Name: Síntesis y caracterización de placenta condroitina sulfato (plCSA) - Targeting lípido - nanopartículas de polímero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas de lípido-polímero conjugadas con plCSA-BP para entrega dirigida de fármacos a tumores humanos y trofoblastos placentarios. Este método simple y reproducible mejora el tratamiento del cáncer y trastornos placentarios.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (2016YFC1000402), la Fundación Nacional de Ciencias naturales (81571445 y 81771617) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Guangdong (2016A030313178) a X.F. y el fondo de investigación básica de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) a X.F.

1. preparación de soluciones Stock
<ol><li>Preparar una solución acuosa de etanol 4% diluyendo 4 mL de etanol absoluto con 100 mL de agua ultrapura. La solución a 4 ° C. Nota: Agua ultrapura se define como agua sin contaminantes tales como bacterias, partículas, iones o nucleasas. Agua ultrapura fue obtenida de un sistema de purificación de agua con una resistencia de blanco de hasta 18.2 mΩ·cm, que significa baja contaminación aniónica.</li>
	<li>Preparar un 1 mg/mL solución stock de la lecitina de soja mediante la disolución de 20 mg de lecitina de soja en 20 mL de la solución acuosa de etanol al 4%. Almacenar la solución madre de lecitina de soja a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare un 25 mg/mL solución DSPE-PEG (2000)-COOH disolviendo 100 mg de DSPE-PEG-COOH en 4 mL de la solución acuosa de etanol al 4%. Almacenar la solución a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare un 10 mg/mL solución DOX disolviendo 50 mg de DOX en 5 mL de agua ultrapura. Almacenar la solución DOX a 4 ° C en la oscuridad.</li>
	<li>Prepare un 2 mg/mL solución PLGA mediante la disolución de 20 mg de PLGA en 10 mL de acetonitrilo. Almacenar la solución PLGA a 4 ° C. PRECAUCIÓN: Acetonitrilo es inflamable y tóxico. Operar con cuidado en una campana de humos y use el equipo de personal adecuado, tales como batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes de látex.</li>
	<li>Prepare una solución ácido (MES, pH 6.0) de 0.1 M 2-(morpholino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido disolviendo 2,17 g de MES en 100 mL de agua ultrapura. Almacenar la solución a 4 ° C.</li>
</ol>2. síntesis de la DNPs
Nota: Para evitar la degradación fotoquímica de DOX, todas las operaciones se realizaron en la oscuridad. Las nanopartículas fueron sintetizadas por un método de sonicación solo paso previamente divulgados11,13,14.
<ol><li>Añadir 3 mL de la solución acuosa de etanol 4% a un tubo de centrífuga estéril de 10 mL. Luego, añadir 90 μg de la solución madre de lecitina de soja, 210 μg de la solución madre de DSPE-PEG-COOH y 750 μg de la solución madre de DOX a 3 mL de la solución acuosa de etanol al 4%.</li>
	<li>El tubo de centrífuga en un baño de hielo y el baño de hielo en un procesador de ultrasonidos.</li>
	<li>Con una jeringa de 1 mL pipetear 2 mg de la solución madre de PLGA gota a gota (1 gota/4-6 s) en el tubo de centrífuga. Mientras tanto, someter a ultrasonidos el tubo usando un Sonificador Ultrasonidos de una frecuencia de 20 kHz y una amplitud de salida de 30% por 5 min para sintetizar la DNPs. Nota: Para sintetizar partículas uniformes con tamaños pequeños, la velocidad en que la solución del EGLP se goteó en el tubo tiene que ser lento, y debe evitarse la generación de burbujas.</li>
	<li>Purificar la DNPs lavando la solución anterior en tampón MES de 0,1 M (pH 6.0) 3 veces con un filtro de centrífugas (MWCO, 10 kDa). Centrifugar a 4 ° C y 1000 × g durante 3 minutos cada vez. Por último, debe permanecer aproximadamente 1 mL de nanopartículas MES resuelto. Nota: Este es un punto de parada aceptable en el procedimiento. Si no utiliza la conjugación de péptidos, las nanopartículas pueden ser purificadas por tampón PBS (pH 7.4), y la DNPs purificada pueden almacenarse a 4° C en la oscuridad.</li>
</ol>3. Conjugación de péptidos a la DNPs
<ol><li>
Activación de Ester
	<ol>
<li>Agregar 0,4 mg de EDC (concentración final de 2 mM) a 1 mL de la DNPs.</li>
		<li>Añadir a 0,24 mg de NHS a la reacción (concentración final de 2 mM). Nota: Para la fácil adición de la cantidad correcta de EDC y NHS, una solución stock se puede preparar si los reactivos están disueltos y utilizados inmediatamente.</li>
		<li>Mezclar bien los componentes de la reacción y coloque la reacción en una coctelera; permita que la reacción de 30min - 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reacción de Amina
	<ol>
<li>Aumentar el tampón, pH 7.2-7.5 uso PBS (20 ×, pH 7,4).</li>
		<li>Añadir 0,5 mg del péptido plCSA-targeting (plCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) a la solución de reacción. Nota: Antes además, disolver los péptidos en acetonitrilo 20%. Si no son absorbibles péptidos, sonicación en un sonicador de baño puede útil.</li>
		<li>Mezcle bien la solución y luego colocar en una coctelera; permitir la reacción proceder a 4 ° C durante la noche en la oscuridad.</li>
		<li>Coloque la solución de conjugado en las bolsas de diálisis (MWCO, 3.500 Da) a dializarse y purificar la DNPs plCSA con tampón PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente por 24 h en la oscuridad. Nota: Alternativamente, purificación puede realizarse como en el paso 2.4 para obtener plCSA-DNPs.</li>
		<li>Para las aplicaciones de la cultura de célula, filtrar la solución reconstituida a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm para eliminar posibles precipitados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Caracterización de lípidos objetivo plCSA-nanopartículas de polímero
<ol><li>
Medición de las dimensiones de nanopartículas hidrodinámico con dispersión ligera dinámica (DLS)
	<ol>
<li>Nanopartículas diluidas con agua ultrapura (50-fold dilución). Carga de 500 μl de la muestra en una cubeta siguiendo las instrucciones del instrumento potencial DLS o zeta. Nota: Potencial Zeta y cubetas DLS pueden diferenciarse en base a las especificaciones del instrumento.</li>
		<li>Una vez finalizada la medición, registre el diámetro de la partícula, índice de polidispersidad (PDI) y potencial zeta. Medio los resultados de 4 repitieron lecturas y calcular la desviación estándar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Nota: Se observó la morfología de las nanopartículas por TEM con el método de tinción negativa. 24<ol>
<li>Nanopartículas diluidas con agua ultrapura (400-fold dilución). Añadir 20 μl de la muestra en una cuadrícula TEM y dejar para reposar 5 minutos.</li>
		<li>Añada 100 μl de ácido fosfotúngstico al 2% (w/v) y dejar para reposar 2 minutos mecha la gota.</li>
		<li>Secar la rejilla TEM a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ajustar la tensión de aceleración de TEM a 80 kV y ampliar la imagen a × 100.000 para visualizar las nanopartículas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinación de la eficiencia de encapsulación (EE) y LE
	<ol>
<li>Generación de la curva estándar. Disolver DOX en agua ultrapura para preparar soluciones DOX de cinco diferentes concentraciones: 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL y 100 μg/mL. Medir la absorción de las soluciones DOX a 480 nm con un espectrómetro de UV-VIS. Generar una curva estándar basada en las concentraciones de DOX.</li>
		<li>Diluir 25 μl de nanopartículas con 500 μl de agua ultrapura. Medir la absorción a 480 nm con un espectrómetro de UV-VIS. Calcular las concentraciones de la droga por la curva estándar.</li>
		<li>Calcular LE utilizando la siguiente ecuación: LE = ((cantidad de droga en nanopartículas) / (peso total de materiales)) × 100%.</li>
		<li>Calcular el EE mediante la siguiente ecuación: EE = ((cantidad de droga en nanopartículas) / (cantidad de agregado drogas)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medición de la eficiencia verbal usando el análisis de (BCA) ácido bicinchoninic 25 , 26 , 27<ol>
<li>Pipetear 25 μl de soluciones de péptido estándar (tabla 1) o plCSA-DNPs en pocillos de microplacas en duplicado. Añadir 200 μL de reactivo de trabajo a cada pocillo y mezclar la placa bien en una coctelera de placa por 30 s.</li>
		<li>Cubra la placa e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Medir la absorbancia a 562 nm en un lector de placas. Utilice la curva estándar generada para calcular las concentraciones de plCSA de plCSA-DNPs.</li>
		<li>Calcular la eficiencia verbal utilizando la siguiente ecuación: Eficiencia verbal = ((cantidad de péptido en nanopartículas) / (cantidad de añadido péptido)) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Frasco</td>
			<td>Volumen de diluyente (μL)</td>
			<td>Volumen y fuente de péptidos (μL)</td>
			<td>Concentración final del péptido (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>300 de Stock</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>frasco una dilución de 250</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>250 de dilución del vial B</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>250 de dilución frasco C</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>200 de dilución frasco D</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>250 de dilución frasco E</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>100 de dilución frasco F</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Preparación de péptidos estándar
5. fluorescencia microscopía evaluación de la absorción de nanopartículas plCSA dirigida en células de coriocarcinoma (JEG3)
<ol><li>Semilla de células en placas de 12 bien estériles a 1.0 × 104 células/pozo con completo DMEM/F12 (cDMEM/F12, que contiene 1% penicilina/estreptomicina y 10% suero bovino fetal (FBS)). Permitir a las células a crecer hasta 60% de confluencia a 37 ° C y 5% de CO2 en condiciones húmedas.</li>
	<li>Quitar los medios de comunicación y agregar 1 mL de medio fresco frío con un contenido bajo del suero (5% SBF) y DNPs o plCSA-DNPs (5 μg de equivalentes DOX).</li>
	<li>Incubar la mezcla de células y nanopartículas a 4 ° C durante 1 hora.</li>
	<li>Después de la incubación, retirar los medios de comunicación y lavar las células 3 veces con PBS. Luego, añadir 1 mL de cDMEM fresco/F12 e Incube las células a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Retire el cDMEM/F12 y lavar las células 3 veces con PBS.</li>
	<li>Añadir 2 mL de frío 4% paraformaldehido (PFA) e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos reparar las células.</li>
	<li>Retire la PFA. Lavar una vez las células con 2 mL de PBS. Añadir 1 mL de PBS con DAPI (1 μg/mL) para núcleos coloración e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Aspire el PBS y lavar las células 3 veces con PBS.</li>
	<li>Añadir medio de montaje y la imagen de la fluorescencia con una microscopía de fluorescencia, utilizando los canales verdes y azules para visualizar los DOX y núcleos, respectivamente.</li>
</ol>

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<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+TAT+peptide+in+drug+delivery+systems%3A+proteolytic+stability+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements.</a> Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+ocular+delivery+to+laser-induced+choroidal+neovascularization+by+dual+internalizing+RGD+and+TAT+peptide-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).</li>
</ol>

X.F. y B.Z. son los inventores de la patente PCT/CN2017/108646 y 201710906587.6 enviado por SIAT que cubre un método de síntesis de nanopartículas dirigidas plCSA y aplicación. No hay posibles conflictos de interés fueron revelados por otros autores.

Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. El método de sonicación solo paso para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico es rápido, reproducible y diferente del típico nanoprecipitation métodos que implican calentamiento, Vortex o evaporación. Por lo tanto, el método desarrollado reduce significativamente el tiempo de síntesis. Además, la EDC/NHS bioconjugate utilizado en este protocolo es una técnica comúnmente...

Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Por lo tanto, selectiva tumor targeting es la clave para explorar métodos terapéuticos exitosos. Nanopartículas ofrecen una oportunidad prometedora para tratamiento del cáncer, y conjuntos moleculares con diferentes grupos funcionales serán mejorar la eficacia de los medicamentos y reducir los efectos secundarios asociados1,2. Por otra parte, nanopartículas sistemas utilizan principalmente pasiva y activa dirigida a para alcanzar el objetivo tumores3.
Orientación pasivo explota las características innatas de nanopartículas y permeabilidad mejorada y los efectos de la retención (EPR) para llegar a las células del tumor. Liposomas catiónicos se han utilizado con éxito para entregar varios medicamentos anticancerosos a tumores en aplicaciones clínicas4,5,6. A pesar del potencial efecto terapéutico de cáncer eficaz, una concentración baja de drogas en la región del tumor y una incapacidad para distinguir las células tumorales de los tejidos normales son dos limitaciones importantes de nanopartículas dirigidas a pasivo7.
Activadas estrategias dirigida a toman ventaja de antígeno-anticuerpo, ligando-receptor y otras interacciones de reconocimiento molecular específicamente entregar drogas a tumores8. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa ampliamente en la mayoría de las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por otra parte, la proteína de la malaria VAR2CSA puede atar específicamente a plCSA9,10. Por lo tanto, VAR2CSA puede ser una herramienta para apuntar las células de cáncer humano. Sin embargo, cuando VAR2CSA es conjugados a nanopartículas, la proteína de larga duración puede limitar la penetración de nanopartículas en las células del tumor. Recientemente, descubrió un péptido de Unión plCSA (plCSA-BP), derivado de la proteína de la malaria VAR2CSA. nanopartículas de polímero lipídico plCSA BP conjugado enlazado rápidamente a células de coriocarcinoma y aumentó significativamente la doxorrubicina (DOX) actividad anticancerosa en vivo11; Estas partículas también específicamente adheridos a trofoblastos placentarios y podrían servir como una herramienta para la entrega específica de drogas a la placenta12.
Nanopartículas de polímeros lípidos consisten en una cáscara de monocapa de lípidos y un núcleo polímero hidrofóbico y representan un portador nuevo de la entrega de la droga. Estas nanopartículas combinan las ventajas de liposomas y nanocarriers poliméricos, tales como tamaño de nanopartícula controlable, alta biocompatibilidad, liberación sostenida del fármaco, eficacia de drogas alta carga (LE) y excelente estabilidad13. En este trabajo, utilizamos un método de sonicación solo paso para sintetizar nanopartículas de polímero lipídico. Este método es rápido, conveniente y adecuado para escala-para arriba y ha sido ampliamente utilizado para la preparación de nanopartículas de polímero lipídico por nuestro grupo11,14 y otros15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) clorhidrato de carbodiimida (EDC) es una carbodiimida popular utilizada como agente de reticulación para conjugar la biomoléculas que contiene aminas y carboxylates19. Además de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) es el reactivo verbal más común en la superficie y nanopartículas Conjugación reacciones20,21. NHS puede reducir el número de reacciones secundarias y mejorar la estabilidad y rendimiento de éster intermediarios22,23.
Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigidos. En primer lugar, se describe la síntesis de sonicación solo paso de nanopartículas de polímero de lípidos cargados de DOX (DNPs). Luego, se introduce una técnica de bioconjugate EDC/NHS para la generación de nanopartículas de polímero lipídico plCSA-BP-conjugados. Esta técnica de bioconjugate puede utilizarse también para conjugar otros anticuerpos y péptidos a nanopartículas. Finalmente, describimos el análisis de propiedades y en vitro fisicoquímico utilizado para caracterizar las nanopartículas de polímeros de lípidos plCSA dirigidos. Creemos que estas nanopartículas de polímero lipídico plCSA dirigida podrían constituir un sistema eficaz para la entrega específica de fármacos para cánceres más humanos y la entrega específica de cargas a la placenta para tratar los trastornos placentarios.

<table><tbody><tr><td>Péptido plCSA</td><td>Shanghai GL Biochem</td><td>573518</td><td>para la síntesis de péptidos</td></tr><tr><td>Absoluto de etanol</td><td>Sinopharm 10009218 químico</td><td></td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Lecitina de soja</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>para la síntesis</td></tr> <tr><td>de nanopartículasDoxorrubicina</td><td>JKComático</td><td>113424</td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1008621</td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Procesador ultrasónico</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo (MWCO 10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>para la</td></tr> purificación de nanopartículas <tr><td>centrífuga</td><td>Sigma</td><td>3-18KS</td><td>para la purificación de nanopartículas</td></tr><tr><td>Ácido 2-[morfolino]etanosulfónico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>Clorhidrato de carbodiimida (EDC) 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td>para la conjugación de péptidos</td></tr><tr><td>Bolsas de diálisis</td><td>Spectrum</td><td>132592T</td><td>para la purificación de nanopartículas</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 10 mL, polipropileno</td><td>Aladdin</td><td>S-025</td><td>para síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 mL, polipropileno</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>para diversas aplicaciones</td></tr><tr><td>0,22 y mu; M filtro de jeringa estéril</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>para la purificación de nanopartículas</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml, polipropileno</td><td>BD</td><td>328421</td><td>para la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Nano ZS</td><td>para analizador de tamaño de partícula</td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td> fosfotúngstico <td>para TEM</td></tr><tr><td>Rejilla TEM</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>espectrómetro UV-VIS</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td><td>para transmisión TEM</td></tr><tr><td> microscopio electrónico</td><td>JEOL</td><td>JEM-100CXII</td><td>para analizador de tamaño de partícula</td></tr><tr><td>reactivo BCA A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td>para ensayo de BCA</td></tr><tr><td>reactivo BCA B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23224</td><td>para ensayo de BCA</td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>para BCA </td></tr><tr><td>lector de placas</td><td>de ensayo Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan&trade; Pruebas GO</td><td>for BCA</td></tr><tr><td>placas de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr>Banco de células<td>JEG3</td><td>de la Academia China de Ciencias</td><td>TCHu195</td><td>Placenta humana</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30272.01</td> sin <td>rojo de fenol</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10100</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070063</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td><td>para la absorción celular</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1372021</td><td>para la absorción celular</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sangon Biotech A606584</td><td></td><td>para la absorción celular</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Life</td><td>P36961</td><td>para la absorción celular</td></tr></tbody></table>

síntesis y caracterización de placenta condroitina sulfato (plcsa) - targeting lípido - nanopartículas de polímero

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Un método terapéutico eficaz cáncer reduce y elimina tumores con mínima toxicidad sistémica. Nanopartículas activamente dirigida a ofrecen un enfoque prometedor para la terapia del cáncer. El sulfato de condroitina placentaria glycosaminoglycan (plCSA) se expresa en una amplia gama de las células cancerosas y trofoblastos placentarios y palúdica proteína que var2csa puede atar específicamente a plCSA. Un péptido de Unión placentaria divulgado el sulfato de condroitina A (plCSA-BP), derivado de proteína de la malaria VAR2CSA, puede enlazar también específicamente plCSA en las células cancerosas y trofoblastos placentarios. Por lo tanto, las nanopartículas conjugadas de BP plCSA podrían utilizarse como una herramienta para el suministro de medicamentos dirigidos a los cánceres humanos y trofoblastos placentarios. En este protocolo, se describe un método para sintetizar lípidos-polímero conjugado de BP plCSA nanopartículas cargadas con doxorrubicina (plCSA-DNPs); el método consiste en una técnica de sonicación solo paso y bioconjugate. Además, se describen varios métodos para la caracterización de plCSA-DNPs, incluyendo la determinación de sus propiedades fisicoquímicas y la absorción celular de las células de coriocarcinoma placentario (JEG3).

En este protocolo, PLGA, DSPE-PEG-COOH y soja lecitina son un polímero representativo, lípido-PEG-COOH conjugado y lípidos, respectivamente. La síntesis de nanopartículas a través de un solo paso método de sonicación polímero lipídico plCSA dirigida y una técnica EDC/NHS se ilustra en la figura 1. En primer lugar, bajo condiciones de sonicación, lecitina de soja, PLGA y DSPE-PEG-COOH uno mismo-montar al core-shell de forma estructurada DNPs. El núcle...

Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis del péptido de Unión placentaria condroitin sulfato A (plCSA-BP)-conjugados polímero lipídico nanopartículas via solo paso sonicación y bioconjugate técnicas. Estas partículas constituyen una novedosa herramienta para la entrega específica de la terapéutica para tumores más humanos y trofoblastos placentarios para tratar cánceres y trastornos placentarios.

Síntesis y caracterización de placenta condroitina sulfato (plCSA) - Targeting lípido - nanopartículas de polímero

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la administración dirigida de terapias a cánceres humanos y el cistoblast de placenta. La principal ventaja de esta técnica es que es un método simple y reproducible para sintetizar péptidos conjugados en otras partículas. Para empezar, agregue tres milímetros de cuatro por ciento de etanol a un tubo estéril de centrífuga de 10 mililitros.A continuación, añadir 90 microgramos de solución de stock de lecitina de soja, 210 microgramos de solución de stock de ácido DSPE-PEG-carboxílico, y 750 microgramos de solución de stock DOX. Utilice una jeringa de un mililitro para pipetear dos miligramos de solución de material PLGA. Coloque el tubo centrífugo en un baño de hielo en un procesador ultrasónico y sonicar durante dos minutos.A continuación, añada la solución de material PLGA en el tubo de centrífuga. Para purificar los DSP, utilice un filtro de centrífuga para lavar la solución en el búfer MES molar 0.1. Luego, centrifugar la solución a 1000 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.Para comenzar la activación del éster, agregue 0.4 miligramos de EDC a un mililitro de DNP. A continuación, agregue 0,24 miligramos de NHS a la reacción. Luego, permita que la reacción ocurra hasta una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.Después de esto, mezcle los componentes de reacción a fondo y coloque la reacción en una coctelera. Para iniciar la reacción de la amina, utilice PBS para aumentar el pH del tampón de 7.2 a 7.5. A continuación, añadir 0,5 miligramos de péptido de orientación pICSA a la solución de reacción.Mezcle bien la solución y colóquela en una coctelera. Luego, permita que la reacción continúe a cuatro grados centígrados durante la noche en la oscuridad. Al día siguiente, llene las bolsas de diálisis con la solución conjugada.Purifique los DSP pICSA con el tampón PBS a temperatura ambiente durante 24 horas en la oscuridad. Después de cultivar las células de acuerdo con el protocolo de texto, quite los medios y agregue un mililitro de medios frescos y fríos con el cinco por ciento de los DSP o DNP del pICSA. Luego, incubar la mezcla celular y nanopartícula durante una hora a cuatro grados Centígrados.Después de esto, retire el medio y lave las células tres veces con PBS. Luego, agregue un mililitro de medios frescos e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de esto, retire el medio y lave las células tres veces con PBS.Luego, agregue dos mililitros de frío, cuatro por ciento de PFA e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire la PFA y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, agregue un mililitro de PBS con DAPI para la tinción de núcleos.Dejar incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, añada el medio de montaje y la imagen de la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. Usando este protocolo, los DNP fueron preparados y conjugados con éxito con pICSA BP. Después de la conjugación, el diámetro de los DSP primarios aumentó a aproximadamente 109 nanómetros.Las imágenes TEM de los DSP y los DNPs pICSA mostraron que las partículas estaban bien dispersas y generalmente demostradas morfología esférica. El potencial zeta de las nanopartículas fue negativo 20,1 y 29,9 milivoltios, lo que indica que las nanopartículas eran altamente estables. El ensayo de absorción celular JEG3 indicó los DSP pICSA enlazados a las células JEG3 en un plazo de 30 minutos.Por lo tanto, el pICSA BP se conjugaba eficientemente a la superficie. Al intentar este procedimiento, es importante recordar sonicar la mezcla durante uno o dos minutos antes de agregar PLGA. Siguiendo este procedimiento, nuestros métodos como el ensayo HPLC se pueden realizar con el fin de determinar la eficiencia de conjugación con mayor precisión.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología reproductiva exploraran la posibilidad de tratamiento dirigido a la placenta en complicaciones del embarazo.

synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

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Nanopartículas de PLGA formadas por emulsión simple o doble con vitamina E-TPGS

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