificación de aguas abajo para una gama de compuestos representativos se pueden encontrar en otra parte8.
El protocolo actual, tal como se presenta aquí, se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio y ha demostrado utilidad. Sin embargo, es todavía significativo alcance para la mayor optimización de la plataforma de expresión. Está trabajando en nuestro laboratorio para investigar cómo más ingeniería de vías y control diferencial de los niveles de expresión de la proteína podría mejorar la producción de triterpeno, mientras mediadores de toxicidad para las células del huésped. También existe la posibilidad para investigar la manipulación de los sistemas de transporte intracelular20,21y la dirección de las enzimas a diferentes compartimentos celulares22,23, avenidas que podrían mejorar la eficiencia de varios eventos de oxidación. Beneficios potenciales para la modificación de la morfología subyacente de orgánulos claves también podrían explorarse. Por ejemplo, se ha observado sobreexpresión del dominio de membrana de Arabidopsis thaliana HMGR para inducir la hipertrofia del retículo endoplásmico en plantas24; un sitio clave para la actividad de CYP450. Este protocolo es ideal para la producción de mg para cantidades de gramo-escala de productos de triterpeno y puede emplearse en un entorno de investigación a compuestos para estudio aguas abajo (por ejemplo, la exploración sistemática de la estructura y actividad relaciones y las investigaciones preliminares en las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de compuestos de plomo de interés clínico). Sin embargo, la plataforma es linealmente y confiablemente escalable simplemente incrementando el número de plantas utilizadas y el sentido práctico de expresión transitoria mediante agroinfiltration se ha demostrado a escala industrial para la producción de proteínas farmacéuticas 14, por lo tanto hay potencial de esta plataforma para ser extendido para la producción comercial de triterpenos de alto valor. Por otra parte, también es posible visualizar la producción de transformantes estables llevando el camino biosintético del deseo finalizado multigénica, permitiendo el cultivo masivo y continuo 'cultivo' de N. benthamiana de transgénicos cepas la producción de diferentes compuestos de valor comercial.

Los triterpenos son uno de los más grandes y más familias estructuralmente diversas de productos naturales. A pesar de su inmensa diversidad, triterpeno todos los productos naturales se creen para ser derivado del mismo precursor lineal 2,3-oxidosqualene, un producto de la vía del mevalonato en plantas. Ciclización del oxidosqualene 2.3 es iniciado y controlado por una familia de enzimas denominado cyclases del oxidosqualene (OSCs). Este paso de ciclización representa el primer nivel de diversificación, con cientos de andamios diferentes triterpeno haber divulgado de la naturaleza1. Estos andamios están más diversificados por sastrería enzimas incluyendo pero no limitado a, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Tales vías biosintéticas pueden llevar a complejidad inmensa, a veces dando por resultado productos finales que son apenas reconocibles desde el triterpeno del padre. Por ejemplo, la estructura compleja de la potente insecticida y antialimentario limonoide de azadiractina se cree que derivan de un triterpeno tetracíclico de los tirucallane tipo3.
Muchos derivados de triterpenos productos naturales, incluso aquellos con andamios de padres relativamente sin modificar, han demostrado poseer actividad biológica medicinal relevantes4,5,6,7. Sin embargo, hasta ahora este potencial no se ha traducido en una gran cantidad de medicamentos derivados de triterpenos en la clínica. Podría decirse que se trata (al menos parcialmente) una consecuencia de acceso sintético práctico limitado a esta clase de compuesto, un problema que puede sofocar la exploración de las relaciones estructura-actividad y desarrollo de llevar candidatos por tradicionales medicinales flujos de trabajo de química.
La expresión transitoria de las enzimas biosintéticas triterpeno de otras especies de plantas en hojas de N. benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno (figura 1). Este proceso puede utilizarse para caracterizar funcionalmente enzimas candidato y reconstruir las vías de biosíntesis de metabolitos natural importantes. Igualmente, también puede ser explotada en enfoques biosíntesis combinatorios triterpeno nuevos productos, una estrategia que puede resultar en bibliotecas de análogos estructuralmente relacionados, que permite la exploración sistemática de las relaciones estructura y actividad de plomo biológicamente activo, compuestos de8,9.
Agroinfiltration es un medio eficiente y simple para lograr la expresión transitoria en hojas de N. benthamiana . El proceso consiste en la infiltración de hojas con una suspensión de a. tumefaciens llevando la expresión binaria construct(s) de interés. Esto se logra mediante la aplicación de presión que fuerza el líquido a través de los estomas, desplazando el aire en el espacio intercelular y sustituirla por la suspensión de a. tumefaciens . La bacteria transferir las respectivas DNAs de T al interior de las células de la planta, dando por resultado la expresión de la proteína localizada y transitoria en el tejido de la hoja infiltrada.
Mientras que cualquier vector binario adecuado para generar plantas transgénicas puede ser empleado para la expresión transitoria, utilizamos derivados del fríjol mosaico Virus CPMV Hypertranslational (HT) proteína expresión sistema10, 11. en este sistema el gen de interés es flanqueado por regiones no traducidas (UTR) de CPMV RNA-2. El UTR 5' contiene modificaciones dando como resultado niveles muy elevados de la traducción de la proteína con ninguna dependencia de la replicación viral12. Esta técnica se ha convertido en la serie de vector binario de fácil y rápido (pEAQ) que incluye la recombinación específica del sitio clonación compatible con protocolo de construcciones (pEAQ -HT- DEST)10,11. La mayoría pEAQ vectores contienen también un tomate achaparramiento arbustivo derivado de virus P19 silenciamiento supresor gen13 dentro de la porción del T-ADN del cassette de expresión, que evita la necesidad de coinfiltrate una cepa de P19-llevar separada y es muy expresión de proteínas de alto nivel en la sede de la planta celular10,11.
El uso de N. benthamiana como un anfitrión de expresión tiene ventajas particulares cuando se trabaja con vías biosintéticas de la planta. La arquitectura de la célula apoya intrínsecamente correspondiente mRNA y proteína procesamiento y compartimentación adecuada, además de poseer la necesarias Co-enzimas, reductasas (para CYP450s) y precursores metabólicos. La fuente de carbono es la fotosíntesis; así, simplemente pueden cultivarse plantas en compost de buena calidad, que requieren sólo agua, CO2 (desde el aire) y la luz del sol como entradas. La plataforma es también muy conveniente para la expresión de diferentes combinaciones de proteínas, como esto puede lograrse suelen Co la infiltración de diferentes cepas de a. tumefaciens, negando la necesidad de construir grandes expresión multigénica cassettes. Además, el proceso puede ser linealmente y confiablemente escala simplemente incrementando el número de plantas utilizadas en el experimento.
Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado la utilidad de esta plataforma de experimentos escala preparativa. Esto incluye la preparación de nuevos triterpenos para uso en ensayos de bioactividad y escala hasta alcanzar cantidades de gramo del producto aislado. Además, se puede aumentar la acumulación de productos heterogéneos triterpeno varios doblan coexpresión de una forma truncada N-terminal, insensible a la retroalimentación de la 3-hidroxi, 3-methyglutary-coenzima A reductasa (tHMGR), una limitación de velocidad por aguas arriba enzima en el camino de mevalonate8.
Clave para tales experimentos escala preparativo es capaz convenientemente para arriba-escala el proceso de infiltración. En un experimento típico, se requiera decenas a cientos de plantas para lograr la cantidad de destino del producto aislado. Infiltración de hojas individuales a mano (utilizando una jeringa no hace falta) es operacionalmente exigente y a menudo prohibitivo desperdiciador de tiempo, haciendo este método impráctico para escala-para arriba rutinario. Infiltración vacío ofrece ventajas sobre la infiltración de la mano, ya que no es dependiente en el nivel de habilidad del operador y permite la infiltración de una mayor área de la superficie foliar. Este procedimiento se utiliza comercialmente para la producción a gran escala de proteínas farmacéuticas14. Este protocolo utiliza un aparato de infiltración vacío fácilmente replicables, que puede construirse de piezas disponibles en el mercado. Esto permite la infiltración simultánea de hasta 4 plantas, con infiltración batch-wise rápida y práctica de cientos de plantas en un corto periodo de tiempo (Figura 2a -2b). El aparato de vacío de infiltración consiste en un horno de vacío que forma la cámara de infiltración (figura 2f). El horno está conectado a una bomba a través de un depósito vacío. Esto reduce considerablemente el tiempo necesario para lograr el vacío deseado en la cámara de infiltración. Las plantas son garantizadas en un soporte a medida e invertidas en un baño de agua de acero inoxidable de 10 L con suspensión de a. tumefaciens (Figura 2a -2 c). Inmersión completa de las partes aéreas de las plantas es importante infiltración eficiente. El baño de agua se coloca dentro de la cámara de infiltración (Figura 2d -2e) y el vacío aplicado para dibujar el aire de los espacios intersticiales de la hoja. Una vez que la presión se ha reducido en 880 mbar (un proceso que toma aproximadamente 1 minuto) la cámara de infiltración vuelva rápidamente a la presión atmosférica 20-30 s con la apertura de la válvula de entrada del horno, con lo cual la infiltración es completa.
Cinco días después de la infiltración el material vegetal está listo para la cosecha y la posterior extracción y aislamiento del producto deseado. Desde este punto el proceso es simplemente uno de los productos naturales extracción y purificación a partir de material de la hoja, un flujo de trabajo que es familiar a cualquier químico de productos naturales. Muchos diversos métodos de extracción inicial y posterior purificación existen15. La opción más adecuada de los métodos y las condiciones exactas que se utiliza es altamente dependiente de las propiedades químicas del compuesto de interés, además de la disponibilidad de destrezas y/o equipo. No es posible incluir en este protocolo un método totalmente generalizable, paso a paso para la transformación aguas abajo de la hoja cosechada de la planta al producto aislado que podría seguir ciegamente cualquier producto triterpeno de interés, ni sería apropiado para intentar hacerlo. Sin embargo, este protocolo proporcionará una visión general del flujo de trabajo básico utilizado en nuestro laboratorio y algunos métodos para las primeras etapas del proceso, que en nuestra experiencia han demostrado ser generalizables para los productos de triterpeno aglicona más oxigenados. Esto incluye dos técnicas relativamente poco común, es decir, extracción de solvente presurizado (PSE) y un método conveniente de fase heterogénea para eliminación de clorofila usando una resina de intercambio iónico fuertemente básico.
PSE es una técnica muy eficiente para la extracción de pequeñas moléculas orgánicas de matrices sólidas. Las extracciones se realizan bajo presión (ca. 100-200 bar), la principal ventaja es la habilidad de usar temperaturas aliviadas que excedan el punto de ebullición punto del solvente de extracción. Esto puede reducir significativamente el tiempo y la cantidad de disolvente necesaria para lograr una extracción exhaustiva, en comparación con otras técnicas solvente caliente como reflujo simple o de extracciones Soxhlet16. Comercial Banco PSE instrumentos están disponibles, que utilizan las células de extracción intercambiables y solvente automatizado manejo, calefacción y control. Esto hace que esta técnica muy conveniente. También es sin duda menos peligroso, particularmente para los operadores con experiencia de química práctica limitada.
Saponificación de los extractos de hoja cruda bajo seguido de partición líquido/líquido de reflujo es una técnica común para el retiro a granel de clorofilas antes de purificación posterior o análisis. Sin embargo, esto puede a menudo ser operacionalmente exigentes en escalas más grandes. Además, la detección de la interfaz, o pérdida del producto debido a la formación de emulsiones puede ser problemática. El uso de resinas de intercambio iónico fuertemente básico para llevar a cabo la hidrólisis de fase heterogénea puede servir como una alternativa conveniente. La porción pigmentada de la clorofila hidrolizada permanece adherida a la resina y puede eliminarse simplemente por filtración. Este protocolo utiliza una adaptación de la escala preparativa de un procedimiento analítico previamente divulgados17 que emplea una resina de intercambio iónico básicas disponibles en el mercado.
A continuación se describe un protocolo detallado y rápido para la producción a escala preparativa de triterpenos utilizando esta plataforma basada en plantas. Este protocolo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para preparar decenas hasta cientos de miligramos de producto triterpeno aislado para aplicaciones tal una caracterización por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), o estudiar más funcional ensayos.

<table><tbody><tr><td>Instrumento GC-MS</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador adecuado para realizar reacciones de PCR</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de desplazamiento de aire ajustable (Tamaños: 1000 y micro; L, 200 y micro; L, 100 y micro; L, 20 y micro; L, 10 y micro; L, y 2 y micro; L )</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Portador de nitrógeno líquido de parte superior ancha (tamaño: 2 L)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa (Capacidad: 24 x 1,5/2 ml, Velocidad máx.: =/> 15000 rpm)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa (Capacidad: 20 x 50 mL, Velocidad máx.: =/> 4000 rpm)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de pie grande (Capacidad: 4 x 1 L, Velocidad máxima: =/> 4000 rpm)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de pie</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitadora (Tamaños de la abrazadera del matraz: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de centrífuga (1 L)</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de infiltración al vacío</td><td>a medida</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Macetas de 9 x 9 cm</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de liofilización (=/> capacidad del condensador de 8 litros)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 con celdas de extracción de 120 mL (instrumento PSE)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Aparato evaporador rotativo</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de evaporación (Tamaños: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de Duran (Tamaños: 1 L, 10 L)</td><td>cualquiera</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>Matraces cónicos (tamaños 100 mL, 2 L)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Espátulas (tamaños variados)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica (5 figuras)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balanza (2 figuras)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros de medición (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 congelador</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Biotage Isolera con gradilla de recogida de 250 mL y frascos (instrumento de cromatografía flash automatizado</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Gafas de seguridad</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bata de laboratorio</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Consumibles</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta (Tamaños: 1000 y micro; L, 200 y micro; L, 100 y micro; L, 20 y micro; L, 10 y micro; L, y 2 y micro; L )</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (Tamaño: 2 mL)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (Tamaños: 15 mL, 50 mL)</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables (tamaño 2 mL)</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (Tamaño: 100 mL)</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; SNAP KP-SIL 100 g cartuchos flash</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>Viales de HPLC (1 mL), insertos y tapones de viales</td><td>cualquiera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Guantes desechables de nitrilo morado</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior para E-914, celulosa</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de fondo para E-916 / 914, fibra de vidrio</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><fuerte> Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arena de cuarzo, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (tierra de diatomeas)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílice 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)-etanessulfónico</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-dimetoxi-4'-acetofenona (acetosiringa)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>MP biomédicos</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; Hidróxido 900 (resina básica de intercambio iónico)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher H</td><td>/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q agua</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>cualquier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (kit de purificación de plásmidos).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Proveedor competente de E. coli</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>vector pEAQ-HT-DEST1</td><td>Laboratorio Lomonossoff Centro John Innes</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (protocolo de clonación de recombinación específica del sitio)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASA (tm) II ENZYME MIX (protocolo de clonación de recombinación específica del sitio)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION ADN POLIMERASA DE ALTA FIDELIDAD</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNASE LIBRE DE ARNANA</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III Sistema de síntesis de primera hebra</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana Benthamiana Seeds</td><td>Cualquier proveedor de renombre</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

expresión transitoria en nicotiana benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Los triterpenos son uno de los más grandes y más familias estructuralmente diversas de productos naturales. Muchos derivados triterpénicos han demostrado poseer actividad biológica medicinal relevante. Sin embargo, hasta ahora este potencial no se ha traducido en una gran cantidad de medicamentos derivados de triterpenos en la clínica. Podría decirse que se trata (al menos parcialmente) una consecuencia de acceso sintético práctico limitado a esta clase de compuesto, un problema que puede sofocar la exploración de las relaciones estructura-actividad y desarrollo de llevar candidatos por tradicionales medicinales flujos de trabajo de química. A pesar de su inmensa diversidad, triterpenos todos derivan de un único precursor lineal, oxidosqualene 2.3. Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en N. benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno que no son producidos naturalmente por este host. Infiltración del agro es un medio eficiente y simple para lograr la expresión transitoria en N. benthamiana. El proceso consiste en la infiltración de hojas de las plantas con una suspensión de Agrobacterium tumefaciens llevando la construct(s) de expresión de interés. La infiltración de un adicional de a. tumefaciens cepa lleva una construcción de expresión codificación enzima que aumenta el suministro de precursores significativamente aumenta los rendimientos. Después de un período de cinco días, el material de hoja infiltrada puede cosechado y procesado para extraer y aislar los productos resultantes del triterpeno. Este es un proceso que es linealmente y confiablemente escalable, simplemente incrementando el número de plantas utilizadas en el experimento. Es en este documento se describe un protocolo para la rápida producción a escala de preparativo de triterpenos utilizando esta plataforma basada en plantas. El protocolo utiliza un aparato de vacío fácilmente replicable de la infiltración, que permite la infiltración simultánea de hasta cuatro plantas, lo que permite la infiltración batch-wise de cientos de plantas en un corto período de tiempo.

Típicos rendimientos aislados dependen de la combinación de la enzima enzimático bajo investigación, la estabilidad química del compuesto blanco, y como desafiando el proceso de purificación fue. Hemos divulgado previamente aislada producción de β-amirina derivados de nuestros experimentos de biosíntesis combinatoria desde 0.12 hasta 3,87 mg por gramo de polvo de hoja de N. benthamiana seco. Estos compuestos se extendieron ampliamente en el nivel de oxidación e incluyen la combinación natural de enzimas (figura 3)8. Este protocolo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para producir decenas o centenares de miligramos del producto purificado para la caracterización por espectroscopia RMN y análisis funcionales descendentes. También hemos demostrado la utilidad preparativa de esta plataforma mediante la producción de 0.8 g de triterpeno andamio β-amirina en una pureza superior al 98%. Este experimento utiliza 459 plantas y representa una producción aislada de 3,3 mg por gramo de seco N. benthamiana de la hoja en polvo8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figura 1: esquema Resumen. Representación esquemática del proceso de explotación de la expresión transitoria de las enzimas biosintéticas en hojas de N. benthamiana desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción preparación de nuevos productos de alto valor triterpeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figura 2: construcción infiltrado y proceso de vacío un) A medida separada de una ala planta titular. alas de b) Bespoke planta titular adjuntadas. c) la inversión y la inmersión de las plantas. d) inserción de la bañera de infiltración. baño e) infiltración en lugar dentro de la cámara de infiltración. infiltrado vacío f) completo: bomba de vacío (1) (2) conexión de bomba de vacío a la válvula de aislamiento de depósito depósito vacío vacío (3) (4) conexión entre depósito vacío y la válvula de admisión de aire del calibrador de presión (5) (6) infiltración cámara (7) Tanque de vacío de cámara (8) infiltración. g) representante sale de una planta que se infiltraron con una construcción de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) después crecimiento de infiltración después de cinco días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figura 3: previamente divulgados resultados representativos para la producción de preparación de derivados de la β-amirina usando este protocolo8. Esta tabla se ordena por producciones aisladas. Formatean condicional de columnas con indicación del valor relativo del color. Rojo = alto, verde = bajo (aunque intermedio amarillo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Este protocolo permite un cómodo acceso a escala preparatoria a los compuestos triterpénicos para su uso en estudios posteriores, como la caracterización estructural o la expiración de la actividad biológica médicamente relevante. El protocolo es rápido, escalable y permite utilizar combinaciones de enzimas simplemente mediante la co-infiltración de diferentes cepas de Agrobacterium, lo que niega la necesidad de construir grandes vectores multigénicos. Para empezar, inocule una placa de agar LB selectiva con rayas de las cepas deseadas de Agrobacterium tumefaciens procedentes de cultivos de células madre de glicerol.Incube la placa durante la noche a 28 grados centígrados en una incubadora de pie. Al día siguiente, inocule individualmente 50 mililitros de medio LB selectivo con una muestra de cada cepa de Agrobacterium tumefaciens. Incubar el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados en una incubadora agitadora a 200 rpm.Transfiera individualmente los cultivos de 50 mililitros a 1.000 mililitros de medio LB selectivo e incube durante la noche a 28 grados centígrados en la incubadora agitadora a 200 rpm. Al día siguiente, granular individualmente el Agrobacterium tumefaciens de los cultivos líquidos por centrifugación a 4.000 veces g. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender individualmente los gránulos en 50 mililitros de tampón MMA recién preparado.Incubar los gránulos resuspendidos a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Ahora, determine el volumen apropiado de cada suspensión de MMA de Agrobacterium tumefaciens para producir un OD final 600 de al menos 0,2 en un volumen final total de 10 litros. Combina los volúmenes determinados de cada suspensión.Ahora, agregue tampón MMA adicional a las suspensiones combinadas hasta un volumen final de un litro, que se utilizará inmediatamente para la infiltración al vacío. Transfiera el litro de suspensión de infiltración y el litro de tampón MMA de 10 veces más fuerza al baño de infiltración, seguido de ocho litros adicionales de agua. Retire las alas desmontables del portaplantas hecho a medida.Inserte cuatro plantas de cinco semanas de edad que se hayan cultivado como se describe en el protocolo de texto y vuelva a colocar las alas. La cobertura de infiltración se ve comprometida si las hojas no están completamente sumergidas en la suspensión de infiltración. Este problema se minimiza asegurando que el nivel de la suspensión llegue a la superficie superior del soporte de la planta antes del tratamiento al vacío.Invierta el soporte y colóquelo encima del baño de infiltración para sumergir las hojas en la suspensión de infiltración. Transfiera el baño de infiltración con plantas sumergidas a la cámara de infiltración y cierre la puerta. Asegúrese de que la válvula de entrada de aire esté cerrada en el infiltrado.Después de encender la bomba de vacío, abra la válvula de admisión de vacío en la cámara de infiltración. Una vez que la presión en la cámara de infiltración se haya reducido en 880 milibares, cierre la válvula de admisión de vacío y abra la válvula de entrada de aire. Al volver a la presión atmosférica, abra la puerta y retire el baño de infiltración.Ahora, levante el soporte de la planta hasta que las plantas ya no estén sumergidas en la suspensión de infiltración. Luego, agite suavemente el soporte para permitir que el exceso de suspensión se escurra de las hojas y regrese al baño de infiltración. Finalmente, vuelva a colocar el soporte en posición vertical, retire las alas desmontables y retire las plantas.Cultive las plantas infiltradas durante cinco días a 25 grados centígrados en 16 horas por día de luz con riego diario. Después de cinco días de crecimiento, coseche las hojas y luego séquelas como se describe en el protocolo de texto. Muele las hojas secas hasta convertirlas en un polvo grueso a través de un método conveniente, como usar un procesador de alimentos doméstico o triturar manualmente las hojas mientras están contenidas dentro de una bolsa.Mezcle el polvo de hojas con arena de cuarzo en un recipiente adecuado. Esto actúa como dispersante y mejora la eficiencia del proceso de extracción. Ahora, prepare cuatro celdas de extracción para el llenado invirtiéndolas primero.Luego, inserte el filtro de fibra de vidrio, seguido de la frita de metal y el tapón de sujeción. Regrese las celdas de extracción a la posición vertical y agregue una capa de arena de cuarzo de un centímetro de profundidad. Llene las celdas de extracción con el polvo de hojas preparado hasta la línea de llenado.Si es necesario, comprima suavemente el polvo durante este proceso para facilitar la adición de una mayor cantidad en cada celda de extracción. Ahora, agregue una pequeña capa de arena de cuarzo en la parte superior del polvo empaquetado e inserte el filtro de celulosa superior. Inserte las celdas de extracción empaquetadas en el instrumento de extracción con solvente presurizado y ejecute el método deseado.Una vez completado el método, concentre el licor de extracción combinado hasta la sequedad mediante evaporación rotativa al vacío, como se detalla en el protocolo de texto. Compruebe la producción esperada de una suspensión de color verde oscuro. Para eliminar las clorofilas, utilizando resina básica de intercambio iónico, primero disuelva el extracto crudo en un volumen mínimo de etanol.Añade 50 mililitros de perlas básicas de resina de intercambio iónico a la solución resultante. Luego, agite a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añade 50 mililitros adicionales de perlas básicas de resina de intercambio iónico cada 30 minutos hasta que la reacción se haya completado.Al principio, las perlas básicas de resina de intercambio iónico son de color rosa y la fase líquida es verde. A medida que avanza la reacción, las perlas de resina cambian a verde y la fase líquida a naranja o a un color marrón turbio, dependiendo de la escala. Filtre la mezcla de reacción a través de una columna corta de tierra de diatomeas a través de una columna de cromatografía flash de vidrio, utilizando fuelles manuales para aplicar presión.Enjuague las perlas de resina recolectadas con etanol, seguido de etanol uno a uno a hexano y, finalmente, con hexano. Utilice un volumen de enjuague suficiente para volver a suspender las perlas en la parte superior de la columna de tierra de diatomeas. Finalmente, combine el filtrado, los enjuagues y el concentrado hasta la sequedad por evaporación rotativa al vacío.Aquí se muestra una imagen de las hojas de una planta infiltradas con una construcción de expresión para la proteína fluorescente GFP después de cinco días de crecimiento posterior a la infiltración. Esto ilustra el alcance de la cobertura de infiltración que se puede esperar. Las hojas están dispuestas desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior derecha de la imagen en orden descendente, con respecto a su altura original en la planta.Esta imagen representa 0,8 gramos de beta-amirina producida mediante este protocolo, que tiene una pureza superior al 98%. El experimento se llevó a cabo a escala de 459 plantas y representa un rendimiento aislado de 3,3 miligramos por gramo de material foliar seco. Al intentar este protocolo, es importante recordar que solo las hojas infiltradas producirán su compuesto de interés.Por lo tanto, es ventajoso cosechar selectivamente estas hojas cuando sea posible para evitar la dilución de su muestra con tejido improductivo. Los pasos posteriores a la cosecha en este protocolo se proporcionan con fines ilustrativos. Pueden ser sustituidos por otras técnicas de purificación de extracción de productos naturales dependiendo de la disponibilidad de experiencia y/o instalaciones en su institución.Descubrimos que el tratamiento básico con resina de intercambio iónico presentado en este protocolo es una alternativa conveniente a la saponificación más tradicional seguida de la partición líquido/líquido para la eliminación de clorofilas a mayor escala. Antes de seguir este protocolo, debe familiarizarse con los datos de seguridad de los materiales para todas las sustancias utilizadas y tomar las precauciones de seguridad adecuadas. La legislación local relativa al trabajo con material transgénico debe ser revisada y observada, incluyendo el seguimiento de los procedimientos de contención apropiados.

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