Name: Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de adhesión dinámica para analizar terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal usando células inmunes humanas bajo condiciones de flujo. Este método permite evaluar anticuerpos anti-integrinas y quimioquinas.

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La investigación de CN, IA, SZ y NMF fue apoyada por el centro interdisciplinario de investigación clínica (IZKF) y el programa ELAN de la Universidad de Erlangen-Nuremberg, Else Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, de Crohn alemán y Colitis Foundation (DCCV), la investigación clínica grupo CEDER el Consejo alemán de investigaciones (DFG), el programa de tema DFG en la Microbiota, la iniciativa de campo emergente y la DFG colaboración investigación centros 643, 796 y 1181.

Los estudios descritos en las secciones siguientes se han realizado según aprobación de la Comisión de ética de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.
1. preparación de capilares
<ol><li>Conectar tubos capilares rectangulares para el tubo de goma estirando el tubo por un lado con unas tijeras pequeñas y cuidadosamente insertar el capilar (aproximadamente 0,5 cm) en el tubo. Sellar la conexión entre tubo y tubo con película de plástico de la parafina.</li>
	<li>Capa del tubo capilar con 20 μl de la solución de control de isotipo correspondiente utilizando una pipeta de p20 o histórico (recombinante Fc quimera; histórico, por ejemplo, MAdCAM-1, en tampón de recubrimiento (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES) de 5 μg/mL) (líquido empapará sí mismo en el capilar). Luego, sellar el lado no conectado a la tubería con la película de parafina plástica e incubar durante al menos 1 h a 37 ° C. Utilizar un capilar llenado sólo con el tampón de recubrimiento o con el control de isotipo correspondiente como control negativo.</li>
	<li>Quitar la película de parafina plástica desde la punta del tubo capilar, vaciar la capa dejando el remojo líquido fuera del capilar sobre un papel toalla y bloquear los capilares durante al menos 1 hora con 20 μl de bloquear la solución (1 x PBS con 5% BSA) a 37 ° C. Sellar el lado abierto del tubo capilar con película de plástico de la parafina. No retire la solución de bloqueo antes de proceder a la microscopía.</li>
</ol>2. célula de aislamiento, tratamiento y preparación para microscopía
Nota: Estos pasos pueden realizarse durante la incubación períodos necesarios para la preparación capilares.
<ol><li>Recoge 18 mL de sangre completa anticoagulada con una colección de sangre aséptica de la vena cubital del voluntariado de las personas (p. ej., pacientes de EII o controles sanos) después de consentimiento informado conforme a las normas del local Comité de ética. Nota: Este paso debe realizarse sólo por personal médico entrenado y experimentado según regulaciones nacionales o locales.</li>
	<li>Llenar la sangre en un tubo de 50 mL y diluir a un volumen de 35 mL con PBS 1 x. Luego la arpillera de la mezcla de sangre-PBS con 10 mL de medio de gradiente de densidad.</li>
	<li>Realizar la centrifugación gradiente de densidad por 15 min a 800 x g y 24 ° C sin freno para separar las células.</li>
	<li>Recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aspirando la capa de célula blanca de la derecha en la parte superior de la capa media gradiente de densidad (capa clara media). Transferencia de PBMCs en un nuevo tubo 50 mL, completar hasta 50 mL 1 x PBS y centrifugar 10 min a 300 x g y 10 ° C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 10 mL de 1 x PBS y posteriormente contar el número de células, por ejemplo, utilizando una celda de Neubauer recuento de cámara.</li>
	<li>Opcional: Para estudiar la adherencia de los granulocitos realice el siguiente procedimiento. De lo contrario, continúe con el paso 2.7 o 2.8.
	<ol>
<li>Reunir la granulocitos capa (más después de la centrifugación de gradiente de densidad que también contiene los eritrocitos). Resuspender las células en 40 mL de PBS 1 x. Luego añada 8 mL de 6% dextrán en PBS 1 x, mezcle suavemente y deje sedimento células durante 30 min a temperatura ambiente. Nota: Los eritrocitos se hundirán hasta el fondo del tubo, mientras que los granulocitos permanecerá en suspensión.</li>
		<li>Después de 30 minutos, recoger el sobrenadante, transferir a un tubo de fresca 50 mL y centrifugar durante 6 min a 300 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y lisar los eritrocitos restantes añadiendo 5 mL de 0.2% NaCl en el ddH2O. Incubar durante 1 minuto.</li>
		<li>Añadir 5 mL de 1,4% NaCl en ddH2O e incube durante otro minuto. Detener la lisis hipotónica añadiendo 20 mL de 1 x PBS y centrifugar durante 6 min a 300 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 10 mL de 1 x PBS. Entonces, contar números de celular mediante el uso de una celda de Neubauer recuento de cámara.</li>
	</ol></li>
	<li>Opcional: Para estudiar la adhesión de subconjuntos PBMC, purifica los diferentes tipos de células o subconjuntos (por ejemplo, CD4+ y CD8+ T células o CD19+ B células) usando microesferas según protocolo del fabricante o por fluorescencia activada la célula clasificación (FACS). De lo contrario, continúe con el paso de 2.8.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular por 10 min a 300 x g y 10 ° C. Deseche el sobrenadante y las células con la célula de seguimiento de tinte (por ejemplo, CFSE) según las instrucciones del fabricante de la mancha.</li>
	<li>Posteriormente, centrifugar las células durante 10 min a 300 x gy descartar el sobrenadante. Resuspender en 1 x PBS, determinar el número de células y centrifugar nuevamente por 10 minutos a 300 x g.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células teñidas en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Nota: Estas células están ahora listas para microscopía.</li>
	<li>Opcional: Tratar las células con citoquinas, neutralización de anticuerpos u otros compuestos. De lo contrario, continúe con el paso 3.
	<ol>
<li>Omita paso 2.10 y resuspender el precipitado de células teñidas de paso 2.9 en Medio RPMI (con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina) para obtener una concentración de 1.5 x 106 células/mL.</li>
		<li>Tomar con pipeta 1 mL de esta suspensión celular en tantos pocillos de una placa de 48 pozos existen condiciones para ser analizados. Siempre preparar bien con las células no tratadas para ser perfundidos a través de un tubo capilar sin recubrimiento como control negativo y un pozo con las células no tratadas para ser perfundidos a través de un tubo capilar recubierto de histórico como control positivo.</li>
		<li>Para el tratamiento con anticuerpos anti-integrina, añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (p. ej., 10 μg/mL vedolizumab) a la suspensión de células. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Para el tratamiento con citoquinas, añadir la cantidad apropiada de citoquinas recombinantes (por ejemplo, 10 ng/mL CXCL10) a la suspensión de células. Incubar por 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Después de la incubación, cosechar células resuspender las células varias veces utilizando una pipeta p1000. Transferencia de células en un tubo de 2 mL, enjuagar bien otra vez con 1 mL de PBS 1 x y agregar al tubo 2 mL. Determinar el número de celular. Nota: Incubación de poblaciones de células adherentes (por ejemplo, monocitos) podría requerir medidas adicionales (por ej., tratamiento con tripsina) para separar las células de la placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Células de centrifugar 10 min a 300 x g a 10 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Cuando el pretratamiento con quimiocinas no agregue MnCl2 a la suspensión de células. Estas células están ahora preparadas para microscopía. Nota: El volumen mínimo utilizado para el análisis depende de la bomba y la tubería utilizada. En este estudio, utilizando la bomba peristáltica y la tubería especificado en la Tabla de materiales, se requiere un volumen mínimo de 400 μl. Si deseado y aplicables (dependiendo del tipo de la célula y producción), se puede aumentar la concentración de células en la suspensión para medir adherencia mayor en un período corto de tiempo.</li>
	<li>Potencial modificación: ensayo de adhesión dinámica competitiva
	<ol>
<li>Realice los pasos mencionados con diferentes poblaciones celulares para ser comparado con otros (por ejemplo, reglamentación y células efectoras T aisladas mediante aislamiento de grano magnético siguiendo las instrucciones del fabricante según paso 2.7).</li>
		<li>La mancha cada población con un tinte diferente (por ejemplo, CFSE y FarRed) como se describe en pasos 2.8-2.9 para ser capaces de diferenciar poblaciones celulares en microscopia.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets de células teñidas en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia (150 mM NaCl 1 mM HEPES 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL.</li>
		<li>Mezclar volúmenes iguales de las suspensiones de la célula (por ejemplo, 500 μl de células de T reguladoras) y 500 μl de células efectoras T obtener un final mezcla concentración celular de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Tales suspensiones pueden utilizarse posteriormente para el análisis de la competencia del proceso de adhesión por perfundiendo diferentes poblaciones celulares a través de los capilares mismo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. proyección de imagen de células de adhesión dinámico en vivo
<ol><li>Encienda el microscopio y seleccione el filtro apropiado o con láser para excitar a la célula de seguimiento de dye(s) (p. ej., 488 nm láser de CFSE), un objetivo apropiado (por ejemplo, 40 X) y una adquisición modo propicio tiempo lapso la proyección de imagen.</li>
	<li>Retire la película de parafina plástico de la punta del tubo capilar y conecte el tubo capilar con un pedazo corto de tubería (aproximadamente 5 cm de longitud) por estirar el tubo por un lado con pequeñas tijeras y con cuidado introducir el capilar (aproximadamente 0,5 cm) en el tubo. Sellar la conexión entre el capilar y el tubo con la película plástica de la parafina.</li>
	<li>Monte el tubo capilar en una bandeja de fijación (por ejemplo, la tapa de una placa de 6 pozos con un recorte rectangular ligeramente más corto que la longitud del tubo capilar) y colocar el capilar fijo en el soporte de la bandeja del microscopio, para que el capilar está en foco y listo para microscopía.</li>
	<li>Inserte el tubo de goma en la ranura correspondiente de la bomba peristáltica y coloque el extremo no conectado al tubo capilar al tubo de muestra según que contiene la suspensión de células. Inserte el tubo corto al otro lado del tubo capilar en un tubo de 15 mL para recoger a través de flujo.</li>
	<li>Dejar el relleno de la tubería con un caudal de 500 microlitros por minuto hasta que la suspensión de células casi llega a los capilares. Que el relleno capilar con un caudal de 100 μl/min. Nota: Un rápido llenado del tubo capilar garantiza una distribución regular de la suspensión de células dentro del tubo capilar.</li>
	<li>Cuando el tubo capilar se llena con la suspensión de células, ajustar flujo a 10 μl/min. Nota: Estas tasas de flujo pueden variar cuando se utilizan tubos capilares de diferente tamaño o diferentes bombas peristálticas. En este estudio, la tasa de flujo de 10 μl/min se ha optimizado para que la bomba y tubos capilares para imitar el flujo de sangre en vivo .</li>
	<li>Capturar imágenes de Time-lapse de las células moviéndose lentamente a través de los capilares a lo largo del histórico cubierto dentro de la pared cada 2 s durante un total de 3 minutos. Nota: Intervalos y el tiempo total pueden variar dependiendo del tipo celular y pregunta a tratarse.</li>
	<li>Antes de descartar el tubo capilar, de la pantalla el capilar todo a través del ocular del microscopio para asegurarse de que la sección que se muestra en el video es representante. Si es necesario, hacer una segunda grabación.</li>
	<li>Libre de la tubería de la bomba y deje que el líquido restante correr hacia atrás en el tubo de 2 mL, luego desconecte el tubo capilar y los tubos de la bandeja de fijación y continúe con el siguiente tubo capilar.</li>
</ol>4. evaluación y recuento celular
<ol><li>Abra la secuencia Time-lapse con software apropiado y exportar las primeras tres imágenes ("principio") y las tres últimas imágenes ("End") como archivos Tiff.</li>
	<li>Abrir las tres imágenes de "Principio" en ImageJ, convertir a 32 bits ('imagen | Tipo | 32 bits ') y fotos (' imagen | Color | Combinar canales; asignar los colores rojos, verdes y azules a las imágenes diferentes). Convertir imagen en RGB (' imagen | Type-RGB') y guardarlo como archivo Tiff. Repita con las imágenes de "Fin". Nota: En los ensayos de adhesión dinámica competitiva con células teñidas con diferentes colores, primero dividir los canales de las imágenes para analizar la adhesión de las diferentes poblaciones celulares por separado.</li>
	<li>Contar las células blancas visibles en la imagen compuesta de "Inicio" y "Final" y restar el número de células blancas en el "principio" de las células blanco en el "fin". Nota: La diferencia representa el número de recién adheridas las células en el intervalo de tiempo de 3 minutos. En la imagen compuesta, las células que son visibles en el color específico que fue asignado a la respectiva estructura ya que localiza en otro lugar en el marco anterior y siguiente. Para células adherentes, las señales rojas, verdes y azules en la misma superposición punto blanco.</li>
	<li>Para visualizar mejor los resultados, compilar un vídeo de las secuencias de lapso de tiempo, por ejemplo, utilizar ImageJ.</li>
</ol>

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<li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
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</ol>

N.M.F. ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. N.M.F. y S.Z. recibieron apoyo a la investigación de Takeda y Roche.

El protocolo de arriba describe una técnica útil para estudiar la dinámica adhesión de células inmunes humanas a ligandos endoteliales. A través de la variación de los ligandos revestidos, tipos de la célula inundada o subconjuntos, incubación con estímulos adicionales o diferentes anticuerpos neutralizantes, tiene casi ilimitadas aplicaciones potenciales. Por lo tanto, estos ensayos de adhesión dinámica pueden ser útiles para responder a dos preguntas fundamentales de investigación básica y traslacionales consultas que ...

Movimiento de la célula es un proceso estrechamente regulado indispensable para el desarrollo y función de organismos multicelulares, pero está también implicado en la patogenesia de una multitud de enfermedades1. Recientemente, el proceso de autodirección de las células inmunes de la sangre a los tejidos periféricos ha ganado cada vez más atención, ya que contribuye a la reposición y expansión de células patógenas en los tejidos inflamados en enfermedades inmunológico2 ,3. En particular, homing ha demostrado tener relevancia traslacional en las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La terapéutica anti-α4β7 integrina anticuerpo vedolizumab interferir con homing gut ha demostrado eficacia en ensayos clínicos grandes4,5 y se ha utilizado con éxito en la práctica clínica del mundo real6,7 , 8. compuestos adicionales están probables que siga9,10. Del mismo modo, el anticuerpo integrina de terapéutica anti-α4, natalizumab, se utiliza para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM)11.
Sin embargo, nuestro entendimiento funcional del proceso autoguiados hacia el blanco en general y el mecanismo de acción de estos anticuerpos terapéuticos en particular es todavía limitada. Está bien establecido que homing consiste en varios pasos, incluyendo la inmovilización de células y que rueda con adherencia posterior de la célula hacia la detención firme seguido por trans migración endotelial12,13. Los mencionados anticuerpos neutralizan las integrinas en la superficie celular impidiendo la interacción con addressins en el endotelio de la pared del vaso. Esto se piensa para impedir firme célula adherencia14,15. Sin embargo, sólo estamos empezando a comprender la relevancia diferencial de integrinas específicas para autoguiado hacia el blanco celular de subconjuntos distintos de la célula. Además, los efectos de los anticuerpos anti-integrina en diferentes subconjuntos de células y asociaciones de dosis-respuesta son en gran parte desconocidas a un montón de preguntas abiertas en el campo de terapias autoguiados hacia el blanco y la adherencia intestinal en la EII.
Por lo tanto, se necesitan desesperadamente herramientas prácticas para abordar estas cuestiones. El efecto de los anticuerpos anti-integrina en interacción integrina-histórico predominante hasta ahora ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición de la eficacia/obligatorio vinculante con citometría de flujo o a través de la adherencia estática ensayos16,17 ,18,19,20, así con aparente simplificación y desviación de la situación fisiológica. Recientemente establecimos un ensayo de adherencia dinámica para estudiar la adhesión dependiente de integrinas de las células humanas a addressins y los efectos de los anticuerpos anti-integrina bajo tensión de esquileo2. El principio de la técnica anterior se ha demostrado con células de ratón21,22. Aquí, fue adaptado y desarrollado para responder las preguntas mencionadas traslacionales, apertura nuevas avenidas para mejor comprender los mecanismos de la terapia con anticuerpos anti-integrina en vivo.

<table><tbody><tr><td>Placa de 48 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>833.923</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de adhesión: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2Solución de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bloqueo: 1x PBS en ddH2O + 5 % BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Applichem</td><td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Capilares: Tubo rectangular de boro de 0,20 mm x 2,00 mm de diámetro interior, 50 mm de longitud</td><td>CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2, humano</td><td>Immunotools</td><td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Microbeads, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; Kit de proliferación celular CFSE</td><td>Centrífuga ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>(Rotixa 50 RS)</td>Tampón de recubrimiento <td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 150 mM de NaCl + 1 mM</td> Microscopio confocal HEPES <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10, humano</td><td>Immunotools</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL Monovette</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcons (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td></td></tr><tr><td>Fc quimera isotipo control</td><td>R& D Systems</td><td>Caudales 110-HG</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Control de isotipo de IgG humana</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>Molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) Fc quimera</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>LS-Columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ratón IgG control de isotipo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>Molécula de adhesión celular de direccionamiento vascular mucosa 1 (MAdCAM-1) Quimera Fc</td><td>R& D Systems</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cámara de recuento</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, humano</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td><td>sin Mg y Ca</td></tr><tr><td>Película de parafina plástica: Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>CD18 antihumano purificado</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de caucho: SC0059T Tubo LMT-55 de 3 pasos, 1,02 mm de diámetro interior, 406,4 mm de longitud</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Sarstedt</td><td>861.254.025</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) Fc quimera</td><td>Biolegend</td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Vedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut autoguiado hacia el blanco de las células inmunes es importante para la patogenia de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La adhesión celular dependiente de la integrina a addressins es un paso crucial en este proceso y estrategias terapéuticas interfiere con la adherencia se han establecido con éxito. Anticuerpo integrina α4β7 anti, vedolizumab, se utiliza para el tratamiento clínico de la enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) y otros compuestos son propensos a seguir.
Los detalles de la adhesión y los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-integrina aún no están claros en muchos aspectos debido a las limitadas técnicas disponibles para la investigación funcional en este campo.
Aquí, presentamos un ensayo de adherencia dinámico para el análisis funcional de la adherencia de la célula humana bajo condiciones de flujo y el impacto de las terapias anti-integrina en el contexto de la EII. Se basa en la perfusión de las células primarias humanas a través de Capillares de vidrio ultrafina histórico cubierto con análisis microscópico en tiempo real. El ensayo ofrece una variedad de oportunidades de mejoras y modificaciones y tiene potencial para descubrimientos mecanicistas y aplicaciones traslacionales.

El método presentado en este manuscrito pretende simular el proceso en vivo de adhesión de células humanas a la pared endotelial lo más cerca posible a funcionalmente evaluar adhesión celular y el papel de los anticuerpos que interfieren. Por lo tanto, capilares ultrafinos son recubiertos con addressins y perfundidos con fluorescencia etiquetadas células humanas de interés utilizando una bomba de perfusión. Utilizando células vivas, la adhesión de las células humanas a la address...

Dinámica adhesión de células inmunes a la pared del vaso es un prerrequisito para autoguiado hacia el blanco gut. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo funcional en vitro para el análisis del impacto de los anticuerpos anti-integrina, quimioquinas u otros factores de la adherencia de la célula dinámica de células humanas mediante capilares histórico cubierto.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la inmunobiología básica y la investigación de la enfermedad inflamatoria intestinal con respecto a la cascada de adhesión de las células inmunitarias necesarias para la localización de órganos periféricos. La principal ventaja de esta técnica es que es un enfoque conveniente y directo para responder preguntas funcionales en el contexto de la adhesión celular en condiciones de flujo. Aunque este método fue desarrollado para explorar el mecanismo de anticuerpos anti-integrina poiéticas celulares en enfermedades inflamatorias intestinales, se puede modificar para analizar problemas similares en otros entornos de enfermedad inflamatoria.Comience por estirar un pedazo de tubo de goma en un lado con tijeras pequeñas para permitir la inserción de un capilar rectangular de aproximadamente 0,5 centímetros en el tubo. A continuación, selle la conexión con la película de parafina. Recubrir el capilar con 20 microlitros de la dirección de interés y sellar el lado no conectado al tubo con película de parafina de plástico durante al menos una hora de incubación a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, retire la película de parafi

dynamic-adhesion-assay-for-functional-analysis-anti-adhesion

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.

Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

Los modelos experimentales de enfermedad inflamatoria intestinal, nos han permitido examinar las respuestas del complejo inmune innata y adaptativa asociada con la patogénesis. El uso de puntuación histológico, la cuantificación de citoquinas pro-inflamatorias y la actividad mieloperoxidasa, se puede comenzar a evaluar las respuestas observadas en la enfermedad inflamatoria intestinal.

La investigación de la inflamación intestinal inducida por DSS en el modelo de la EII

Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Ensayo de adhesión estática es una herramienta poderosa que se puede utilizar para modelar las interacciones entre los linfocitos T y otros tipos de células. Interacciones se generan mediante la inyección de células T marcadas en pocillos recubiertos con moléculas de adhesión, mientras que un lector de placas se utiliza para cuantificar el número de células adherentes después de lavados de serie.

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

Aquí presentamos un método simple y rápido para caracterizar las propiedades adhesivas intrínsecas de las moléculas de adhesión celular putativas.  El ectodominio secretado y marcado con epítopos de una molécula de adhesión celular se captura del medio de cultivo en perlas funcionalizadas pequeñas y uniformes.  Estas perlas se pueden utilizar inmediatamente en ensayos simples de agregación de perlas.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Los tratamientos actuales de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) tienen como objetivo aliviar los síntomas de la enfermedad, pero pueden causar efectos secundarios graves. Por lo tanto, las estrategias alternativas están siendo investigados en modelos animales con colitis. A continuación, explicamos cómo se analizan los efectos beneficiosos de los suplementos de la dieta en los signos clínicos de la EII en un modelo de este tipo colitis.

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

La puntuación sistemática de la inflamación intestinal utilizando un sistema asistido por computadora libre es una poderosa herramienta para comparar cuantitativamente los cambios histopatológicos en los modelos de colitis caracterizados por la presencia de úlceras y cambios inflamatorios. La evaluación de la puntuación de colitis histológica fortalece las observaciones clínicas y facilita la interpretación de los datos.

Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina

En el presente estudio, el dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se administra a ratones a través de sonda oral para evaluar la permeabilidad intestinal tanto in vivo como en muestras plasmáticas y fecales. Como la función de barrera intestinal se ve afectada en muchos procesos de enfermedad, este ensayo directo y cuantitativo se puede utilizar en diversas áreas de investigación.

Evaluación de la integridad de la barrera intestinal en ratones utilizando dextrano marcado con fluoresceína-isotiocianato

Se proporciona un protocolo detallado para obtener imágenes de plaquetas migratorias individuales utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD con densidad sintonizable, que revela que las plaquetas generan suficiente fuerza para romper el enlace avidina-biotina.

Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

Este protocolo demuestra cómo el modelo de ratón deficiente en el dominio de homología 2 Src de inflamación ileal y fibrosis similar a la enfermedad de Crohn (EC) deficiente en 5'-inositol fosfatasa (SHIP) se puede utilizar para probar nuevas terapias para la EC.

Evaluación de intervenciones terapéuticas en el modelo de ratón deficiente en SHIP de ileítis y fibrosis similares a la enfermedad de Crohn

Aprende a realizar un ensayo de adhesión dinámica para analizar terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal usando células inmunes humanas bajo condiciones de flujo. Este método permite evaluar anticuerpos anti-integrinas y quimioquinas.

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

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