Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Este método puede ayudar a responder preguntas clave de la inmunobiología básica y la investigación de la enfermedad inflamatoria intestinal con respecto a la cascada de adhesión de las células inmunitarias necesarias para la localización de órganos periféricos. La principal ventaja de esta técnica es que es un enfoque conveniente y directo para responder preguntas funcionales en el contexto de la adhesión celular en condiciones de flujo. Aunque este método fue desarrollado para explorar el mecanismo de anticuerpos anti-integrina poiéticas celulares en enfermedades inflamatorias intestinales, se puede modificar para analizar problemas similares en otros entornos de enfermedad inflamatoria.

Comience por estirar un pedazo de tubo de goma en un lado con tijeras pequeñas para permitir la inserción de un capilar rectangular de aproximadamente 0,5 centímetros en el tubo. A continuación, selle la conexión con la película de parafina. Recubrir el capilar con 20 microlitros de la dirección de interés y sellar el lado no conectado al tubo con película de parafina de plástico durante al menos una hora de incubación a 37 grados centígrados.

Al final de la incubación, retire la película de parafina de plástico y deje que el líquido se empape del capilar sobre una toalla de papel para vaciar el tubo. A continuación, bloquee el capilar con 20 microlitros de solución de bloqueo durante al menos una hora a 37 grados centígrados. Es muy importante aplicar el bloqueo al capilar directamente después de retirar el recubrimiento para evitar el secado del capilar, ya que esto puede afectar a la funcionalidad de las proteínas codificadas.

Mientras se bloquea el capilar, agregue 18 mililitros de sangre humana entera anticoagulada de un tubo de 50 mililitros y diluya la sangre a un volumen total de 35 mililitros con PBS. Capa 10 mililitros de media de gradiente de densidad bajo la solución sanguínea y aislar las células sanguíneas mononucleares de sangre periférica por centrifugación de gradiente de densidad. Al final de la separación, transfiera las células mononucleares de sangre periférica de la interfaz del medio de gradiente de densidad a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Y llevar el volumen total en el tubo hasta 50 mililitros con PBS fresco. Después de la centrifugación, resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS fresco para contar y manchar las células con un tinte de seguimiento celular adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al final de la incubación de tinción, recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en un 1,5 veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media de RPMI completa.

Luego sembrar un mililitro de células en tantos pozos de una placa de 48 pozos como hay condiciones. Y agregue el volumen apropiado de anticuerpos anti-integrina a los pozos apropiados para una incubación de una hora a 37 grados Celsius. A continuación, utilice una pipeta P1000 para resuspender las células varias veces antes de transferir las células a tubos individuales de dos mililitros.

Enjuague cada pozo con un mililitro de PBS y a la piscina los lavados en los dos tubos de mililitro apropiados. Después del conteo, peletiza las células por centrifugación y resuspendió las células en el volumen adecuado de tampón de adhesión para obtener 1,5 veces diez a las sextas células por mililitro. A continuación, añada el volumen adecuado de cloruro de manganeso a cada tubo a una concentración final de un milimolar.

Cuando las células estén listas, encienda el microscopio y seleccione los filtros y láseres apropiados, el modo objetivo y el modo de adquisición. Retire la película de parafina de plástico de la punta del capilar y utilice tijeras para estirar una pieza de cinco centímetros de tubo de goma para permitir que el capilar se conecte al tubo más pequeño. Selle la conexión entre el capilar y el tubo con película de parafina de plástico.

Y montar el capilar en una bandeja de fijación. Coloque la bandeja en el soporte de la bandeja del microscopio para que el capilar esté enfocado. E inserte el tubo de goma en la muesca correspondiente de la bomba peristáltica.

Coloque el extremo no conectado del tubo en el primer tubo de muestra que contiene la suspensión celular. E inserte el tubo corto en el otro lado del capilar en un tubo de 15 mililitros para recoger el flujo a través. Deje que el tubo se llene a un caudal de 500 microlitros por minuto hasta que la suspensión celular casi alcance el capilar.

A continuación, deje que el capilar se llene a un caudal de 100 microlitros por minuto. Cuando el capilar se llena de células, ajuste el caudal a 10 microlitros por minuto y capture imágenes de lapso de tiempo de las células moviéndose lentamente a través del capilar a lo largo del interior de la pared recubierta de direccionamiento cada dos segundos durante un total de tres minutos. Una vez que la suspensión celular alcanza el interior del capilar, es fundamental evitar cualquier interrupción del flujo, ya que esto conducirá a la interacción estática de integrina direccionamiento potencialmente sesgado de la medición.

Antes de desechar la corriente de todo el capilar a través del ocular del microscopio para asegurarse de que la sección observada en la pantalla es representativa. Libere el tubo de la bomba y deje que el líquido restante vuelva a entrar en el tubo de dos mililitros. A continuación, desconecte el capilar y el tubo de la bandeja de fijación e imagine el siguiente capilar como acaba de demostrar.

Para evaluar las grabaciones de lapso de tiempo, abra la primera secuencia en el software de análisis adecuado y exporte la primera y las tres últimas imágenes como archivos TIFF. Abra las tres imágenes iniciales en ImageJ y seleccione imagen, tipo y 32 bits para convertir las imágenes a 32 bits. A continuación, seleccione canales de imagen, color y fusión para fusionar las imágenes en una imagen y convertir la imagen compuesta a RGB para guardarla como un archivo TIFF.

Después de convertir las tres últimas imágenes de la misma manera, cuente las celdas blancas visibles en las imágenes compuestas inicial y final. Y reste el número de celdas blancas en la imagen inicial del número de celdas blancas en la imagen final. La perfusión de capilares recubiertos con ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, pero no isotipo Fc quimera con PBMC humano conduce a una marcada adhesión cuando uno de los tres direccionamientos está presente.

Por el contrario, la inhibición de las interacciones de direccionamiento de integrina utilizando anticuerpos neutralizantes normalmente conduce a una marcada disminución de la adhesión dinámica que está ausente cuando se añaden anticuerpos de control de isotipos. Además, el tratamiento de células T humanas CD4 con quimioquinas específicas conduce a una mayor adhesión a las direccioninas en comparación con las células humanas no tratadas. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que varios factores contribuyen a la adhesión celular dinámica in vivo que no se puede recapitular completamente en este ensayo.

Sin embargo, es posible ajustar el ensayo para abordar cuestiones muy complejas. Con el fin de abordar preguntas adicionales sobre el comportamiento de adhesión diferencial de los tipos de células de prueba, también es posible realizar ensayos de adhesión competitivos con diferentes tipos de células etiquetados con diferentes tintes de seguimiento celular. Después de su desarrollo, esta técnica nos permitió explorar los efectos de los diferentes anticuerpos antiintegrina utilizados o actualmente en desarrollo para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales.