Name: Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprende a detectar Salmonella y Shigella mediante PCR en tiempo real combinada con cultivo guiado. Este método de alto rendimiento mejora la especificidad y sensibilidad en el diagnóstico microbiológico clínico.

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Este trabajo fue apoyado por la ciencia y tecnología programa de Zhuhai, China (concesión número 20171009E030064), la ciencia y tecnología programa de Guangdong, China (concesión número 2015A020211004) y ciencia y programa de Administración General de tecnología de supervisión de calidad, inspección y cuarentena de la República Popular de China (número de concesión 2016IK302, 2017IK224).

El protocolo sigue los lineamientos establecidos por el Comité de ética de investigación de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Utilice estándar operación estéril durante el experimento.
1. preparación y composición de los medios de cultivo
<ol><li>Preparar el caldo nutritivo: Disolver la peptona 1%, extracto de carne de res de 0.3%, cloruro de sodio 0,5%, glucosa 0.1% en H2O, ajustar el pH a 7,5 y autoclave en 121 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Preparar medio de selenito cistina: disolver la peptona 0.5%, 1% Na2HCO3, 0.4% de lactosa, selenito de hidrógeno de sodio 0.4%, 0,001% L-cistina en H2O, ajustar el pH a 7.0 y hervir durante 5 minutos.</li>
	<li>Preparar la xilosa, lisina, desoxicolato placa de agar (XLD): Extracto de disolver levadura de 0,3%, 0,5% L-lisina xilosa de 0.375%, 0.75% de lactosa, 0.75% de sacarosa, cloruro de sodio 0,5%, 0.008% de rojo de fenol, 0,68% tiosulfato de sodio, citrato férrico de amonio 0.08%, sodio 0.25% desoxicolato, agar 1,5% en H2O y ajustar el pH a 7,4. Luego hervir durante 5 minutos y verter en placas de 90 mm.</li>
	<li>Preparar la placa de agar cromogénico de Salmonella : disolver 1.5% de agar, peptona y levadura Extracto de 0,7%, reactivo selectivo de 1.29% en H2O. Luego hervir durante 5 minutos y verter en placas de 90 mm.</li>
	<li>Preparar la placa de agar nutritivo: disolver 0.3% Extracto de carne, cloruro de sodio 0,5%, peptona 1%, agar 1,5% en H2O y ajustar el pH a 7.3. Entonces el autoclave en 121 ° C durante 15 minutos y verter en placas de 90 mm.</li>
	<li>Preparar la placa de MacConkey agar (MAC): disolver la peptona 2%, 1% de lactosa, cloruro de sodio 0.5% 0.5% sal de bilis de buey, 0,0025% rojo neutro, agar 1,5%, un 0,0001% de cristal violeta en H2O y ajustar el pH a 7.2. Entonces el autoclave en 115 ° C por 20 min y verter en placas de 90 mm.</li>
</ol>2. en tiempo real PCR
<ol><li>Recogida de muestras<ol>
<li>Inserte un hisopo anal en el ano del paciente 3-5 cm de profundidad y girar 360° alrededor.</li>
		<li>Poner el hisopo anal en un tubo estéril para recogida. Marca muestra ID.</li>
		<li>Enviar la muestra al laboratorio tan pronto como sea posible. Nota: Las muestras podrían almacenarse a 4 ° C por no más de 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enriquecimiento de la<ol>
<li>Añadir 3 mL de caldo nutriente en cada muestra en el tubo de la colección.</li>
		<li>Incubar a 36 ° C por 6 horas en una incubadora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muestra de mezcla (opcional)<ol>
<li>Recoger 100 μl de cada cultivo de enriquecimiento previo y mezclar 8-10 muestras de 1 pieza en un tubo de 1,5 mL si hay más de 10 muestras.</li>
		<li>Marque correctamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extracción de ADN<ol>
<li>Centrifugue la cultura pre-enriquecimiento a 800 x g durante 2 min permitir que las partículas grandes a establecerse, y traslado el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos eliminar el sobrenadante por aspiración.</li>
		<li>Añada 100 μl de solución de extracción de ADN (0.01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0.01% Nonidet P 40 (NP40)) a la pelotilla. Vortex vigorosamente por 1 minuto.</li>
		<li>Hervir a 100 ° C por 5 min en un baño seco.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 5 min recoger el sobrenadante utilizando un tubo nuevo, que será la plantilla para el posterior análisis PCR en tiempo real.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR en tiempo real<ol>
<li>Configuración de la mezcla de reacción como sigue: para cada muestra, añadir 12,5 μl de 2 x la mezcla de reacción, 0,4 μm de cada cebador, 0.2 μm de cada sonda (secuencias en la tabla 1)27, 5 μl de la plantilla como preparado en el paso 2.4.4 y utilizar ddH2O para agregar total hasta 25 μl volumen.</li>
		<li>Configurar el programa de ciclismo como sigue: 95 ° C por 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C durante 34 s. recogemos señales fluorescentes de canales Hexachlorofluorescein (HEX) en la etapa de elongación (72 ° C) y 6-carboxi-fluoresceína (FAM) automáticamente por la máquina PCR en tiempo real fluorescente.</li>
		<li>Realizar PCR en tiempo real en una máquina PCR en tiempo real fluorescente, según instrucciones del instrumento.</li>
		<li>Ir directamente al paso 4 y emitir informes negativos si resultados negativos se producen en los canales de FAM/hexagonal, lo que significa que las muestras son negativas para Salmonella spp. /Shigella spp.</li>
		<li>Vaya al paso 3.1 o 3.2 si positivos resultados se producen en los canales hexagonales o FAM, que significa que la muestra puede ser positiva para Salmonella spp y Shigella spp., respectivamente. Nota: Si la mezcla de la muestra se ha realizado en el paso 2.3, entonces PCR en tiempo real en muestras individuales que constituyen un positivo debe realizarse para descartar la muestra real positiva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Guía de la cultura
<ol><li>
Muestras positivas de Salmonella spp. polimerización en cadena<ol>
<li>Cultivo selectivo en medio<ol>
<li>Añadir 100 μl del cultivo de enriquecimiento previo en 5 mL de medio de selenito cistina en un tubo de ensayo. Incubar a 36 ° C por 18 – 24 h en una incubadora.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Separar el cultivo en placa<ol>
<li>Recoger un loop de la cultura con un micro-loop y extender sobre una placa XLD o Salmonella agar cromogénico. Incubar a 36 ° C durante 18-24 h en una incubadora.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identificación bioquímica<ol>
<li>Seleccione Colonia sospechosa en placa XLD (Colonia rosa con/sin corazón oscuro; oscuro Colonia Colonia amarillo con o sin corazón oscuro) o Salmonella agar cromogénico (Colonia púrpura o prunosus, liso y redondo) (figura 2).</li>
			<li>Colonia sospechosa de tema para identificación bioquímica en el sistema automatizado de identificación microbiana, según las instrucciones del instrumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caracterización serológica<ol>
<li>O caracterización del antígeno<ol>
<li>Añada una gota de los sueros polivalentes del antígeno O en un portaobjetos limpio.</li>
				<li>Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y la rutina en el suero.</li>
				<li>Ir a paso 3.1.4.1.4 Si parece que fluye la arena, lo que significa que la Colonia es reactiva a los sueros (figura 3). De lo contrario, vaya al paso 3.1.4.1.5.</li>
				<li>Utilice sueros monovalentes de antígeno O repetir 3.1.4.1.1 a 3.1.4.1.3 hasta que caracteriza el antígeno específico de la O.</li>
				<li>Utilice sueros Vi repetir 3.1.4.1.1 a 3.1.4.1.3. Recoger las colonias reactivas de Vi sera en un tubo y hierve a 100 ° C por 5 min en un baño seco. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos recoge los pellets y repita los pasos 3.1.4.1.1 a 3.1.4.1.4 hasta antígeno específico O se caracteriza.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Caracterización del antígeno de H<ol>
<li>Añada una gota de los sueros polivalentes del antígeno de H en un portaobjetos limpio.</li>
				<li>Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y la rutina en el suero.</li>
				<li>Ir a paso 3.1.4.2.4 Si parece que arena, que significa que la Colonia es reactiva a los sueros.</li>
				<li>Utilice sueros monovalentes de antígeno H repetir 3.1.4.2.1 a 3.1.4.2.3 hasta antígeno específico de la H se caracteriza. Nota: A veces la inducción del suero puede necesitarse para caracterizar el segundo antígeno de fase H. Si es así, deben realizarse los siguientes pasos opcionales.</li>
				<li>(Opcional) Añada una gota de concreto sera de antígeno H en placa de agar nutritivo. Espere hasta que todos los sueros son absorbidos.</li>
				<li>(Opcional) Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y propagación en la placa donde se absorben específicos sueros antígeno de H. Incubar a 36 ° C durante 18-24 h en una incubadora.</li>
				<li>(Opcional) Utilice sueros monovalentes de antígeno H repetir 3.1.4.2.1 a 3.1.4.2.3 hasta segunda fase antígeno H se caracteriza.</li>
				<li>Vaya al paso 4.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Muestra positiva de Shigella spp. polimerización en cadena<ol>
<li>Separar el cultivo en placa<ol>
<li>Recoger un loop de la cultura pre-enriquecimiento con un micro-loop y extender sobre una placa XLD o MAC. Incubar a 36 ° C por 18 – 24 h en una incubadora.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Identificación bioquímica<ol>
<li>Recoger la Colonia sospechosa sobre placa XLD (lisa, redonda, transparente y rojo Colonia) o MAC (liso, redondo, transparente e incoloro Colonia con 2-3 mm de diámetro; Shigella sonnei puede ser más grande y vuelven a la luz de color rosa como el alargamiento del tiempo de incubación) (figura 4).</li>
			<li>Colonia sospechosa de tema para identificación bioquímica en el sistema automatizado de identificación microbiana, según las instrucciones del instrumento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caracterización serológica<ol>
<li>Añada una gota de los sueros polivalentes de Shigella spp. en un portaobjetos limpio.</li>
			<li>Recoger un loop de la Colonia con un micro-loop y la rutina en el suero.</li>
			<li>Ir a paso 3.2.3.4 Si parece que arena, que significa que la Colonia es reactiva a los sueros.</li>
			<li>Utilice sueros monovalentes de Shigella spp. repetir pasos 3.2.3.1 a 3.2.3.3 hasta específicos Shigella spp se caracteriza.</li>
			<li>Vaya al paso 4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Informe
<ol><li>Emitir informes positivos o negativos según los resultados anteriores.</li>
</ol>

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<li>Gargano, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+from+selected+diseases+that+can+be+transmitted+by+water+-+United+States%2C+2003-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009.</a> Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).</li>
<li>Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+assays+for+the+detection+of+Salmonella+in+seafood%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood.</a> Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).</li>
<li>Herrera-Leon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+comparison+of+traditional+serotyping+with+three+multiplex+PCRs+for+the+identification+of+Salmonella+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes.</a> Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).</li>
<li>Cunningham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-hour+molecular+detection+of+Campylobacter%2C+Salmonella%2C+Yersinia%2C+and+Shigella+species+in+feces+with+accuracy+as+high+as+that+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).</li>
<li>Eriksson, E., Aspan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+techniques+for+salmonella+detection+in+faecal+samples+for+cattle%2C+pig+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry.</a> BMC Veterinary Research. 3, 21(2007).</li>
<li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+performance+characteristics+of+a+direct+PCR+with+stool+samples+in+comparison+to+conventional+techniques+for+diagnosis+of+Shigella+and+enteroinvasive+Escherichia+coli+infection+in+children+with+acute+diarrhoea+in+Calcutta%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde Salmonella sppShigella spp. a menudo se asocian a la intoxicación alimentaria y transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda28,29 y el método de rutina es desperdiciador de tiempo o mano de obra intensiva 7, se describe una plataforma de alto rendimiento para la Salmonella spp. / detección deShigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.
Ha...

La diarrea es aún un problema de salud común con una incidencia alta tasa global1,2. Aunque la mortalidad es relativamente baja, algunos pacientes muestran varios síntomas durante semanas (por ejemplo, las heces blandas y acuosas, una urgencia para ir al baño), que hacen que el impacto socioeconómico muy alto3,4. Más grave aún, algunos pacientes incluso pueden desarrollar síndrome de intestino irritable si se deja sin tratar5. Hay varias clases de bacterias, virus y parásitos que pueden causar diarrea6. Salmonella sppShigella spp., están entre las bacterias más comunes para la transmisión de la gastroenteritis aguda7,8,9,10,11. Por lo tanto, muchos condados han emitido leyes o reglamentos para regular spp Salmonella /Shigella spp. cribado entre las personas que se manejan alimentos y agua. Por ejemplo, el gobierno chino ha emitido leyes para obligatorio Salmonella spp. /Shigella spp. de detección una vez al año.
El método estándar de oro para Salmonella spp. / detección deShigella spp es la cultura de las bacterias. A través de bacterias cultura y sucesiva identificación bioquímica y serológica caracterización, podemos identificar las especies de bacterias, lo que podrían facilitar la gestión del brote de la enfermedad y perfiles de antimicrobianos para el tratamiento de pacientes 12. también podría ayudar a rastrear el origen de la infección durante la Salmonella spp. /Shigella spp. brote13. Sin embargo, este método es intensiva (que requieren operación manual) y lento (tomando varios días), especialmente para la prueba de un gran número de muestras7. Por otra parte, viable pero no cultivable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spppueden existir en algunas muestras de heces14. En vista de estos inconvenientes, muchos laboratorios han tratado de desarrollar nuevas técnicas para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. todos estos métodos utilizan la prueba de amplificación de ácido nuclear (NAAT), entre los que la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es la más común. Una limitación importante de estos métodos NAAT base es que las bacterias muertas, bacteriana incluso ruina que contiene ADN genómico incompleta, podrían demostrar resultados positivos26, que podrían influir en gran medida el diagnóstico preciso de la enfermedad. Blanco et al demostró que análisis molecular es altamente sensible, no sólo viable Salmonella en culturas, pero también a genomas parciales y bacterias muertas o inviables de infecciones pasadas o contaminación26. Por lo tanto, se deben desarrollar nuevas tecnologías.
Aquí, describimos un nuevo método que combina el NAAT basado en método y cultivo. Como se muestra en la figura 1, este nuevo método aplica a PCR en tiempo real detección primero y luego se envían muestras positivas para la identificación y cultivo de bacterias.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sigma</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Takara</td><td>9012</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premezcla)</td><td>Takara</td><td>R040Q</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de nutrientes</td><td>LandBridge</td><td>CM106</td><td></td></tr><tr><td>Agar nutriente</td><td>LandBridge</td><td>CM107</td><td></td></tr><tr><td>Medio de selenita cistina</td><td>LandBridge</td><td>CM225</td><td></td></tr><tr><td>XLD</td><td>LandBridge</td><td>CM219</td><td></td></tr><tr><td>MAC&nbsp;</td><td>LandBridge</td><td>CM908</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella agar cromogénico</td><td>CHROMagar</td><td>SA130</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella suero de diagnóstico</td><td>Tianrun</td><td>SAL60</td><td></td></tr><tr><td>Shigella suero de diagnóstico</td><td>Tianrun</td><td>SHI54</td><td></td></tr><tr><td>hisopo anal (tubo colector plus)</td><td>Huachenyang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos</td><td>Mingsheng</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>micro-bucle</td><td>Weierkang</td><td>W511</td><td></td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Jinghong</td><td>DNP-9082</td><td></td></tr><tr><td>autoclave</td><td>AUL</td><td>SS-325</td><td></td></tr><tr><td>baño seco</td><td>Jinghong</td><td>KB-20</td><td></td></tr><tr><td>sistema automatizado de identificación microbiana</td><td>bioM&eacute; Se podría utilizar rieux</td><td>VITEK2</td>, <td>se podría utilizar otro sistema equivalente</td></tr><tr><td>, se podría utilizar la máquina de PCR fluorescente en tiempo real</td><td>ThermoFisher</td><td>ABI7500</td> otra <td>máquina equivalente</td></tr></tbody></table>.

una plataforma de alto rendimiento para la detección de salmonella spp. /shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda ocurre de vez en cuando, especialmente cuando las personas que manejan alimentos y agua están infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. El método estándar de oro para la detección de Salmonella spp./Shigella spp es cultura directa pero esto es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para Salmonella spp./Shigella spp de detección, usando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) combinada con cultura guiada. Hay dos etapas principales: la cultura guiada y PCR en tiempo real. Para la primera etapa (PCR en tiempo real), se explica cada paso del método: la muestra recogida, previo enriquecimiento, extracción de ADN y PCR en tiempo real. Si el resultado PCR en tiempo real es positivo, entonces se realiza la segunda etapa (cultura guiada): cultivo selectivo, identificación bioquímica y serológica caracterización. También ilustramos resultados representativos generados de él. El protocolo descrito aquí sería una plataforma valiosa para la detección rápida, específica, sensible y de alto rendimiento de Salmonella spp. /Shigella spp.

Se aplicó el protocolo para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp en heces anal muestras de personas que se manejan alimentos y agua.
En el paso de la PCR en tiempo real, como se muestra en la figura 5A, hubo una amplificación exitosa en canal HEX, que significó que la muestra mezclada era positiva para Salmonella spp. Luego se realizó una PCR en t...

Salmonella sppShigella spp., son patógenos comunes atribuidas a la diarrea. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Este método proporciona una plataforma de alto rendimiento para el cribado de Salmonella y Shigella. La principal ventaja de esta técnica es repetir, específica, sensible y de alto rendimiento. Esta técnica combina el método rápido NAAT y el cultivo en el que primero se aplicó el cribado de PCR en tiempo real, y luego se enviaron positivos para el cultivo y la identificación de bacterias.Aunque este método se centra en el cribado de Salmonella y Shigella, también se puede aplicar a otros patógenos como Vibrios, Staphylococcus, E.coli y et cetera. La demostración visual de este método es crítica ya que la selección de la colonia correcta es difícil debido a la flora de fondo en las muestras. Para comenzar, agregue tres mililitros de caldo de nutrientes a cada muestra.Luego, incuba las muestras a 36 grados centígrados durante seis horas. Después de esto, centrifugar el cultivo de pre-enriquecimiento a 800 gs durante dos minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, y centrifugarlo de nuevo durante cinco minutos a 12.000 gs.Después de desechar el sobrenadante, añadir 100 microlitros de solución de extracción de ADN al pellet. Luego, vórtice el tubo durante un minuto. A continuación, calienta la muestra a 1.000 grados Centígrados en el baño seco.Después de repetir la centrifugación, recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En primer lugar, cree la mezcla de reacción y establezca el programa de ciclismo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, realice PCR en tiempo real en una máquina de PCR fluorescente en tiempo real.En primer lugar, añadir 100 microlitros del cultivo de pre-enriquecimiento a cinco mililitros de medio cristal de selenita. Luego, incubar el cultivo a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas. A continuación, recoja un bucle de la cultura y extiéndalo en un plato.Luego, incuba la placa a 36 grados Celsius durante 18 a 24 horas. Después de la incubación, seleccione colonias sospechosas y transfieralas a un plato. Incubar la placa a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas.A continuación, identifique la colonia sospechosa utilizando un sistema automatizado de identificación microbiana. Para comenzar la caracterización del antígeno O, agregue una gota de los sueros polivalentes del antígeno O a una diapositiva limpia. Transfiera un bucle de la colonia al tobogán y muele en el suero.Si las bacterias parecen arena que fluye, repita el tratamiento previo con sueros monovalentes de antígeno O hasta que se caracterice el antígeno. Para comenzar la caracterización del antígeno H, agregue una gota de sueros polivalentes de antígeno H a una diapositiva limpia. Luego, recoge un bucle lleno de la colonia y la encuadría en el suero.Utilice sueros monovalentes de antígeno H para repetir el tratamiento hasta que se caracterice el antígeno H específico. Para separar la cultura, recoja un bucle de la cultura de pre-enriquecimiento y extiéndalo en un plato. Luego, incuba el lugar a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas.Después de la incubación, recoger una colonia de aspecto sospechoso en un plato. Incubar la placa a 36 grados centígrados durante 17 a 24 horas. A continuación, someta la colonia a una identificación bioquímica mediante un sistema automatizado de identificación microbiana.A continuación, aplica una gota de sueros polivalentes de la especie Shigella a un portaobjetos limpio. Luego, usa un micro-loop para recoger algunas de las bacterias y moler en el suero. Finalmente, si los sueros se asemejan a la arena que fluye, utilice sueros monovalentes de especies de Shigella para caracterizar aún más las bacterias.Utilizando este protocolo, se examinaron muestras de heces de pacientes para detectar especies de Salmonella y Shigella. Utilizando PCR en tiempo real, hubo una amplificación exitosa en el canal HEX, lo que indica que la muestra fue positiva para las especies de Salmonella. La PCR adicional en tiempo real indicó que la muestra dos era positiva para Salmonella y fue elegida para el cultivo guiado de especies de Salmonella.En el cultivo guiado de las especies de Salmonella, las colonias rosadas y púrpuras fueron chapadas por separado y sometidas a identificación bioquímica. Los resultados indicaron que las colonias de la muestra dos eran Salmonella paratyphi B.Utilizando PCR en tiempo real, hubo amplificación exitosa en el canal FAM, lo que indica que la muestra era positiva para las especies de Shigella. La PCR adicional en tiempo real indicó que la muestra 10 era positiva para Shigella y fue elegida para la cultura guiada.En el cultivo guiado de las especies Shigella, las colonias de color rojo rosa-rojo e incoloro fueron chapadas por separado y sometidas a identificación bioquímica. Los resultados indicaron que la muestra 10 contenía la bacteria Shigella sonnei fase II. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la limitación del método debido a la variación de la secuencia.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la referencia cultural directa, para evitar falsos resultados negativos de PCR en tiempo real. Esta técnica allana el camino para los investigadores en el campo de la detección de Salmonella y Shigella, ya que el nuevo protocolo podría aumentar la tasa positiva en dos y disminuir la carga de trabajo y TAT significativamente. No olvide que trabajar con Salmonella y Shigella puede ser extremadamente peligroso, y el equipo de protección personal, EPP, siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.

a-high-throughput-platform-for-screening-salmonella-sppshigella

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Inmunología e Infección

Un procedimiento de cultivo a base de líquido y dispensación...

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

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Fuente: Yang, Z., et al. Una plataforma de alto rendimiento para el cribado de especies de Salmonella /Shigella spp.. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demuestra el enriquecimiento selectivo e identificación de Salmonella utilizando xilosa lisina desoxicolato (XLD) y agar cromogénico. El caldo de selenito favorece el crecimiento de Salmonella , mientras que el agar XLD revela colonias de centro negro mediante la producción de sulfuro de hidrógeno. El agar cromogénico confirma la identidad mediante...

Enriquecimiento selectivo e identificación de especies de Salmonella utilizando xilosa lisina desoxicolato y agar cromogénico

Un ensayo de alto rendimiento in vitro de Salmonella fenotipo u otra asociación bacteriana, invasión, y la replicación en las células fagocíticas con capacidad de alto rendimiento se ha desarrollado. Se empleó el método de evaluar las cepas mutantes de Salmonella gen knockout por sus implicaciones en la interacción huésped-patógeno.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo Salmonella enterica Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

El objetivo general del presente Protocolo es sintetizar funcional nanosensores para el portable, eficiente, y rápida detección de específicamente las bacterias patógenas a través de una combinación de relajación magnética y las modalidades de emisión de fluorescencia.

Patógenos de transmisión alimentaria proyección utilizando Magneto-fluorescente Nanosensor: Detección rápida de e. Coli O157: H7

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Aquí presentamos un protocolo para medir actividad de Shigellacidal de anticuerpos en suero. Suero se mezcla con las bacterias y complemento exógeno, que se incubó, y la mezcla de reacción se platea en placas de agar. Viables bacterias forman colonias que se cuentan, usando un enumerador de colonias automatizado y permite determinar la concentración bactericida.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.

Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

Los microbios intestinales pueden afectar positiva o negativamente la salud de su huésped a través de mecanismos específicos o conservados. Caenorhabditis elegans es una plataforma conveniente para detectar tales microbios. El presente protocolo describe el cribado de alto rendimiento de 48 aislados bacterianos para determinar su impacto en la resistencia al estrés de los nematodos, utilizados como sustitutos de la salud de los gusanos.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.

Aplicación del sistema inteligente de detección de fagos y pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento y lar índice de resistencia a los antimicrobianos

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Aprende a detectar Salmonella y Shigella mediante PCR en tiempo real combinada con cultivo guiado. Este método de alto rendimiento mejora la especificidad y sensibilidad en el diagnóstico microbiológico clínico.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

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