Name: Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a aislar neutrófilos de baja densidad de lavado peritoneal postoperatorio para estudiar la formación de NETs y su interacción con células tumorales. Esta técnica permite visualizar la adhesión de células cancerosas a trampas extracelulares.

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Agradecemos a la Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabajo técnico y administrativo. También, agradecemos a los Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina y Kazuya Takahashi por su colaboración para la adquisición de la muestra en sala de operaciones. Este trabajo fue apoyado por una subvenciones para la investigación científica desde el Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón y la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (17K 10606).

LDN se obtuvieron de pacientes incluidos en este estudio y fueron aprobados por el institucional de Junta de Jichi Universidad médica.
1. aislamiento de LDN de lavados de la cavidad Abdominal y de detección de red
<ol><li>Adquisición de la muestra<ol>
<li>Infunda 1.000 mL de solución salina estéril en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes sometidos a cirugía abdominal debido a malignidad gastrointestinal. Nota: Las muestras se obtuvieron de pacientes que se sometieron a una gastrectomía, colectomía o esofagectomía sin prejuicios basados en edad y sexo. Solución salina fue transferida a un recipiente y vierte en el abdomen entero dentro de un minuto. Esto habitualmente se realiza un lavado peritoneal postoperatorio sin efectos significativos en los pacientes.</li>
		<li>Lavado de la cavidad abdominal extensivamente durante al menos 1 minuto. Nota: Se recomienda que el líquido infundido se revuelve lentamente con las manos del cirujano para que las muestras son uniformes.</li>
		<li>Recuperar 200 mL del líquido de lavado con cuatro jeringas de 50 mL. Nota: A veces se usa un conector de goma para tomar los líquidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar la purificación de la LDN peritoneal con mAb específico de granulocitos, CD66b16. Nota: Dado que la capa intermedia después de la centrifugación de gradiente de densidad contiene muchas células mononucleares, selección positiva de neutrófilos polimorfo con CD66b mAb fue realizada.<ol>
<li>Transferir el líquido de lavado peritoneal a un tubo de 50 mL. Nota: En este paso, pasar los fluidos a través de un filtro de nylon μm 100 para quitar impurezas.</li>
		<li>Centrifugar el líquido peritoneal a 270 x g por 7 min a TA.</li>
		<li>Resuspender el pellet en 5 mL de PBS con EDTA 0,02%.</li>
		<li>Recubrimiento con cuidado 5 mL de la suspensión celular en una solución de gradiente de densidad de 3 mL.</li>
		<li>Centrifugue a 1.700 x g durante 15 min a temperatura ambiente sin ningún roturas.</li>
		<li>Cosecha el ~ 2-3 mL de solución que contiene las capas intermedias (figura 1A) utilizando una pipeta y mezclar con 10 mL de PBS con EDTA 0,02%.</li>
		<li>Centrifugar el líquido peritoneal a 400 x g por 7 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Agregar otros 10 mL de PBS con EDTA 0,02% y centrifugar a 270 x g por 7 min en RT. descartar el sobrenadante.</li>
		<li>Disolver el precipitado de células (1 x 107) en 60 μL de buffer para el kit de separación magnética de células.</li>
		<li>Añadir 20 μl del bloque Fc a las pelotillas e incubar 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Añadir 20 μl de anti-CD66b conjugado con microesferas e incube un adicional 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lave y vuelva a suspender los pellets en 500 μl de tampón de MACS.</li>
		<li>La suspensión de células se aplican a una columna magnética en el campo magnético de un separador magnético conveniente y recoger el fluir por el células de CD66b(-) que contiene por la columna con 15 mL de tampón de lavado.</li>
		<li>Retire el separador magnético de la columna y eliminar inmediatamente las células CD66b(+) magnéticamente etiquetadas empujando firmemente el émbolo en la columna. Nota: La población de células CD66b(+) consiste principalmente en neutrófilos según lo determinado por análisis FACS indicando que > 95% de la fracción CD66(+) son positivas para CD16, CD11b y CD15, pero negativas para CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Generación de redes<ol>
<li>Después de la centrifugación a 270 x g por 7 min a temperatura ambiente, volver a suspender la LDN aislado (5 x 106) en 1 mL de RPMI1640 con 10% FCS.</li>
		<li>Cultura de la LDN en una placa recubierta bien 6 poly-L-lisina (6 cm de diámetro) por 2 h a 37 ° c en 5% CO2.</li>
		<li>Añadir el contraste fluorescente verde (un membrana impermeable tinte para teñir el núcleo y cromosomas) en la concentración final de 5 μm.</li>
		<li>Inmediatamente observe la morfología de redes (el extracelulares componentes de DNA de la LDN en microscopía de fluorescencia).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tinción de las células del Tumor con el tinte de vinculador de célula fluorescente rojo
<ol><li>Preparar el cáncer humano líneas celulares MKN45, NUGC y OCUM-1.</li>
	<li>Lavan 1 x 107 células con PBS + EDTA 0,02% en un tubo de 15 mL y centrifugar a 270 x g por 7 min a TA.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución para el tinte de coloración a las pelotillas y pipetee suavemente.</li>
	<li>Disolver 4 μL de colorante de rojo fluorescente de la célula vinculador en 1 mL de solución para tinción y mezclar con la suspensión de células en el paso 2.2.</li>
	<li>Incubar los pellets durante 4 min a TA.</li>
	<li>Añadir 4 mL de DMEM (10% FBS) para detener la reacción de tinción.</li>
	<li>Centrifugar 270 x g por 7 min y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Repita los pasos del 2.6 y 2.7 dos veces.</li>
	<li>Consulte con un microscopio de fluorescencia (excitación = 551 nm, emisión = 567 nm) que las células del tumor se tiñen de rojo.</li>
</ol>3. análisis del Tumor Cell adhesión a las redes
<ol><li>Resuspenda las células del tumor tinción fluorescente roja (1 x 106) en 1 mL de RPMI 1640 suplementado con 0,1% de BSA.</li>
	<li>Añadir las células del tumor a la cultura LDN que producen las redes tal como se describe en el paso 1.3.</li>
	<li>Incubar por 5 min a 37 ° c, que permite a las células del tumor a las redes de contacto. Nota: Incubación induce la adhesión de células de tumor LDN o las placas.</li>
	<li>Quite el medio y lave suavemente los pocillos añadiendo 2 mL de medio precalentado (0.1% de BSA + RPMI 1640) y girando el plato.</li>
	<li>Repetir dos veces el procedimiento de lavado en el paso 3.4. Nota: Desde redes débil fije a la placa, el lavado debe hacerse lo más suavemente posible para evitar la eliminación de las redes ellos mismos.</li>
	<li>Añadir el colorante fluorescente verde para la tinción del núcleo y los cromosomas en una concentración final de 5 μg/mL para la visualización de las redes.</li>
	<li>Observar las redes y une las células del tumor con los filtros adecuados (verde, excitación = 504 nm, emisión = 523 nm; rojo, excitación = 551 nm, emisión = 567 nm).</li>
	<li>Combinar las figuras para mostrar las células del tumor que son atrapadas por las redes. Nota: En algunos experimentos, enzima de degradación de ADN fue agregado a la cultura LDN (concentración final de 100 U/mL) 5 min antes de la incubación durante 5 minutos.</li>
</ol>4. tiempo transcurrido Video análisis de las células tumorales atrapados
<ol><li>Cultura la LDN peritoneal en un 35 mm ronda plato recubierto con poli-l-lisina como se describe en el paso 1.3.</li>
	<li>Añadir el colorante fluorescente verde para la tinción del núcleo y los cromosomas para visualizar redes tal como se describe en el paso 1.3.</li>
	<li>Después de 1 min de incubación, retirar los medios de comunicación y añadir 2 mL de 0.1% de BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Retirar los medios de comunicación y añadir células sin manchas de 1 x 106 MKN45 suspendieron en 0.1% de BSA + RPMI 1640. Incubar por 5 min a TA.</li>
	<li>Retirar todas las células del tumor lavando suavemente como se describe en el paso 3.4 y agregar DMEM con 10% FCS suplementado con 100 u/mL penicilina y 100 μg/mL estreptomicina.</li>
	<li>Montar la placa de cultivo en un sistema de observación de célula entera vista y seleccione el campo apropiado en cual tumor las células son atrapadas por las redes.</li>
	<li>Continuar conjuntamente la cultura por otros 2 días y tomar fotos continuas del campo cada 6 minutos bajo luz normal y la fluorescencia, que detecta las células MKN45 y redes, respectivamente.</li>
	<li>Superponer imágenes en cada punto y construir vídeos Time-lapse utilizando el software de visor de imágenes.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Estudios previos han reportado que circulan las células del tumor puede quedar atrapado por sustratos NET en vivo10,11. Las células de cáncer de mama metastásico han demostrado para estimular neutrófilos e inducir la formación de redes, que ayuda en el crecimiento de células tumorales en el órgano blanco del17. Además, se encontró que las culturas a corto plazo de LDN de líquido de lavado postoperatorio producción redes masivas qu...

Neutrófilos nucleares polimorfo en la sangre circulante se separan típicamente de células mononucleares a través del método de preparación de gradiente de densidad. Sin embargo, algunos neutrófilos conocidas como baja densidad neutrófilos (LDN), con fenotipos de CD11b(+), CD15(+), CD16(+) y CD14(-), son co purificados con las células mononucleares. El número relativo de LDN aumenta significativamente en varias condiciones patológicas incluyendo enfermedades autoinmunes1,2, sepsis3y cáncer4,5. Estudios previos han demostrado que LDN son una clase fenotípicamente y funcionalmente distinta de neutrófilos6. Cabe señalar que LDN en la sangre circulante son más propensos a producir neutrófilos trampas extracelulares (redes) de densidad normal neutrófilos2,7. Redes son como estructuras compuestas de ácidos nucleicos, las histonas, proteasas y proteínas citosólicas y granulares, y eficientemente pueden atrapar y destruir patógenos8.
Recientemente, las redes se han demostrado para capturar no sólo microbios, pero también las plaquetas y circulación de las células del tumor que pueden ayudar en trombo formación9 y tumor metástasis10,11. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de las interacciones adhesivas entre las redes y las plaquetas o células tumorales aún no están claros. Más recientemente, un ensayo de adherencia en vitro reveló que las células de la leucemia mieloide (K56212) y células de carcinoma de pulmón (A54913) conexión a redes de las integrinas β1 y β3. Los autores utilizaron neto stock aislado de neutrófilos y activado por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de la adherencia sustrato14. Aunque este ensayo permite la detección de interacciones reales con componentes netos en la ausencia de neutrófilos, es discutible si la "célula libre stock neto" aislado por centrifugación de alta velocidad mantiene la estructura molecular idéntica a las redes producidas en vivo. Recientemente, encontramos del líquido de lavado peritoneal después de cirugía abdominal contiene muchos maduros LDN, que generó enormes redes y conectados a las células del tumor que causa metástasis peritoneal15. En este estudio, se examinó con éxito la adhesión de las células del tumor a redes intactas sin ninguna manipulación física. A continuación, os mostramos detalles de una técnica para detectar las interacciones adhesivas entre redes y células tumorales libres.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SUECIA</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade; Sangre entera CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Solución de enjuague</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solución Madre</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Columnas LS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de ácido nucleico verde SYTOX de 5 mM en DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit de enlazador de células fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640 <tr><td>Medio</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Glucosa media-alta (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Solución 0.5mol/l-EDTA (pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, Japón</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA</td><td>gibco por life technologies, México</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino Albúmina polvo liofilizado, &ge; 96% (electroforesis en gel de agarosa)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU</td>. <td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies Japón</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Profiláctico de plasmocina</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-EE. UU</td><td>. ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>MICROPLACA recubierta de poli-L-lisina 6Well</td><td>IWAKI, Japón</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>MICROPLACA recubierta de poli-L-lisina 24Well</td><td>IWAKI, Japón</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico fluoresceína</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japón</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de observación de células de visión completa</td><td>Nikon, Kanagawa, Japón</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de cáncer gástrico humano MKN45</td><td>Riken, Tukuba Japón</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de cáncer gástrico humano NUGC-4</td><td>Riken, Tukuba Japón</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de cáncer gástrico humano OCUM-1</td><td>Universidad de la Ciudad de Osaka, Japón</td><td>N/A</td><td>Regalo del Dr. M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Activa neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), que pueden capturar y destruir microbios. Estudios recientes sugieren que las redes están implicadas en varios procesos de enfermedad como autoinmune enfermedad, trombosis y tumor metástasis. A continuación, os mostramos una técnica detallada en vitro para detectar actividad de red durante la captura de las células tumorales libres, que crecen después de la conexión a redes. En primer lugar, se recopilaron neutrófilos de baja densidad (LDN) de líquido de lavado peritoneal postoperatorio de pacientes sometidos a laparotomies. Cultivo a corto plazo de LDN dio lugar a la masiva formación neta que fue visualizada y contratinción cromosoma nuclear verde fluorescente. Después de la incubación conjunta de líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 y NUGC-4 con las redes, muchas células del tumor fueron atrapadas por las redes. Posteriormente, el accesorio completamente fue abrogado por la degradación de las redes con DNasa I. Time-lapse video reveló que no murió atrapadas por las redes de las células del tumor pero en su lugar crecieron vigorosamente en un cultivo continuo. Estos métodos pueden ser aplicados a la detección de interacciones adhesivas entre redes y varios tipos de células y materiales.

En la cultura de 2 horas, LDN CD66b(+) derivado de las estructuras de cadena mostró líquido de lavado peritoneal teñido con tinte verde fluorescente para nuclear y cromosoma (figura 1B), mientras CD66b(-) no las células mononucleares (figura 1). Sin embargo, cuando las culturas LDN fueron pretratadas con 100 U/mL la ADNasa, la estructura característica fue destruida (figura 1), indicando que fueron c...

Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de las subpoblaciones de neutrófilos en la inmunología tumoral, especialmente sobre la participación mecánica de las trampas extracelulares de neutrófilos, o NET, en la metástasis tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que permite visualizar las interacciones adhesivas de las células tumorales con los NET intactos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer.Los NET derivados de subconjuntos específicos de neutrofilos pueden promover la metástasis tumoral. La demostración del procedimiento estará a cargo de Junko Shoniohara de nuestro laboratorio. Para adquirir los neutrófilos, primero infundir un litro de solución salina estéril normal inmediatamente antes del cierre de la herida directamente en la cavidad abdominal de un paciente que acaba de someterse a una cirugía abdominal debido a una neoplasia maligna gastrointestinal y lavar la cavidad abdominal extensamente durante al menos un minuto.A continuación, agite la solución salina dentro de la cavidad y recupere 200 mililitros de líquido lavado con cuatro jeringas de 50 mililitros. En el laboratorio, transfiera el líquido de lavado peritoneal a través de un filtro de nailon de 100 micrómetros a tubos individuales de 50 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 5 mililitros de PBS suplementado con EDTA al 0,02% y superponga cuidadosamente cada suspensión celular sobre tres mililitros de solución de gradiente de densidad.Después de la separación en gradiente de densidad, coseche de dos a tres mililitros de la capa intermedia de cada tubo y lave las muestras de líquido peritoneal con 10 mililitros de PBS fresco más EDTA por tubo. Agrupe los gránulos en 10 mililitros de PBS fresco más EDTA para un lavado adicional y diluya las celdas a una concentración de 10 a la séptima celdas por 60 microlitros de concentración de tampón de clasificación de celdas activadas magnéticamente, o MACS. Bloquee cualquier unión inespecífica con 20 microlitros de bloque Fc durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, seguido de la adición de 20 microlitros de perlas magnéticas anti-CD66b.Después de 10 minutos a cuatro grados centígrados, lave y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón MACS y agregue las células a una columna magnética de tamaño adecuado dentro del campo magnético de un separador magnético adecuado. Cuando todas las celdas negativas CD66b hayan pasado por la columna, agregue 15 mililitros de tampón MACS nuevo al depósito de la columna y transfiera la columna del separador magnético a un nuevo tubo cónico. A continuación, sumerja inmediatamente la columna para enjuagar el positivo CD66b marcado magnéticamente en el tubo.Después de la centrifugación, vuelva a suspender los neutrófilos aislados de baja densidad a una velocidad de cinco veces 10 a la sexta celdas por mililitro de RPMI1640 medio suplementado con una concentración de FBS y siembre 1 mililitro de neutrófilos por pocillo en la placa recubierta de poli-L-lisina de seis pocillos. Después de dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, tiñir las células de cada pocillo con un tinte nuclear y cromosómico impermeable de membrana fluorescente apropiado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y observar inmediatamente la morfología de los NET mediante microscopía de fluorescencia. Para evaluar la adhesión de las células tumorales a los NET, resuspenda las células tumorales gástricas teñidas con el colorante fluorescente contrastante a una velocidad de 10 a 6 por mililitro de RPMI1640 suplementadas con una concentración de albúmina sérica bovina al 0,1% y agregue un mililitro de células tumorales a cada pocillo de los cultivos de neutrófilos de baja densidad.Después de cinco minutos a 37 grados centígrados, retire el sobrenadante de cada pocillo y lave suavemente las celdas dos veces con 2 mililitros de medio RPMI1640 precalentado suplementado con BSA por lavado. Una incubación de cinco minutos es suficiente para detectar la unión específica de NET. Agregue el medio calentado al costado de cada pocillo, agite lentamente suavemente la placa y retire el sobrenadante con un aspirador.Los NET y las células tumorales adheridas se pueden observar mediante microscopía de fluorescencia. Para un análisis de video de lapso de tiempo de las células tumorales atrapadas, cultive y tiña los neutrófilos peritoneales de baja densidad en una placa de 35 milímetros, placa recubierta de poli-L-lisina, como se ha demostrado, seguido de un breve lavado en dos mililitros de 0.1% BSA más RPMI1640. Reemplace el medio con una vez 10 a la sexta células tumorales gástricas sin teñir suspendidas en dos mililitros de RPMI suplementado con BSA para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.Al final de la incubación, enjuague las células con dos mililitros de RPMI fresco suplementado con BSA durante cinco minutos a temperatura ambiente, seguido de un suave remolino para eliminar las células tumorales no adheridas. A continuación, sustituya el sobrenadante por DMEM suplementado con FBS y antibióticos y monte la placa en un sistema de observación de células de vista completa para el análisis de lapso de tiempo de la captura de células tumorales por parte de los NET. Después de dos horas de cultivo, los neutrófilos de baja densidad CD66b positivos derivados del líquido de lavado peritoneal exhiben estructuras de cadena por tinción nuclear y cromosómica verde fluorescente, mientras que las células mononucleares negativas CD66b no lo hacen.Sin embargo, cuando los cultivos de neutrófilos de baja densidad se pretratan con 100 unidades por mililitro de ADNasa I, las estructuras características se destruyen, lo que indica que las estructuras están compuestas de ADN extracelular expulsado de los neutrófilos. Cuando los neutrófilos de baja densidad se cultivan en placas de plástico sin recubrimiento, se pueden observar muchos grupos de NET flotando dentro del medio con pocos NET adheridos al fondo de la placa. Después de cinco minutos de incubación con una línea celular de tumor gástrico marcada con fluorescencia, muchas células tumorales se adhieren a los neutrófilos dentro de los NET, un fenómeno que no se observa después del tratamiento previo con DNAse I. También se observan patrones de adhesión similares para otras células tumorales.OKUM-1 y NUGC-4. Curiosamente, mientras que los NET desaparecen gradualmente a las pocas horas de un cocultivo prolongado de células tumorales, las células tumorales atrapadas por los NET comienzan a proliferar vigorosamente después de la liberación de NET. Durante este procedimiento, es importante recordar que, debido a que los NET se adhieren débilmente al plato, los procesos de lavado y transferencia de platos deben realizarse de manera especialmente cautelosa.Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores de diversos campos de la ciencia biomédica exploren la relación causal de los TNE con diversas enfermedades como la trombosis, el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y las enfermedades autoinmunes.

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Research

Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

En este video, describimos el procedimiento para aislar neutrófilos de baja densidad, o LDN, del líquido de lavado peritoneal de un paciente humano postoperatorio. Las LDN así obtenidas se pueden utilizar en experimentos posteriores para comprender su papel en el crecimiento y la progresión del tumor.

Aislamiento peritoneal de neutrófilos de baja densidad: una técnica para obtener neutrófilos de baja densidad a partir de líquido de lavado peritoneal mediante la clasificación de células activadas magnéticamente

Este video muestra la tinción fluorescente de trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos, los componentes extracelulares del ADN expulsados por los neutrófilos. Esta técnica permite la visualización de la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NET.

Microscopía de fluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs: una técnica para observar la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NETs

En este video, analizamos el comportamiento post-adhesión de las células cancerosas atrapadas en trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) mediante el co-cultivo de neutrófilos de baja densidad y células de cáncer gástrico. El análisis de video de lapso de tiempo ayuda a monitorear varios eventos celulares y estudiar el papel de los NET en condiciones patológicas.

Microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo de trampas extracelulares de neutrófilos o NET: una técnica para analizar la interacción posterior a la adhesión entre las células cancerosas y los NET

Este video muestra una técnica in vitro para generar y aislar trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos. Los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica y se estimulan con acetato de forbol miristato (PMA) para producir NET. Durante la incubación, los neutrófilos se someten a un proceso de muerte celular (NETosis) para liberar NETs que comprenden cromatina descondensada mezclada con proteínas citoplasmáticas granulares.

Una técnica in vitro para generar trampas extracelulares de neutrófilos humanos

En este video, demostramos un ensayo que utiliza microscopía de fluorescencia para detectar la adhesión de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). En los pocillos de prueba, hay un aumento notable en el número de células cancerosas marcadas con fluorescencia que se adhieren a los NET, mientras que los pocillos tratados con DNasa exhiben una adhesión reducida de las células cancerosas a los NET.

Ensayo de adhesión in vitro para detectar la adherencia de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos

Los neutrófilos desempeñan un papel importante no solo en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores, sino que también están implicados en la vigilancia inmunitaria de las células tumorales. En este trabajo describimos técnicas relacionadas con el aislamiento de neutrófilos con propiedades antitumorales y métodos para monitorizar la función de neutrófilos antitumorales in vitro e in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Se describe una serie de métodos, que incluyen el aislamiento de lipoproteínas de baja densidad (LDL) del plasma humano, la diferenciación de células HL-60 en células similares a neutrófilos, la preparación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en presencia de LDL y la estimulación de células endoteliales aórticas humanas con una mezcla de NET y LDL.

Estimulación de las células endoteliales vasculares mediante trampas extracelulares de neutrófilos en presencia de lipoproteínas de baja densidad

Aprende a aislar neutrófilos de baja densidad de lavado peritoneal postoperatorio para estudiar la formación de NETs y su interacción con células tumorales. Esta técnica permite visualizar la adhesión de células cancerosas a trampas extracelulares.

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales (Video) | JoVE Journal

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

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