Name: Generación de vectores recombinantes Herpesvirus aviar con CRISPR/Cas9 Gene edición (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprenda a generar vectores recombinantes de Herpesvirus aviar con edición génica CRISPR/Cas9 y sistema Cre-Lox. Este método permite desarrollar vacunas multivalentes para la industria avícola.

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Los autores agradecen a Pippa Hawes por ayudar con la proyección de imagen confocal. Este proyecto fue apoyado por la biotecnología y Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC) otorga municiones/E/I/00007034 y L014262/BB/1.

1. preparación de Cas9/gRNA expresión y donantes construye
<ol><li>
Construcción de plásmidos de expresión Cas9/gRNA
	<ol>
<li>Diseño de una secuencia de gRNA focalización región intergénica entre genes UL45 y UL46 de HVT como se describió anteriormente22. Alinear la secuencia Diana de ARN guía contra el genoma HVT para descartar cualquier potencial objetivo las secuencias en el genoma HVT. Sintetizar y clonar la secuencia de gRNA dirigidos a región UL45/46 y sg-una secuencia de datos publicados23 en pX459-V2 como se describió anteriormente22. Verificar la secuencia de gRNA clonados por Sanger secuenciación utilizando la cartilla de U6-Fwd24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construcción del plásmido donante
	<ol>
<li>Para generar un plásmido donante que contiene el cassette de expresión VP2 etiquetado con una cinta extraíble de reportero GFP, diseño de oligos F donantes y donantes-R que contiene los siguientes elementos (figura 1A y figura 3A): una sg-A secuencia de la blanco en los extremos, un sitio de PacI flanqueada por dos secuencias LoxP para la clonación de cassette de reportero GFP y supresión y dos sitios de SfiI para la clonación de la cassette de expresión VP2.</li>
		<li>Clon de la secuencia en un vector pGEM-T easy y, luego, copia los cassettes de gene GFP y VP2 en el vector resultante para generar el plásmido donante designado como pGEM-sgA-GFP-VP222. Nota: Cualquier vector de clonación se puede utilizar para construir el plásmido donante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de DNA plasmídico
	<ol>
<li>Preparación de plásmido donante y plásmido de expresión Cas9/gRNA DNAs utilizando un kit comercial de extracción de ADN según las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-mediada Knock-in: transfección e infección
<ol><li>Preparan el día antes de transfección, fibroblastos de embrión de polluelo (general) para la infección de la transfección, 10 - día viejo embriones en medio M199 suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 5%, 10% triptosa fosfato caldo, 100 U/mL penicilina-estreptomicina, y 0.25 μg/mL fungizone. Células por pozo en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 2,5 mL de medio en semilla 1.3 x 106 . Nota: Las células CEF pueden conservarse d 3 a 4 ° C.</li>
	<li>Transfectar células CEF (preparado en paso 2.1) con 0,5 μg de UL45/46-gRNA, 0.5 μg de sg-A y 1 μg de pGEM-sgA-GFP-VP2 utilizando un reactivo de transfección adecuada según las instrucciones del fabricante. Incube las células por 12 h en una incubadora (a 38,5 ° C con 5% CO2).</li>
	<li>posttransfection de 12 h de Cas9/gRNA y donante plásmidos, diluir la acción de virus HVT con medio de cultivo M199 a 1 x 105 pfu/mL. Agregar 130 μl del virus diluido en cada pocillo de las células transfected y establecer una así de las células untransfected como un control negativo con la misma cantidad de virus. Incube las células transfected/infectados de 3 d a 38,5 ° C con 5% CO2. Llevar a cabo todos los procedimientos con el código de práctica conjunta (JCoPR) aprobado por los patrocinadores.</li>
</ol>3. cosecha y purificación HVT recombinante del Virus de la
<ol><li>
Clasificación de células activado por fluorescencia
	<ol>
<li>Preparar dos placas de 96 pocillos preconfigurarse con 2 x 104 células de CEF por bien el día antes de la clasificación.</li>
		<li>Trypsinize d postinfection de transfected/infectados general 3. Aspire el medio de cada pozo y enjuague la capa celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA (0,48 mM) para trypsinize las células en la incubadora de 38,5 ° C durante aproximadamente 5 minutos.</li>
		<li>Suspender y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 50 μl de FBS. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender las células en 1 mL de PBS con 1% FBS. Contar el número de celular utilizando un hemocitómetro y ajustar el número de células 1 x 106 células/mL. Nota: Las células se pueden mantener en hielo durante 1-2 h.</li>
		<li>Transferir las células a un tubo a través de su tapa de filtro de clasificación de poliestireno. Ordenar las células expresando GFP en placas de 96 pocillos con general utilizando el clasificador de células según las instrucciones del fabricante. Incube las células ordenadas por 5 d a 38,5 ° C con 5% CO2. Nota: Un pasaje del virus recombinante puede ser necesaria antes de la clasificación si hay demasiadas células GFP expresión y algunas placas GFP-positivas en el pozo original.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pases de virus recombinantes
	<ol>
<li>Preparar placas de 6 pozos con 1.3 x 106 células CEF por bien el día antes de la aprobación. 5 d postsorting, verifique las placas de 96 pocillos con un microscopio de fluorescencia. Marque los pozos que contienen una sola placa GFP-positivas. Nota: Ver figura 2A para una placa representativa de GFP-positivas.</li>
		<li>Trypsinize cada GFP-positivas con 50 μl de tripsina-EDTA durante 3 min, agregar 50 μl de medio de cultivo, resuspender y transferir las células a un pozo de una placa de 6 pozos con general. Se trata de la primera generación de recombinantes HVT.</li>
		<li>La primera generación de virus recombinantes 3 d después de la cosecha, congelar por un frasco de cada uno en 1 mL de congelación medio suero de ternera fetal 10% que contiene (FCS), 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 80% medio de cultivo y almacenar los virus en nitrógeno líquido. Nota: El tiempo de cosecha varía de 2-4 d dependiendo de la capacidad de la cantidad y la proliferación del virus.</li>
		<li>Recoger 1 x 105 células de cada primera generación de virus, les de centrífuga y descarte el sobrenadante. Almacenar las células a-20 ° C para la extracción de ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de inserción genómica por reacción en cadena de polimerasa de
	<ol>
<li>Para la extracción de ADN, descongelar y resuspender el precipitado de células de paso 3.2.4 con 50 μl de buffer de exprimir (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl y 200 μg/mL proteinasa K) y lisar las muestras a 65 ° C por 30 min y , entonces, a 95 ° C por 2 min inactivar la proteinasa K.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con 3' Unión cebadores (tabla 1) con 1 μl de muestra de ADN. Para cada muestra, preparar la siguiente mezcla de reacción de 20 μl en el hielo: 2 x PCR Master Mix (10 μl), primer upstream de 10 μm (0.5 μl) 10 cartilla abajo μm (0.5 μl), plantilla de la DNA (1 μl) y agua libre de nucleasas (8 μL). El programa de amplificación: 95 ° C por 2 min; 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s y 72 ° C durante 40 s de 35 ciclos; 72 ° C por 7 min carga 2 μl de los productos de amplificación a un pocillo del gel de agarosa al 1% para electroforesis en gel. Nota: Ver figura 2A para obtener un resultado representativo de la PCR 3' ensambladura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. supresión del gen reportero fluorescente mediante el Cre-lox sistema
<ol><li>Para eliminar el gen GFP del virus recombinante, transfectar 2 μg de plásmido de expresión de recombinase de Cre en la placa de la pozo 6 preconfigurarse con células CEF, utilizando un reactivo de transfección siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>posttransfection 12 h, descongelar un vial de virus recombinantes de nitrógeno líquido, resuspender suavemente, sembrar 50 μL en cada pocillo de células transfected y establecer un pocillo como control negativo con la misma cantidad de virus. Incubar durante 3 d a 38,5 ° C con 5% CO2.</li>
</ol>5. placa purificación
<ol><li>
Clasificación de células activado por fluorescencia
	<ol>
<li>Placas de 96 pocillos dos semillas con 2 x 104 células de CEF por bien el día antes de la clasificación.</li>
		<li>Siga los procedimientos descritos en el postinfection de paso 3.1 72 h (del paso 4) para preparar las células infectadas para clasificar. Clasificar las células de nonfluorescence solo en placas de 96 pocillos con general.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pases del virus recombinantes y confirmación de PCR
	<ol>
<li>Elegir placas de nonfluorescence solo 5-10 5 d postsorting, trypsinize con 50 μl de tripsina-EDTA a 38,5 ° C por 3 min y añadir 50 μl de medio de cultivo para resuspender las células. Nota: Ver figura 2B para una placa representativa de GFP-negativo.</li>
		<li>Pasar la mitad de las células en cada pozo de una placa de 6 pozos preconfigurarse con general como la segunda generación.</li>
		<li>Centrifugar las células restantes de cada clon a 200 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células con 50 μl de exprimir el buffer de extracción de ADN.</li>
		<li>Realizar PCR con cebadores de empalme 5' (tabla 1) con 1 μl de la plantilla de la DNA con las mismas condiciones de reacción de PCR como se describe en el paso 3.3.2. Nota: Ver figura 2B para obtener un resultado representativo de 5' Unión PCR.</li>
		<li>Basado en los resultados PCR, elegir tres a cinco clones positivos de HVT recombinante más pasajes y verificación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. verificación de la HVT recombinante
<ol><li>
Análisis de la inmunofluorescencia indirecta
	<ol>
<li>Infectar el general con la segunda generación de recombinantes que HVT obtenido paso 5.2 en la placa de 24 pocillos sembrado con 2.5 x 105 general el día antes de la infección. Retire el postinfection de 48 h de medio de cultivo celular y agregar 500 μl de paraformaldehído al 4% en PBS para fijar las células. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 min, luego, retirar el fijador y lavar la capa de la célula 3 x con PBS. Nota: Las células pueden ser almacenadas a 4 ° C en este paso por varias semanas.</li>
		<li>Retirar el PBS y agregar 500 μl de 0,1% Tritón X-100 para permeabilizar las células durante 15 minutos Lave la celda capa 3 veces con PBS.</li>
		<li>Enlace no específico de bloque mediante la adición de solución amortiguadora de bloqueo (5% de suero bovino en PBS) durante 1 hora.</li>
		<li>Diluir el anticuerpo primario anti-VP2 monoclonal anticuerpo suero de pollo infectado HH7 o HVT a 1: 200 en solución amortiguadora de bloqueo, añada 200 μL por pozo e incubar a temperatura ambiente por 1 h. lavar la celda capa 3 veces con PBS.</li>
		<li>Diluir el anticuerpo secundario cabra anti-ratón IgG Alexa 568 o pollo contra cabra IgG Alexa 488 en 1: 200 en solución amortiguadora de bloqueo, añada 200 μL por pozo, incubar a temperatura ambiente durante 1 h y lavar las células 3 x con PBS. Controlar la expresión de la proteína bajo el microscopio de fluorescencia. Nota: Ver figura 4 para un representante VP2 resultado de tinción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secuencia del gene VP2
	<ol>
<li>Amplificar la secuencia de DNA que abarca la región intergénica UL45 y UL46 con DNA polimerasa de alta fidelidad y cartillas UL45-F1 y UL46-R1 (tabla 1) para detectar la inserción todo.</li>
		<li>Preparar la siguiente mezcla de reacción de 50 μl: 5 μl de 10 x Pfx mezcla de reacción, 1,5 μl de 10 μm aguas arriba y mezcla de aguas abajo de la cartilla, 1 μl de mezcla de dNTP 10 mM, 1 μl de MgSO4de 50 mM, 1 μl de la plantilla de la DNA y 0,5 μl de polimerasa de la DNA de Pfx y añadir agua libre de nucleasa a 50 μl. El programa de amplificación: 95 ° C por 2 min; 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s y 68 ° C por 3 min, 35 ciclos. Carga todo el producto PCR en gel de agarosa al 1% para electroforesis en gel.</li>
		<li>Purificar el producto PCR siguiendo las instrucciones de un kit de purificación del gel de DNA. Enviar 10 μl del producto PCR (30 ng/μL) a una empresa de secuenciación para confirmar el knock-in del gene VP2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. estabilidad del Virus recombinante
<ol><li>Semilla de 2.6 x 106 CEF las células en cada matraz T25 el día antes de la expansión del virus.</li>
	<li>Descongelar por lo menos tres clones positivos de paso 5.2; Añadir un frasco de virus de las células en cada matraz T25. Hasta un 50% de efecto citopático que se observa, incubar a 38,5 ° C con 5% CO2 .</li>
	<li>Cosecha de las células en 2 mL de medio de cultivo; infectar a 50 μl a un nuevo matraz T25 preconfigurarse con células CEF para la próxima generación. Mantener pases el virus recombinante durante al menos 15 generaciones. Analizar cada generación de virus por PCR la presencia de la secuencia de VP2 y por análisis de la inmunofluorescencia indirecta (IFA) para la expresión de VP2 evaluar la estabilidad de los virus recombinantes.</li>
</ol>

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<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El sistema CRISPR/Cas9 se ha convertido en una herramienta valiosa en la edición de genes. Las tecnologías tradicionales para recombinante desarrollo de vectores HVT, como recombinación homóloga13 y BAC mutagénesis tecnología25, implican generalmente varias rondas de vector de clonación y selección, así como proyección a gran escala, que puede tomar varios meses. El protocolo descrito aquí usando una NHEJ CRISPR/Cas9-estrategia combinada con el sistema Cre-Lox y unicelular clasificación es más un enfoque más rápido, conveniente y eficiente en la generación de la vacuna recombinante. Mediante este gasoducto, el virus recombinante puede obtenerse dentro de solamente 1-2 semanas24, y pasos de purificación de placa también pueden reducirse a una separación solo asaltos usando celular activado por fluorescencia clasificación17. Todo el proceso, de gRNA construcción diseño y donante para la obtención de virus HVT recombinante purificado, puede lograrse dentro de 1 mes. Los pasos críticos para la generación de HVT recombinante exitosa incluyen la selección de gRNA de alta eficiencia para apuntar el genoma viral para asegurar eficiente escote para la inserción de genes extraños, la eficiencia de transfección alta para maximizar la oportunidad para Cas9 / gRNAs y el virus en la misma célula para su edición y el intervalo de 12 horas entre la transfección de plásmidos de los donantes y gRNA y la infección viral para permitir Cas9 y gRNA expresarse a un nivel razonable antes de que el virus entra en las células.
La limitación para la generación de HVT recombinante es que la complejidad de la identificación de GFP-positivas clones por Unión PCR. Los cassettes de GFP-VP2 pueden insertarse en cualquier orientación. El cruce de que PCR descrito aquí es sólo para la identificación de la inserción en la orientación de sentido. En el caso de la inserción en la orientación antisentido, polimerización en cadena usando los pares de primer descritos no funcionaría y los cebadores internos podrían ser intercambiados para este propósito. Otro problema potencial es que el concepto de donante puede utilizarse para la inserción de un gen en el virus mismo debido a la existencia de la secuencia LoxP restante después del retiro de GFP por tratamiento de Cre. Una nueva construcción de donantes con una variante de secuencia LoxP podría usarse para un propósito de inserción múltiple.
NHEJ y HDR (reparación dirigida por homología) son los dos caminos para reparar las roturas de doble hebra (distritales) creadas por Cas926,27. NHEJ es más eficiente como ocurre a lo largo de los28del ciclo celular, mientras que el HDR es menos eficiente y sólo ocurre durante S y G2 fases6,29,30. Nos explota el más eficiente NHEJ vía de reparación aquí para introducir genes foráneos en las localizaciones específicas. Aunque el NHEJ reparación puede introducir indels une extremos de DNA dañados o incompatibles a través de un proceso mecánico flexible de homología independiente31,32 entre la secuencia de donantes exfoliados y DNA genómico, los indels sólo puede ocurrir en los sitios de clivaje de la sgA, y el casete de genes extranjeros no se ve afectado. Otra ventaja de este enfoque es que NHEJ está libre de la restricción de construcción de brazo de homología, de hacer la clonación paso muy sencillo. Esto impulsa un gran potencial para la aplicación de NHEJ para la inserción de genes extraños. La introducción de un sitio de destino de gRNA universal en ambos extremos del extranjero gen cassette hace el proceso más rápido como la plantilla de donantes podría construirse inmediatamente sin necesidad de la selección específica de gRNA. La columna vertebral del plásmido donante que contiene sitios de destino de sgA y sitios LoxP sitios PacI y SfiI puede también compartirse ampliamente entre genes diferentes reporteros, cassettes de la extranjero de expresión génica y vectores de diferentes virus, dando a este nuevo enfoque la ventaja de arreglo para requisitos particulares.
El inserto de VP2 albergando HVT fue usado para describir el protocolo en este manuscrito; sin embargo, el mismo enfoque puede utilizarse para insertar más de los genes virales en diferentes localizaciones genómicas del genoma HVT con el gRNA dirigida a la correspondiente secuencia deseada para el desarrollo de vacunas multivalentes de vectorizadas HVT recombinantes. Otras cepas de la vacuna MDV, como SB-1 y CVI988, otros herpesvirus aviares, incluyendo laryngotracheitis infeccioso virus y virus de la enteritis del pato y también otros virus aviares del ADN, como adenovirus, virus de la viruela pueden también diseñarse usando el mismo enfoque para el desarrollo de una vacuna recombinante multivalentes. El desarrollo de nuevas vacunas virales multivalentes utilizando la plataforma del sistema CRISPR/Cas9 descrita aquí puede resultar muy provechosa para la industria de aves de corral para proteger contra múltiples enfermedades de las aves de corral.

Enfermedad de Marek (MD) es una enfermedad linfoproliferativa de pollos inducida por el serotipo 1 (galido Herpesvirus 2 [GAHV-2]) del género Mardivirus en la subfamilia de los Alphaherpesvirinae. Mardivirus también incluye dos serotipos no patógenos: serotipo 2 (GaHV-3) y serotipo 3 (MeHV-1, conocido históricamente como HVT) que se utilizan como vacunas contra MD Vacuna viva de HVT (cepa FC-126) es la primera generación de vacuna MD utilizada en la década de 1970 y todavía se utiliza ampliamente en formulaciones de vacunas bivalentes y polivalentes para proporcionar una mayor protección frente a MD HVT es también ampliamente utilizado como un vector de vacuna para inducir la protección contra varias enfermedades aviares debido a su versatilidad y seguridad de tanto de ovo y criadero subcutáneo administración y capacidad para proporcionar una inmunidad de por vida. La estrategia para generar vacunas HVT recombinantes se basa en cualquiera convencional recombinación homóloga en células virus-infectadas, cósmido superpuesta DNAs o BAC mutagénesis2. Sin embargo, estos métodos son generalmente desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva, que requiere la construcción de vectores de transferencia, el mantenimiento del genoma viral en purificaciones de placa de Escherichia coli y la eliminación de la secuencia de BAC y selección marcador del virus editado3,4.
CRISPR/asociados (Cas9) es el gen más popular herramienta de edición en los últimos años debido a su versatilidad y su especificidad. El sistema CRISPR/Cas9 se ha utilizado con éxito en la generación eficiente de células genéticamente modificadas y modelos animales5,6,7,8,9,10, como así como en la manipulación de varios virus DNA grandes genomas11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Tras informar de un método simple y eficiente utilizando el sistema CRISPR/Cas9 para modificar el genoma HVT21, hemos desarrollado una tubería para la rápida y eficiente generación de recombinantes HVT22.
Para ampliar el potencial de aplicación de este método, se describe la metodología detallada para la generación de recombinantes vacunas HVT expresando el gen de la VP2 del VEIB en el locus UL45/46 en este informe. El enfoque combina NHEJ-CRISPR/Cas9 para insertar el gen de la VP2 etiquetado con gen GFP reportero y un sistema Cre-LoxP para Retire el casete de expresión de GFP más adelante. Comparado con el tradicional recombinación y BAC recombineering técnicas, demostramos que NHEJ-CRISPR/Cas9 junto con un sistema Cre-Lox es un enfoque rápido y eficiente para generar vacunas HVT recombinante.

<table><tbody><tr><td>medio M199, tecnología de sales de Earle's</td><td>Life</td><td>11150059</td><td>medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Tecnología Life</td><td>15140148</td><td>antibióticos</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Sigma</td><td>1397-89-3</td><td>antifúngico</td></tr><tr><td>Caldo de fosfato de triptosa</td><td>Sigma</td><td>T8782</td><td>medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>HVT Fc126 cepa</td><td>Laboratorio de Enfermedades Aviares y Oncología Virus</td><td></td><td>HVT de tipo salvaje</td></tr><tr><td>pX459-v2</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #62988</td><td>Cas9 y vector de expresión de ARNg</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector Systems</td><td>promega</td><td>A1360</td><td>clonación de vectores donantes</td></tr><tr><td>Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células competentes</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td>transformación</td></tr><tr><td>PacI</td><td>NEB</td><td>rR0547S</td><td>clonación de vectores donantes</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>NEB</td><td>R0123S</td><td>clonación de vectores donantes</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>clonación</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep QIAGEN</td><td></td><td>27106</td><td>extracción de plásmidos</td></tr><tr><td>TransIT-X2</td><td>Mirus</td><td>MIR Transfección 6004</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular Placa de 6 pocillos</td><td>Thermofisher</td><td>140675</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>Unión amplificación por PCR</td></tr><tr><td>Platinum Pfx ADN polimerasa</td><td>Thermofisher</td><td>11708021</td><td>amplificación por PCR de</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-IgY (H+L) anti-pollo de cabra de inserción completa, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td>tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>TCS SP5 LASAF</td><td>inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>FACS clasificador de células</td><td>BD biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td>clasificación de células individuales</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (4% en PBS)</td><td>Santa cruz biotecnología</td><td>SC-281692</td><td>fijación celular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>GeneTex</td><td>GTX30960</td><td>permeabilización</td></tr></tbody></table>

generación de vectores recombinantes herpesvirus aviar con crispr/cas9 gene edición

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus de pavos (HVT) es un vector viral ideal para la generación de vacunas recombinantes contra enfermedades aviar, tales como la influenza aviar (AI), la enfermedad de Newcastle (ND) y enfermedad bursal infecciosa (IBD), usando (cromosoma artificial bacteriano Mutagénesis de BAC) o métodos de recombinación convencional. El cluster regularmente otro repite palindrómico (CRISPR) / sistema Cas9 ha sido utilizada exitosamente en muchos entornos para la edición de genes, incluyendo la manipulación de varios genomas grandes virus ADN. Hemos desarrollado una rápida y eficiente CRISPR/Cas9-mediada genoma edición tubería para generar recombinante HVT. Para maximizar el uso potencial de este método, aquí os presentamos información detallada sobre la metodología de generación de HVT recombinante expresando la proteína VP2 del VEIB. El casete de expresión VP2 se inserta en la HVT genoma mediante un NHEJ (nonhomologous end-joining)-vía de reparación dependiente. Un cassette de expresión de la proteína (GFP) de fluorescencia verde se une primero a la parte movible para fácil visualización y luego retira mediante el Cre-LoxP sistema. Este enfoque ofrece una manera eficiente para introducir otros antígenos virales en el genoma HVT para el rápido desarrollo de vacunas recombinantes.

La estrategia utilizada para la generación de la vacuna HVT recombinante está delineada en la figura 1, que incluye cómo el plásmido donante es construida (figura 1A) y los procedimientos para generar la recombinante HVT (figura 1B ). Cinco a treinta placas de GFP-positivas rodeadas de placas de tipo salvaje se pueden observar en gen golpeando en pozos bajo la posttransfection de 3 d de microscopio de fluorescencia y - infección. El virus purificado obtenido después de sola célula clasificación (figura 2A) se analizó por 3' Unión PCR, que muestra un producto PCR del tamaño esperado (figura 2A, panel inferior). Después de la supresión de la reportera GFP por recombinase de Cre, más 50% de las placas había perdido su expresión de GFP. Fue confirmada más a la placa purificada después de la supresión de la GFP (figura 2B) unicelular clasificando por 5' Unión PCR, que muestra el producto PCR de tamaño adecuado (figura 2B, panel inferior). La figura 3 muestra los resultados de la secuencia del cruce de ambos productos de la PCR con diferentes elementos de color. En la figura 4, la expresión de la proteína fue confirmada por el IFA con anticuerpo monoclonal específico de VP2 y suero de pollo anti-HVT. Como se esperaba, células infectadas con el HVT parental pueden sólo ser manchadas por el suero anti-HVT (verdes), mientras que las células infectadas de HVT recombinantes claramente demostraron la expresión del gen de la VP2 (rojo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figura 1: estrategia para la generación de un recombinante vacunas vectorizadas HVT. (A) este panel muestra una representación esquemática de la estrategia de clonación para donante construcción del plásmido. Los elementos clave incluyen dos sitios de destino Cas9 (sgA) para la liberación de insert, un cassette GFP reportero flanqueado por secuencias LoxP para la supresión de GFP y el casete de expresión de VP2. (B) este panel muestra un resumen de un proceso de dos pasos gene knock-en estrategia. El fragmento de inserción de la GFP y los cassettes de expresión VP2 es lanzado por clivaje Cas9/sgA e insertado en el genoma HVT en UL45/46 loci vía NHEJ-CRISPR/Cas9. El virus recombinante GFP-positivas entonces es clasificado y purificado por unicelular celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación. Posteriormente, el gen reportero GFP es suprimido por recombinase de Cre y el virus recombinante purificado y caracterizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figura 2 : Verificación de la HVT recombinante. (A) este panel muestra una placa GFP-positivas (HVT-GFP-VP2) visualizada bajo el microscopio de fluorescencia (panel superior) y la PCR verificación de HVT-GFP-VP2 cartillas VP2-F &amp; UL46-R1 para el cruce de 3'. ()B) este panel muestra una placa (HVT-VP2) visualizada después de la supresión de GFP de HVT-GFP-VP2, con recombinase de Cre y la comprobación de la PCR de HVT-VP2 cartillas UL45-F1 y VP2-R1 para la Unión 5'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figura 3 : Secuencia de análisis de virus recombinantes de HVT. (A) las secuencias de los elementos clave en diferentes colores en este panel son la región intergénica de HVT entre UL45/46 con la secuencia de destino gRNA subrayada y una flecha que muestra el sitio de la hendidura Cas9, el casete de expresión VP2 con final secuencias en minúscula cursiva, la secuencia de destino A sg en color rojo con la flecha que muestra el sitio de la hendidura Cas9, la secuencia del sitio LoxP en verde y dos secuencias de sitios de SfiI en azul. (B) este panel muestra los resultados de la secuenciación de las uniones 5' y 3' y una presentación esquemática de HVT-VP2 con elementos clave con presentados en secuencias de colores correspondientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figura 4 : Caracterización de la VP2 de HVT recombinante. Este panel muestra la confirmación de la acertada expresión de VP2 en general infectados mediante ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) con anticuerpo monoclonal de anti-VP2 HH7 (rojo). HVT infección es confirmada por IFA con suero de pollo infectado HVT (verde). La barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Herpesvirus de pavos (HVT) es ampliamente utilizado como una plataforma de vector para la generación de vacunas recombinantes contra enfermedades aviar. Este artículo describe un método simple y rápido para la generación de vacunas vectorizadas HVT recombinantes usando un sistema Cre-Lox y NHEJ-CRISPR/Cas9 integrado.

Generación de vectores recombinantes Herpesvirus aviar con CRISPR/Cas9 Gene edición

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Este enfoque ofrece una manera eficiente de introducir otros antígenos virales en el genoma de HVT para el desarrollo rápido de vacunas recombinantes. Una ventaja de esta técnica es que un casete de expresión GFP se une primero a la plaquita para facilitar la visualización y luego se elimina mediante el sistema Cre-LoxP. El mismo enfoque se puede utilizar para insertar más genes virales en diferentes lugares del genoma del HVT, u otros virus del herpes aviar para el desarrollo de vacunas recombinantes multivalentes.Demostrando el procedimiento estará Katy Moffat, una experta en clasificación celular. Na Tang, Yaoyao Zhang y Guanggang Qu, científicos de mi laboratorio. El día antes de la transfección preparar fibroblastos embrionarios de polluelo como se describe en el protocolo de texto.Siembra 1,3 millones de células en 2,5 mililitros de medio en cada pozo de una placa de seis pozos. Transfeque las células CEF con 0,5 microgramos cada uno de los dos plásmidos guía cas9 de ARN, y un microgramo del plásmido del donante utilizando un reactivo de transfección adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar las células a 38,5 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 12 horas.12 horas después de la transfección diluir el stock de virus HVT con un medio de cultivo M199 a una concentración de 100.000 unidades formadoras de placa por mililitro. Añadir 130 microlitros del virus diluido a cada pozo de células trans infectadas. Establezca un pozo de células no infectadas como control negativo y agregue la misma cantidad de virus.Incubar las células a 38,5 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres días. El día antes de la clasificación preparar dos placas de 96 pozos mediante la siembra de 20.000 células en cada pozo. Tres días después de la infección recuperar las seis placas de pozo que contienen los CEF trans infectados e infectados.Aspirar el medio de cada pozo y enjuagar la hoja de la célula con PBS. Añadir un mililitro de 0.05%trypsin-EDTA a cada pozo e incubar las células a 38.5 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente cinco minutos. Luego, resuspender las células con 50 microlitros de FBS y transferir esta suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Centrifugar a 200 veces la gravedad durante cinco minutos. Resuspender las células en un mililitro de PBS que contiene 1%FBS. Utilice un hemocitociómetro para contar las células y ajustar la densidad celular a un millón de células por mililitro.A continuación, transfiera las células a un tubo de clasificación de poliestireno a través de su tapa de colador. Usando un clasificador de celdas ordene las celdas individuales que expresan la GFP en las placas de 96 pozos preseleccionadas. Incubar las placas con las células ordenadas a 38,5 grados Centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cinco días.Después de cinco días utilice el microscopio de fluorescencia para comprobar las 96 placas de pozo y marcar los pozos que contienen una sola placa positiva GFP. Pruebe cada GFP positivo bien con 50 microlitros de trippsina-EDTA durante tres minutos. A continuación, añadir 50 microlitros de medio de cultivo para resuspend las células y transferir esta suspensión en un pozo de una placa de seis pozos con CEF.Después de tres días congelar un vial de cada una de las primeras generaciones de virus recombinantes en medio de congelación. Almacene estos virus cosechados en nitrógeno líquido. Recoge 100.000 células de cada una de la primera generación de virus.Centrifugar las células a 2.000 rpm durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Almacene las células en 20 grados Celsius negativos hasta que estén listas para realizar la extracción de ADN. Cuando esté listo para realizar la extracción de ADN, utilice 50 microlitros de tampón de aplastamiento para descongelar y resuspender los gránulos celulares.Lisar las muestras a 65 grados Celsius durante 30 minutos y luego a 95 grados Celsius durante dos minutos para inactivar la Proteinase K.Realizar una reacción PCR con tres imprimaciones de unión primo utilizando un microlitro de cada muestra de ADN como se describe en el protocolo de texto. Cargue dos microlitros de los productos de amplificación en un pocódi de 1% de gel de agarosa para electroforesis de gel. Para eliminar el gen GFP del virus recombinante, utilice un reactivo de transfección para transfecar dos microlitros de plásmido de expresión recombinasa de Cre en la placa de seis pozos que se ha preseleccionado con células CEF.12 horas después de la descongelación de la transfección un vial de virus recombinante a partir de nitrógeno líquido. Resuspender suavemente el virus y sembrar 50 microlitros en cada pozo de células trans infectadas, estableciendo uno bien como el control negativo con la misma cantidad de virus. Incubar a 38,5 grados centígrados durante tres días.72 horas después de la infección preparar las células para la clasificación como se describió anteriormente. Ordene las células no fluorescentes individuales en una placa de 96 pozos preseleccionada con CEF. A continuación, pruebe las placas elegidas y resusppend las celdas correspondientes como se describe en el protocolo de texto.Pasar la mitad de las células en cada pozo de una placa de 96 pozos que ha sido preseleccionada con CEF como la segunda generación. Centrifugar las células restantes de cada clon a 200 veces la gravedad durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células con 50 microlitros de tampón de aplastamiento para la extracción de ADN.A continuación, realice pcR con cinco imprimaciones de unión principales utilizando un microlitro de plantilla de ADN como se describe en el protocolo de texto. Sobre la base de los resultados de la PCR, elija de tres a cinco clones positivos de HVT recombinante para pasajes y verificación adicionales. En primer lugar, infectar los CEF con la segunda generación de HVT recombinante en una placa de 24 pozos preseleccionada.48 horas después de la infección eliminar el medio de cultivo y añadir 500 microlitros de 4%paraformaldehído en PBS para fijar las células. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, retire el fijador y lave la capa celular tres veces con PBS.Retire el PBS y agregue 500 microlitros de 0.1%Triton X-100 para permeabilizar las células. Después de 15 minutos, lave la capa celular tres veces con PBS. Agregue el búfer de bloqueo durante una hora para bloquear el enlace no específico.A continuación, diluya el anticuerpo primario anti-VP2 anticuerpo monoclonal HH7 o suero de pollo infectado por HVT a uno a 200 en el tampón de bloqueo. Añadir 200 microlitros del anticuerpo primario diluido a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Lave la capa celular tres veces con PBS.Diluir el anticuerpo secundario cabra anti-ratón IgG Alexa 568 o cabra anti-pollo IgG Alexa 488 en uno a 200 en tampón de bloqueo. Añadir 200 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Luego, lave las células tres veces con PBS.Utilice el microscopio de fluorescencia para comprobar la expresión de la proteína. El día antes de la expansión del virus sembra 2,6 millones de células CEF en cada matraz T25. Descongelar al menos tres clones positivos y añadir un vial de células o virus a cada matraz.Incubar los matraces a 38,5 grados celsius con un 5% de dióxido de carbono hasta que se observe un efecto citopático del 50%. A continuación, cosechar las células en dos mililitros de medio de cultivo. Infectar 50 microlitros a un nuevo matraz T25 que fue preseleccionado con células CEF para la próxima generación.Sigue transmitiendo el virus recombinante durante al menos 15 generaciones. Usando PCR analiza cada generación de virus para la presencia de la secuencia VP2. Utilizando un ensayo indirecto de inmunofluorescencia analiza cada generación de virus de expresión VP2.Después de la clasificación de una sola célula, el virus purificado obtenido es analizado por tres PCR de unión principal, que muestra un producto PCR del tamaño esperado. Después de la escisión del reportero de GFP por Cre recombinar más del 50% de las placas perdieron su expresión de GFP. La placa purificada después de la escisión de la GFP se obtiene mediante la clasificación de una sola célula y se confirma además con cinco PCR de unión principal que muestra el producto del tamaño esperado.La expresión de la proteína se confirma entonces mediante un ensayo indirecto de inmunofluorescencia con anticuerpo monoclonal específico VP2 y suero de pollo anti-HVT. Como era de esperar, las células infectadas con el HVT parental sólo pueden ser manchadas por suero anti-HVT. Mientras que las células infectadas por HVT recombinantes muestran claramente la expresión del gen VP2.Para generar un virus recombinante se requiere una alta tasa de transfección para maximizar la posibilidad del virus y la inserción para reunirse en la misma celda para que la edición tenga lugar. Después de este procedimiento se pueden realizar experimentos con animales para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia de las vacunas recombinantes. El desarrollo de nuevas vacunas vectoriales multivalentes utilizando la plataforma del sistema CRISPR/Cas9 descrita aquí será muy beneficioso para la industria avícola para proteger contra múltiples enfermedades avícolas.

generating-recombinant-avian-herpesvirus-vectors-with-crisprcas9-gene

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

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Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

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Describimos la estrategia de producción de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) como vehículos para la entrega de CRISPR/Cas9 a las células. Con una capacidad para mediar la edición rápido y robusto gene en células, IDLVs actualmente un seguro y plataforma igualmente eficaz vector de genes en comparación con vectores competentes integrasa.

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

El desarrollo de modelos murinos con genes específicos mutados en pacientes con cáncer de cabeza y cuello es necesario para comprender la neoplasia. Aquí, presentamos un protocolo para la transformación in vitro de células de la lengua murina primaria utilizando un sistema adeno-asociado virus-Cas9 para generar líneas celulares HNC murinas con alteraciones genómicas específicas.

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno

Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.

Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Aprenda a generar vectores recombinantes de Herpesvirus aviar con edición génica CRISPR/Cas9 y sistema Cre-Lox. Este método permite desarrollar vacunas multivalentes para la industria avícola.

Generación de vectores recombinantes Herpesvirus aviar con CRISPR/Cas9 Gene edición

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