Micropunción del espacio de Bowman en ratones por 2 fotones microscopía
11 de octubre de 2018
Presentamos uso de microscopia de 2 fotones a una micropipeta dentro del espacio urinario de Bowman en los ratones, la combinación de 2 técnicas fundamentales de la fisiología renal. Uso de la microscopia de 2 fotones supera críticas limitaciones de la microscopia convencional para estudios de micropunción fisiología renal.
Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiología de un solo nefrón, incluidas las tasas de filtración glomerular de proteínas y metabolitos sistémicos y sus contribuciones a la fisiología tubular. La principal ventaja de esta técnica de micropuntura es que permite el acceso al espacio de Bowman y a la nefrona cortical en todos los ratones. Generalmente, los individuos nuevos en este método tendrían problemas porque requieren pasos de preparación ejecutados correctamente.
Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la parte del de los dedos, aplique un ung ón en los ojos y use cinta adhesiva para inmovilizar las extremidades de un ratón adulto de 20 a 25 gramos. Usa una crema depilatoria para eliminar todo el cabello en el lado izquierdo del animal, y usa el bazo para localizar el riñón izquierdo a través de la piel en el lado dorsal y caudal del bazo. Haga una incisión de 0,5 centímetros en la piel, seguida de una incisión más pequeña en el peritoneo lo suficientemente grande como para que el riñón sea empujado a través.
Extruir el riñón con una presión suave y colocar una forma de estabilizador renal de polisiloxano alrededor del tejido. Alinee el riñón con el espaciador de tal manera que la superficie más lateral del riñón se extienda más allá del estabilizador por aproximadamente un milímetro, y fije el riñón a la forma con adhesivo de cianoacrilato. Pegue una placa de cabeza a la forma del estabilizador y monte la placa de cabezal en las barras de montaje en la placa base.
A continuación, llene el pozo en el soporte de polisiloxano con una solución de agarosa al uno por ciento y sostenga un resbalón de cubierta de 10 milímetros en la parte superior de la forma hasta que la agarosa esté firme. Selle el resbalón de la cubierta a la placa de la cabeza con pegamento y cree un anillo alrededor del resbalón de la cubierta con cemento dental. A continuación, inyecte de 100 a 150 microlitros de FITC-Dextran retro-orbital y mueva rápidamente el ratón y la placa de fijación a la etapa del microscopio de dos fotones.
Después de centrarse manualmente en la superficie renal, cambie al modo de dos fotones sin escaneo y explore la ventana de imágenes para localizar un glomerero objetivo que sea mayor de 30 micrómetros por debajo del resbalón de la cubierta y menos de 400 micrómetros de la cápsula renal lateral. Registre la distancia lateral y vertical al glomérulo objetivo. A continuación, registre las coordenadas de la etapa x, y y z para el glomerulo.
Y por último, suba el punto focal objetivo alrededor de un milímetro en la columna de agua sin cambiar las coordenadas de la etapa x e y. Conduzca la punta de la pipeta en la columna de agua y encienda la excitación DAPI. Mueva la pipeta en las dimensiones x e y hasta el punto de fluorescencia máxima de la punta.
Este será el centro del objetivo. Cambie el ajuste de cita x a proteína fluorescente roja y visualice la pipeta con el ocular para permitir un centrado preciso en la vista ocular. Vuelva a dos fotones para encontrar la pipeta debajo de la vista de dos fotones en vivo y coloque la punta precisamente en el centro de la imagen, esta es la posición de registro.
A continuación, guarde una imagen de la pipeta y registre la etapa y las coordenadas del controlador de micropipetas. Retire la pipeta de la columna de agua en el eje X sin mover el eje y y z y mueva la pipeta z a la coordenada z del glomerulo de destino y al borde del riñón. Observe la etapa x y calcule la pipeta de borde renal x utilizando el desplazamiento de la etapa de registro x.
Aumente la etapa x para mover el escenario hacia la pipeta hasta que el borde del riñón esté lejos a la izquierda de la pantalla, sin dejar de estar visible. Avance rápidamente la pipeta a unos 100 micrómetros de distancia de la pipeta de borde renal X acaba de calcular. Aumente la ganancia roja y comience a avanzar la punta de la pipeta lentamente hasta el borde del riñón bajo imágenes de dos fotones en vivo mientras monitorea el histograma de píxeles rojos.
Conduzca la pipeta en el eje X lentamente hasta la pipeta de destino del glomérulo x, manteniendo un ojo en el escenario x. Al llegar al glomérulo, documente la posición con una pila z. Con la pipeta en posición, ajuste la microbopa para inyectar 100 nanolitros de perfluorodecalin durante dos minutos.
Para garantizar la patencia de la pipeta y reducir la confusión de la taponada de la pipeta durante la entrada. Después de cuatro a seis minutos de filtración, ajuste la microbopa para aspirar hasta 300 nanolitros a una velocidad de hasta 50 nanolitros por minuto. Este hermoso glomérulo cercano a la superficie muestra imágenes favorables debido a la posición superficial del glomerulo a 20 micrómetros por debajo de la cápsula renal.
El glomérulo está demasiado cerca de la superficie para la microinyección sin embargo, ya que la pipeta golpearía el resbalón de la cubierta. Estos glomérulos están posicionados de forma óptima con los bordes laterales 250 micrómetros a la derecha y aparecen menos afilados debido a la refracción causada por su profundidad de 70 micrómetros de la cápsula. Ambos factores que hacen que los glomérulos sean accesibles.
En esta imagen típica de entrada renal, una proyección de intensidad media de una pila z con vistas ortogonales revela la punta de la pipeta dentro del espacio de Bowman, observe el artefacto espectral de punta de pipeta roja de la fluorescencia extremadamente brillante de los puntos cuánticos dispuestos en la sección cónica de la punta. Aquí, un renderizado de volumen de una pila z adquirido después de colocar una pipeta en el espacio de Bowman, muestra la punta de la pipeta dentro del espacio que colinda con el tuft capilar. Si se utiliza una pipeta con una abertura demasiado grande, la cápsula renal puede romperse causando sangrado subcapsular y la entrada de la sangre en el lumen de la pipeta.
Usando este método, se han identificado 17 proteínas, principalmente de bajo peso molecular, a partir de un mínimo de dos péptidos únicos por proteína. Junto con este método, se pueden utilizar otros métodos como la maspectroscopia, las mediciones de electrodos sensibles a los iones y la inyección de anticuerpos fluorescentes para responder preguntas sobre el papel de los solutos luminales en la fisiología tubular y glomerular.
Descripción general
Este estudio investiga la fisiología de la nefrona individual utilizando una técnica única de microscopía de 2 fotones para acceder al espacio de Bowman en ratones. Los hallazgos demuestran el potencial de este enfoque para medir las tasas de filtración glomerular de proteínas y metabolitos, aportando información sobre la fisiología tubular.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Fisiología de túbulo nefronal
- Fisiología renal
- Filtración glomerular
Antecedentes
- Comprender la función renal a nivel de nefrona individual es fundamental para la investigación fisiológica.
- La microscopía tradicional tiene limitaciones en las técnicas de micropunción.
- La microscopía de 2 fotones proporciona capacidades de imagen mejoradas.
Métodos Utilizados
- Técnica de micro-punción con microscopía de 2 fotones
- Sistema de modelo murino
- Imagen de fluorescencia con FITC-Dextrano y DAPI
Resultados principales
- La técnica permite la medición de las tasas de filtración glomerular en tiempo real.
- Reducido problemas comunes como el obstrucción de pipetas durante la inserción.
- Se identificaron 17 proteínas a partir del fluido de desbordamiento muestreado.
Conclusiones
- Este método mejora la capacidad de estudiar la fisiología renal en animales vivos.
- Abre nuevas vías para investigar el papel de los solutos en la función renal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica permite un acceso directo al espacio de Bowman en ratones, superando las limitaciones de la micropunción convencional y la imagenología con 2 fotones al posibilitar intervenciones y mediciones a nivel de nefrona individual. Apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación de la fisiología renal al proporcionar un análisis cuantitativo del aspirado a partir del filtrado glomerular. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al permitir mediciones en tiempo real de presión, carga, flujo y composición molecular dentro de la nefrona.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las tasas de filtración glomerular de proteínas y metabolitos sistémicos para validar dianas terapéuticas.
- Valor operativo: Proporciona acceso al espacio de Bowman y al nefrón cortical en todos los ratones, favoreciendo estudios reproducibles de interacción con la diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para ensayos posteriores al permitir la recuperación del filtrado del espacio de Bowman y de los segmentos del túbulo nefronal.
- Valor operativo: Apoya la estandarización de ensayos mediante lecturas cuantitativas por cromatografía líquida/espectrometría de masas de proteínas y metabolitos aspirados.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mejora los estudios de sistemas relevantes para enfermedades al permitir la medición del papel de los solutos luminados en la fisiología tubular y glomerular.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el acceso repetido a la fisiología de nefronas individuales en animales vivos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la investigación preclínica, al proporcionar acceso directo al nefrón para estudios mecanicistas y lecturas alineadas con biomarcadores.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la micropunción del espacio de Bowman para evaluar los procesos de filtración y reabsorción.
- Detección: Mejora la disponibilidad y reproducibilidad del ensayo mediante guía estereotáctica y visualización de pipetas recubiertas con puntos cuánticos para un posicionamiento preciso en el glomérulo.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de presión, carga, flujo y composición molecular (por ejemplo, 17 proteínas de bajo peso molecular mediante LC/MS) para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir estudios longitudinales del manejo de solutos en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la investigación fisiológica renal en múltiples proyectos debido a su adaptabilidad a diversas mediciones (electrodos sensibles a iones, anticuerpos fluorescentes, espectrometría de masas).
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en la fisiología de nefronas individuales mediante el análisis directo del aspirado.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y escalabilidad mediante la estabilización estereotáctica del riñón y la navegación de la pipeta guiada por imágenes.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos tempranos a nivel de nefrona sobre la filtración de proteínas y metabolitos, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas renales basada en datos cuantitativos de flujo y composición del espacio de Bowman.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía renal, microscopía de dos fotones y manejo de micropipetas.
- Depende de un microscopio de dos fotones, micropipetas recubiertas con puntos cuánticos, un aparato estereotáctico y sistemas de estabilización con agarosa.
- Necesita la estandarización entre equipos en cuanto a la preparación quirúrgica, los parámetros de imagen y los protocolos de recolección del aspirado.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes cepas de ratones y modelos de enfermedad que afectan la profundidad y accesibilidad glomerular.
- Está limitado por la profundidad de imagen (~100 μm por debajo de la cápsula) y el posible trauma vascular durante la inserción de la micropipeta, lo cual puede provocar hemorragia subcapsular si no se maneja con cuidado.
