Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro

Se describen tres métodos experimentales para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de químicos in vitro: cuantificación del contenido 2) melanina y actividad tirosinasa 1) celular y 3) medición de la melanina por análisis de imagen y coloración celular melanina.

Este método puede ser útil en el desarrollo de cosméticos funcionales y agentes de la piel con actividades anti-melanogénicas. Está ahí para realizar y el resultado se puede obtener rápidamente. Además, este método puede ser útil para los investigadores, que quieren identificar o investigar los efectos o los compuestos o investigar las actividades antimelanogénicas o promelanogénicas.

Para medir la actividad tirosinasa comenzar por la siembra de melanicidas B16-F10 a cinco veces 10 a las cuartas células por pozo de una concentración de placa de 24 pozos en medio completo durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, reemplazar el sobrenadante en cada pozo con DMEM complementado con compuesto de prueba recién preparado y control de inhibidores o un control negativo y devolver la placa a la incubadora durante otras 72 horas. Al final del tratamiento enjuague los pozos dos veces con 300 microlitros de pbs fríos por pozo y coloque la placa sobre hielo.

A continuación, agregue 300 microlitros de búfer de lelisis a cada pozo usando un rascador de celda para recoger las lesates celulares después de cinco minutos. Transfiera las suspensiones de partículas celulares resultantes a tubos individuales de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Y homogeneizar los lysates tres veces durante dos segundos a 14.500 rpm en hielo para liberar la tirosinasa intercelular.

Pele el pelado de los desechos celulares por centrifugación y transfiera los sobrenadantes a tubos individuales de centrífuga de 1,5 mililitros sobre hielo. Asigne 70 microlitros de cada sobrenadante a pozos individuales de una microplaca clara de 96 pozos de poliestireno y agregue 140 microlitros de solución de sustrato de tirosinasa a cada pozo de sobrenadante. Agitar la placa suavemente para mezclar el contenido del pozo.

Luego incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos horas. Y mida la actividad de la tirosinasa a 475 nanómetros en un lector de microplacas. Medir el contenido de melanina de las células después de recoger el el izado de las células tratadas como se demuestra.

Recoger los lysates por centrifugación y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos. Añadir 300 microlitros de un hidróxido de sodio normal a cada pellet para una incubación de una hora a 60 grados centígrados. Seguido por centrifugación de las suspensiones de células disueltas.

A continuación, transfiera 200 microlitros de los sobrenadantes a cada pozo de una placa de 96 pozos. Y mida el contenido de melanina en un lector de microplacas a una longitud de onda de 400 nanómetros. Para la tinción Fontana-Masson, lave las células tratadas dos veces con 300 microlitros de pbs fríos y fije las células con 200 microlitros de 10% de formol durante una hora a cuatro grados centígrados.

Enjuague las células gruesas con agua destilada y agregue 200 microlitros de 58 a 68 grados centígrados Solución de trabajo de plata amoniacal a cada pozo. Durante una hora de incubación a 37 grados centígrados o hasta que las células se vuelvan de color amarillo-marrón. Enjuague las células manchadas con agua destilada seguida de una incubación de dos minutos en cloruro de oro al 0,1% a temperatura ambiente.

Enjuague las células tratadas con cloruro de oro con agua destilada y agregue 200 microlitros de solución de tiosulfato sódico a las células. Después de dos minutos enjuague las células de nuevo. Y etiqueta las células con 200 microlitros de rojo rápido nuclear por pozo durante cinco minutos.

A continuación, lave las células manchadas con agua del grifo antes de tomar imágenes bajo un microscopio de luz. Para el análisis de umbral, abra las imágenes en la imagen J y seleccione imagen, ajuste y umbral de color. Para medir el área teñida con Fontana Masson, establezca la barra de parámetros de brillo en cero y ajuste el brillo hasta el punto en el que se incluyen todas las celdas manchadas negras o marrones.

Seleccione Analizar y analizar partículas y marque la casilla de resumen en la ventana Analizar partículas y, a continuación, haga clic en Aceptar para obtener un resumen de los resultados y copiar y pegar los datos en una hoja de cálculo. El tratamiento con arbutina suprime significativamente la actividad celular de la tirosinasa en comparación con el control de las células tratadas por el vehículo. Del mismo modo, el contenido de melanina de las células estimuladas con Arbutin se reduce significativamente en comparación con los controles.

Aunque las células son morfológicamente similares entre los grupos de tratamiento, Arbutin disminuye el área del pigmento negro en comparación con las células tratadas por control. Este método es útil para la selección de actividades utilizando nuestra biblioteca compuesta. Hay más de cientos de muestras para ser probadas rápidamente.

Además, este método también se puede utilizar para investigar el mecanismo que implica melanogénesis. Después de identificar los compuestos de los candidatos bioactivos, por su testimonio al estudio de mecanismos biológicos o aplicaciones comerciales.