Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Este protocolo permite un cómodo acceso a escala preparatoria a los compuestos triterpénicos para su uso en estudios posteriores, como la caracterización estructural o la expiración de la actividad biológica médicamente relevante. El protocolo es rápido, escalable y permite utilizar combinaciones de enzimas simplemente mediante la co-infiltración de diferentes cepas de Agrobacterium, lo que niega la necesidad de construir grandes vectores multigénicos. Para empezar, inocule una placa de agar LB selectiva con rayas de las cepas deseadas de Agrobacterium tumefaciens procedentes de cultivos de células madre de glicerol.

Incube la placa durante la noche a 28 grados centígrados en una incubadora de pie. Al día siguiente, inocule individualmente 50 mililitros de medio LB selectivo con una muestra de cada cepa de Agrobacterium tumefaciens. Incubar el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados en una incubadora agitadora a 200 rpm.

Transfiera individualmente los cultivos de 50 mililitros a 1.000 mililitros de medio LB selectivo e incube durante la noche a 28 grados centígrados en la incubadora agitadora a 200 rpm. Al día siguiente, granular individualmente el Agrobacterium tumefaciens de los cultivos líquidos por centrifugación a 4.000 veces g. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender individualmente los gránulos en 50 mililitros de tampón MMA recién preparado.

Incubar los gránulos resuspendidos a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Ahora, determine el volumen apropiado de cada suspensión de MMA de Agrobacterium tumefaciens para producir un OD final 600 de al menos 0,2 en un volumen final total de 10 litros. Combina los volúmenes determinados de cada suspensión.

Ahora, agregue tampón MMA adicional a las suspensiones combinadas hasta un volumen final de un litro, que se utilizará inmediatamente para la infiltración al vacío. Transfiera el litro de suspensión de infiltración y el litro de tampón MMA de 10 veces más fuerza al baño de infiltración, seguido de ocho litros adicionales de agua. Retire las alas desmontables del portaplantas hecho a medida.

Inserte cuatro plantas de cinco semanas de edad que se hayan cultivado como se describe en el protocolo de texto y vuelva a colocar las alas. La cobertura de infiltración se ve comprometida si las hojas no están completamente sumergidas en la suspensión de infiltración. Este problema se minimiza asegurando que el nivel de la suspensión llegue a la superficie superior del soporte de la planta antes del tratamiento al vacío.

Invierta el soporte y colóquelo encima del baño de infiltración para sumergir las hojas en la suspensión de infiltración. Transfiera el baño de infiltración con plantas sumergidas a la cámara de infiltración y cierre la puerta. Asegúrese de que la válvula de entrada de aire esté cerrada en el infiltrado.

Después de encender la bomba de vacío, abra la válvula de admisión de vacío en la cámara de infiltración. Una vez que la presión en la cámara de infiltración se haya reducido en 880 milibares, cierre la válvula de admisión de vacío y abra la válvula de entrada de aire. Al volver a la presión atmosférica, abra la puerta y retire el baño de infiltración.

Ahora, levante el soporte de la planta hasta que las plantas ya no estén sumergidas en la suspensión de infiltración. Luego, agite suavemente el soporte para permitir que el exceso de suspensión se escurra de las hojas y regrese al baño de infiltración. Finalmente, vuelva a colocar el soporte en posición vertical, retire las alas desmontables y retire las plantas.

Cultive las plantas infiltradas durante cinco días a 25 grados centígrados en 16 horas por día de luz con riego diario. Después de cinco días de crecimiento, coseche las hojas y luego séquelas como se describe en el protocolo de texto. Muele las hojas secas hasta convertirlas en un polvo grueso a través de un método conveniente, como usar un procesador de alimentos doméstico o triturar manualmente las hojas mientras están contenidas dentro de una bolsa.

Mezcle el polvo de hojas con arena de cuarzo en un recipiente adecuado. Esto actúa como dispersante y mejora la eficiencia del proceso de extracción. Ahora, prepare cuatro celdas de extracción para el llenado invirtiéndolas primero.

Luego, inserte el filtro de fibra de vidrio, seguido de la frita de metal y el tapón de sujeción. Regrese las celdas de extracción a la posición vertical y agregue una capa de arena de cuarzo de un centímetro de profundidad. Llene las celdas de extracción con el polvo de hojas preparado hasta la línea de llenado.

Si es necesario, comprima suavemente el polvo durante este proceso para facilitar la adición de una mayor cantidad en cada celda de extracción. Ahora, agregue una pequeña capa de arena de cuarzo en la parte superior del polvo empaquetado e inserte el filtro de celulosa superior. Inserte las celdas de extracción empaquetadas en el instrumento de extracción con solvente presurizado y ejecute el método deseado.

Una vez completado el método, concentre el licor de extracción combinado hasta la sequedad mediante evaporación rotativa al vacío, como se detalla en el protocolo de texto. Compruebe la producción esperada de una suspensión de color verde oscuro. Para eliminar las clorofilas, utilizando resina básica de intercambio iónico, primero disuelva el extracto crudo en un volumen mínimo de etanol.

Añade 50 mililitros de perlas básicas de resina de intercambio iónico a la solución resultante. Luego, agite a temperatura ambiente durante 30 minutos. Añade 50 mililitros adicionales de perlas básicas de resina de intercambio iónico cada 30 minutos hasta que la reacción se haya completado.

Al principio, las perlas básicas de resina de intercambio iónico son de color rosa y la fase líquida es verde. A medida que avanza la reacción, las perlas de resina cambian a verde y la fase líquida a naranja o a un color marrón turbio, dependiendo de la escala. Filtre la mezcla de reacción a través de una columna corta de tierra de diatomeas a través de una columna de cromatografía flash de vidrio, utilizando fuelles manuales para aplicar presión.

Enjuague las perlas de resina recolectadas con etanol, seguido de etanol uno a uno a hexano y, finalmente, con hexano. Utilice un volumen de enjuague suficiente para volver a suspender las perlas en la parte superior de la columna de tierra de diatomeas. Finalmente, combine el filtrado, los enjuagues y el concentrado hasta la sequedad por evaporación rotativa al vacío.

Aquí se muestra una imagen de las hojas de una planta infiltradas con una construcción de expresión para la proteína fluorescente GFP después de cinco días de crecimiento posterior a la infiltración. Esto ilustra el alcance de la cobertura de infiltración que se puede esperar. Las hojas están dispuestas desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior derecha de la imagen en orden descendente, con respecto a su altura original en la planta.

Esta imagen representa 0,8 gramos de beta-amirina producida mediante este protocolo, que tiene una pureza superior al 98%. El experimento se llevó a cabo a escala de 459 plantas y representa un rendimiento aislado de 3,3 miligramos por gramo de material foliar seco. Al intentar este protocolo, es importante recordar que solo las hojas infiltradas producirán su compuesto de interés.

Por lo tanto, es ventajoso cosechar selectivamente estas hojas cuando sea posible para evitar la dilución de su muestra con tejido improductivo. Los pasos posteriores a la cosecha en este protocolo se proporcionan con fines ilustrativos. Pueden ser sustituidos por otras técnicas de purificación de extracción de productos naturales dependiendo de la disponibilidad de experiencia y/o instalaciones en su institución.

Descubrimos que el tratamiento básico con resina de intercambio iónico presentado en este protocolo es una alternativa conveniente a la saponificación más tradicional seguida de la partición líquido/líquido para la eliminación de clorofilas a mayor escala. Antes de seguir este protocolo, debe familiarizarse con los datos de seguridad de los materiales para todas las sustancias utilizadas y tomar las precauciones de seguridad adecuadas. La legislación local relativa al trabajo con material transgénico debe ser revisada y observada, incluyendo el seguimiento de los procedimientos de contención apropiados.