Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.
7 de noviembre de 2018
Salmonella sppShigella spp., son patógenos comunes atribuidas a la diarrea. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.
Este método proporciona una plataforma de alto rendimiento para el cribado de Salmonella y Shigella. La principal ventaja de esta técnica es repetir, específica, sensible y de alto rendimiento. Esta técnica combina el método rápido NAAT y el cultivo en el que primero se aplicó el cribado de PCR en tiempo real, y luego se enviaron positivos para el cultivo y la identificación de bacterias.
Aunque este método se centra en el cribado de Salmonella y Shigella, también se puede aplicar a otros patógenos como Vibrios, Staphylococcus, E.coli y et cetera. La demostración visual de este método es crítica ya que la selección de la colonia correcta es difícil debido a la flora de fondo en las muestras. Para comenzar, agregue tres mililitros de caldo de nutrientes a cada muestra.
Luego, incuba las muestras a 36 grados centígrados durante seis horas. Después de esto, centrifugar el cultivo de pre-enriquecimiento a 800 gs durante dos minutos. Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, y centrifugarlo de nuevo durante cinco minutos a 12.000 gs.
Después de desechar el sobrenadante, añadir 100 microlitros de solución de extracción de ADN al pellet. Luego, vórtice el tubo durante un minuto. A continuación, calienta la muestra a 1.000 grados Centígrados en el baño seco.
Después de repetir la centrifugación, recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En primer lugar, cree la mezcla de reacción y establezca el programa de ciclismo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, realice PCR en tiempo real en una máquina de PCR fluorescente en tiempo real.
En primer lugar, añadir 100 microlitros del cultivo de pre-enriquecimiento a cinco mililitros de medio cristal de selenita. Luego, incubar el cultivo a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas. A continuación, recoja un bucle de la cultura y extiéndalo en un plato.
Luego, incuba la placa a 36 grados Celsius durante 18 a 24 horas. Después de la incubación, seleccione colonias sospechosas y transfieralas a un plato. Incubar la placa a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas.
A continuación, identifique la colonia sospechosa utilizando un sistema automatizado de identificación microbiana. Para comenzar la caracterización del antígeno O, agregue una gota de los sueros polivalentes del antígeno O a una diapositiva limpia. Transfiera un bucle de la colonia al tobogán y muele en el suero.
Si las bacterias parecen arena que fluye, repita el tratamiento previo con sueros monovalentes de antígeno O hasta que se caracterice el antígeno. Para comenzar la caracterización del antígeno H, agregue una gota de sueros polivalentes de antígeno H a una diapositiva limpia. Luego, recoge un bucle lleno de la colonia y la encuadría en el suero.
Utilice sueros monovalentes de antígeno H para repetir el tratamiento hasta que se caracterice el antígeno H específico. Para separar la cultura, recoja un bucle de la cultura de pre-enriquecimiento y extiéndalo en un plato. Luego, incuba el lugar a 36 grados centígrados durante 18 a 24 horas.
Después de la incubación, recoger una colonia de aspecto sospechoso en un plato. Incubar la placa a 36 grados centígrados durante 17 a 24 horas. A continuación, someta la colonia a una identificación bioquímica mediante un sistema automatizado de identificación microbiana.
A continuación, aplica una gota de sueros polivalentes de la especie Shigella a un portaobjetos limpio. Luego, usa un micro-loop para recoger algunas de las bacterias y moler en el suero. Finalmente, si los sueros se asemejan a la arena que fluye, utilice sueros monovalentes de especies de Shigella para caracterizar aún más las bacterias.
Utilizando este protocolo, se examinaron muestras de heces de pacientes para detectar especies de Salmonella y Shigella. Utilizando PCR en tiempo real, hubo una amplificación exitosa en el canal HEX, lo que indica que la muestra fue positiva para las especies de Salmonella. La PCR adicional en tiempo real indicó que la muestra dos era positiva para Salmonella y fue elegida para el cultivo guiado de especies de Salmonella.
En el cultivo guiado de las especies de Salmonella, las colonias rosadas y púrpuras fueron chapadas por separado y sometidas a identificación bioquímica. Los resultados indicaron que las colonias de la muestra dos eran Salmonella paratyphi B.Utilizando PCR en tiempo real, hubo amplificación exitosa en el canal FAM, lo que indica que la muestra era positiva para las especies de Shigella. La PCR adicional en tiempo real indicó que la muestra 10 era positiva para Shigella y fue elegida para la cultura guiada.
En el cultivo guiado de las especies Shigella, las colonias de color rojo rosa-rojo e incoloro fueron chapadas por separado y sometidas a identificación bioquímica. Los resultados indicaron que la muestra 10 contenía la bacteria Shigella sonnei fase II. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la limitación del método debido a la variación de la secuencia.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la referencia cultural directa, para evitar falsos resultados negativos de PCR en tiempo real. Esta técnica allana el camino para los investigadores en el campo de la detección de Salmonella y Shigella, ya que el nuevo protocolo podría aumentar la tasa positiva en dos y disminuir la carga de trabajo y TAT significativamente. No olvide que trabajar con Salmonella y Shigella puede ser extremadamente peligroso, y el equipo de protección personal, EPP, siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.
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Resumen
Este artículo presenta una plataforma de alto rendimiento para el cribado de Salmonella spp. y Shigella spp. mediante PCR en tiempo real combinada con cultivo guiado. El método destaca por su especificidad, sensibilidad y eficiencia en la detección de patógenos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Detección de patógenos
- Selección de alta capacidad
Antecedentes
- Salmonella y Shigella son causas importantes de diarrea.
- Los métodos precisos y rápidos de detección son cruciales para la salud pública.
- Los métodos tradicionales pueden ser lentos y menos específicos.
- Este estudio presenta un enfoque novedoso que combina técnicas de cultivo y NAAT.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de cribado de alto rendimiento para Salmonella y Shigella.
- Mejorar la especificidad y sensibilidad en la detección de patógenos.
- Proporcionar una demostración visual del método para una mejor selección de colonias.
Métodos Utilizados
- Aplicación de la detección por PCR en tiempo real a muestras.
- Envío de muestras positivas para cultivo bacteriano e identificación.
- Uso de caldo nutriente para preparar las muestras.
- Evaluación visual para seleccionar las colonias correctas entre la flora de fondo.
Resultados principales
- El método demostró alta especificidad y sensibilidad.
- Se puede adaptar para otros patógenos como Vibrios y E. coli.
- La orientación visual mejoró la precisión en la selección de colonias.
- Se confirmó la capacidad de alto rendimiento.
Conclusiones
- El método desarrollado es efectivo para la detección de Salmonella y Shigella.
- Ofrece una alternativa confiable a los métodos tradicionales de detección.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otras bacterias patógenas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección rápida y específica de patógenos entéricos como Salmonella y Shigella es fundamental para la vigilancia de la salud pública y la respuesta a brotes. Esta plataforma de alto rendimiento combina la detección por PCR en tiempo real con cultivo guiado para mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo hasta el resultado en comparación con los métodos tradicionales de cultivo. El enfoque facilita la validación temprana del blanco en la investigación de enfermedades infecciosas al permitir la identificación confiable de patógenos a partir de muestras clínicas complejas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la confirmación de la presencia del patógeno en modelos preclínicos de infección.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional del blanco mediante la identificación específica de serotipos de Salmonella y Shigella.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en la reducción del riesgo del blanco al disminuir los falsos negativos en los flujos de trabajo de detección de patógenos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para el cribado posterior de eficacia antimicrobiana o de vacunas.
- Valor operativo: Estandariza el procesamiento de muestras mediante preenriquecimiento, extracción de ADN y PCR en tiempo real para obtener resultados reproducibles.
- Escalabilidad: Permite el cribado de alto rendimiento de muestras clínicas o ambientales con menos tiempo de manipulación manual.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al proporcionar muestras con patógenos confirmados para estudios de eficacia.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la detección de marcadores de virulencia mediante caracterización bioquímica y serológica tras el cultivo.
- Avance Ajustado al Riesgo: Orienta las decisiones de continuar o descartar al confirmar la presencia del patógeno antes de invertir en candidatos terapéuticos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase temprana del descubrimiento, apoyando la verificación de hipótesis en modelos de infección y permitiendo la detección confiable de patógenos antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al confirmar a Salmonella o Shigella como agentes causales en modelos de enfermedad.
- Selección: Proporciona muestras listas para ensayos con carga cuantificada de patógenos mediante valores de Ct de PCR en tiempo real para análisis comparativo.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (valores de Ct, recuentos de colonias) que permiten la comparación de condiciones y la selección de resultados positivos.
- Investigación Traducional: Asegura el uso de sistemas relevantes a la enfermedad mediante la validación de la presencia del patógeno en modelos antes de las pruebas terapéuticas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de selección reutilizable aplicable a múltiples patógenos más allá de Salmonella y Shigella.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al confirmar la identidad del patógeno mediante PCR ortogonal y confirmación por cultivo.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de preenriquecimiento, centrifugación y extracción de ADN.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir la carga de trabajo y el tiempo de respuesta, permitiendo un mayor volumen de muestras procesadas.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos confiables de detección de patógenos para decisiones de avance o interrupción.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microbiología molecular y diseño de ensayos de PCR en tiempo real.
- Depende del acceso a equipos de PCR en tiempo real con detección fluorescente y sistemas automatizados de identificación microbiana.
- Necesita la estandarización entre equipos de los criterios de manejo de muestras y selección de colonias.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros patógenos debido a las variaciones en los medios de enriquecimiento y reactivos serológicos.
- Incluye limitaciones prácticas, como la variación de secuencias que afecta la unión de cebadores y la necesidad de usar EPP al manipular patógenos de Nivel de Bioseguridad 2.
