Name: Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende a diseñar tejido epitelio pigmentario de retina usando células madre pluripotentes humanas y membranas amnióticas. Este método permite producir injertos para modelos animales y estudios terapéuticos.

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Los autores desean agradecer a Jérôme Larghero y Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, París, Francia) por su aporte durante la puesta en marcha del método descrito aquí.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fundación pour la Recherche Médicale [programa de Bio-ingeniería - DBS20140930777] y de la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau y Christelle Monville. Fue apoyado por NeurATRIS, una infraestructura de investigación traslacional (Investissements Avenir) para bioterapias en Neurociencias [ANR-11-INBS-0011] y INGESTEM, la infraestructura nacional (Investissements Avenir) Ingeniería pluripotentes y diferenciadas las células madre [ANR-11-INBS-000] Christelle Monville. Karim Ben M'Barek fue apoyado por becas de DIM Stempole y la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73]. Madre es parte del Instituto de bioterapias para enfermedades raras, apoyados por la Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.

Todos los materiales humanos utilizados en el presente Protocolo se utilizaron según regulaciones de la Unión Europea. La línea humana de la célula ES utilizada en este estudio se derivó de un embrión único. La pareja que había donado el embrión completamente fue informada y dio su consentimiento para una donación anónima. Una línea de células de humano ES de tipo clínico fue derivada de este embrión, bancarizada, calificada y debidamente documentada por la células de Roslin (Reino Unido). Jamones fueron procurados en condiciones estériles durante una cesárea en madres que han firmado un consentimiento informado para la donación de placenta según las pautas del hospital (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. preparación de medios de cultivo y reactivos
<ol><li>
Preparación de medio de cultivo de células RPE
	<ol>
<li>Para preparar el medio de cultivo de células RPE, agregar sustituto de suero de 4% (20 mL para un volumen final de 500 mL) x 1.000 diluido 2-Mercaptoetanol (500 μl de un volumen final de 500 mL) y solución de aminoácidos no esenciales 1% Eagle′s medio esencial mínimo (MEM) (5 mL para un final volumen de 500 mL) a la glucosa alta de modificado Eagle de Dulbecco medium (DMEM) (475 mL para un volumen final de 500 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del medio de transporte y conservación
	<ol>
<li>Para preparar el medio de transporte y conservación, añadir 1% de penicilina-estreptomicina (5 mL para un volumen final de 500 mL) a CO2-medio independiente (495 mL para un volumen final de 500 mL) y guardar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resuspensión de la enzima thermolysin
	<ol>
<li>Preparación de solución madre de thermolysin<ol>
<li>Para preparar una solución madre de thermolysin, descongelar el polvo thermolysin, que se almacenó a-20 ° C, a temperatura ambiente.</li>
			<li>Como la actividad enzimática puede variar de lote a lote, calcular esta actividad basada en el certificado de análisis con el polvo de thermolysin del lote a utilizar. Dividir la "actividad proteasa Neutral calculado = ANPC" (indicado en el certificado de análisis) por 181 (que es el peso molecular de tirosina). El resultado obtenido corresponde a la actividad enzimática total de la thermolysin suministrado en polvo (U/vial).</li>
			<li>Prepare una solución de 200 U/mL añadiendo el volumen de agua correspondiente a la total actividad enzimática (U/vial) dividida por 200 (U/mL).</li>
			<li>Disolver la enzima transfiriendo el agua que se agregó hacia arriba y hacia abajo. Vórtice la solución por 30 s y compruebe si el polvo totalmente ha sido suspendido. Pipeteo más puede ser necesario para una completa disolución.</li>
			<li>Alícuota de la solución y almacenar a-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparación de una solución de trabajo de thermolysin Nota: La solución de thermolysin debe ser preparada en el día del tratamiento de jamón.<ol>
<li>Descongelar las alícuotas stock de thermolysin de 200 U/mL almacenado a-20 ° C. Diluya la solución stock 200 x en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una actividad enzimática final de 1 U/mL. Preparar 40 mL para tratar manchas de jamón de 1 – 4.</li>
			<li>Filtrar la solución de thermolysin a través de un previo de filtro 0.2 μm a utilizar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resuspensión de gelatina
	<ol>
<li>Preparación de solución de gelatina 20% y el bloque Nota: La solución de gelatina 20% y el bloque se pueden preparar hasta 1 semana antes de su uso.<ol>
<li>Caliente el CO2-medio independiente a 42 ° C en un baño de agua durante 30 minutos (hasta 1 h). En un tubo de 50 mL, añadir 10 g de gelatina en 40 mL de CO2de calentado-medio independiente y agitar la solución.</li>
			<li>Disolver la gelatina durante 30 – 60 min a 42 ° C. Vortex cada 10 minutos para homogeneizar la solución.</li>
			<li>Una vez que la solución esté homogénea, añadir 4 mL de la solución de gelatina 20% a cuatro platos de cultura 6 cm. Evitar las burbujas. Añadir una película de parafina plástico para proteger los platos y deje que la solución solidificar a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparación de solución de gelatina 8% Nota: La solución de gelatina 8% puede preparada el día antes de su uso y almacenada a 4 ° C.<ol>
<li>Caliente el CO2-medio independiente a 42 ° C por 30 min (hasta 1 h). En un tubo de 50 mL, añadir 4 g de gelatina en 46 mL de caliente CO2-medio independiente y agitar la solución.</li>
			<li>Disolver la gelatina durante 30 – 60 min a 42 ° C. Agregar una película de parafina plástica para proteger el tubo y mantenerlo en un baño de agua a 37 ° C para ser utilizada el mismo día, o almacenar a 4 ° C para su uso posterior.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thermolysin tratamiento de las membranas amnióticas humanas
<ol><li>
Lavado de la membrana amniótica humana
	<ol>
<li>Tienen jamones como pedazos pequeños (aproximadamente de 30 x 30 mm) fijada en un andamio de nylon, o ya en 4 ° C en PBS o congelado. Siempre congelado, descongelar las membranas a 37 ° C en una incubadora durante 30 minutos.</li>
		<li>Lavar las membranas:<ol>
<li>Colocar membranas de 1 a 4 en una botella de 250 mL conteniendo 80 mL de PBS. Utilizar tantas botellas como sea necesario.</li>
			<li>Agite cada botella en un agitador de placa a una velocidad alta durante 5 minutos, luego descartar el PBS. Agregar 80 mL de PBS y repita.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratamiento Thermolysin
	<ol>
<li>Añadir 40 mL de la solución de trabajo de thermolysin (1 U/mL) por la botella que contiene las membranas (membranas de 1 – 4 por botellas; hasta 3 botellas a la vez).</li>
		<li>Agitar las botellas durante 5 minutos a 450 rpm y luego vortex por 30 s. repetir 1 x.</li>
		<li>Deseche la solución de thermolysin y añadir 80 mL de PBS.</li>
		<li>Agitar las botellas por 5 min a 450 rpm. Descartar el PBS y añadir 80 mL de PBS. Repetir x 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fijación de membranas amnióticas humanas en una inserción de la cultura
<ol><li>Utilice pinzas largas estériles (que pueden llegar a la parte inferior de la botella) para quitar los jamones uno a uno y cada jamón de transferencia a un plato de cultura de 10 cm conteniendo 10 mL de PBS.</li>
	<li>En una nueva 10 cm placa de cultivo que contiene 10 mL de PBS, coloque una de las membranas con el nylon hacia abajo. Separar dos de los cuatro clips que se utilizan para fijar la membrana de nylon.</li>
	<li>Inserte el anillo más pequeño de la inserción de la cultura entre el nylon y la membrana.</li>
	<li>Asegúrese de que la membrana cubra completamente el anillo más pequeño. Clip de la segunda parte de la inserción de la cultura encima de la membrana. La membrana del sótano del jamón es hacia arriba dentro de la inserción de la cultura. Suelte los dos clips.</li>
	<li>Cortar con las tijeras estériles, el exceso de membrana fuera de la inserción de la cultura si es necesario. Mediante pinzas, transferir la membrana fija en la inserción de la cultura a una placa de 12 pozos, añadir PBS y guardar la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Repetir estas operaciones (del paso 3.2 a 3.5) con las otras membranas.</li>
</ol>4. descongelación y siembra de células del epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
<ol><li>
Descongelación de células del epitelio pigmentario de la retina
	<ol>
<li>El Banco de células RPE se congela en 1 millón de células por viales criogénicos en nitrógeno líquido. Descongelar como muchos frascos criogénicos como sea necesario (se siembran las 350.000 células por membrana).</li>
		<li>Preparar un tubo de 15 mL que contiene 3 mL de medio RPE por vial criogénico. Una vez que el frasco se descongele, transferir las células a cada tubo. Repita esta operación para los otros frascos.</li>
		<li>Homogeneizar (pipeta hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para resuspender las células en el medio RPE) y tomar 10 μl de la solución celular y transferir a un tubo de 1,5 mL. Añadir 10 μl de azul tripán. Lugar 15 μl de esta solución en una cámara de conteo, entonces cuente el número de células viables (no coloreados en azul) bajo un microscopio con el objetivo 4 X. Repita esta operación para los otros frascos.</li>
		<li>Mientras tanto, centrifugar los tubos de 15 mL a 110 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante y resuspender las células en 700.000 células/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Siembra de células del epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
	<ol>
<li>Retire la placa de 12 pozos que contienen las membranas de la incubadora.</li>
		<li>Aspire el PBS. Añadir 500 μl de la suspensión preparada en el paso 4.1.4 en el centro de la inserción de la cultura. Añadir 1 mL de medio RPE fuera de la inserción de la cultura (dentro del pozo). Repita para las otras membranas.</li>
		<li>Coloque la placa de 12 pozos que contienen las membranas en la incubadora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. mantenimiento de cultivos de células de epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
<ol><li>Renovar el medio 2 x por semana, generalmente los lunes y el viernes, hasta por lo menos 30 días de la cultura.</li>
	<li>Aspire el medio dentro y fuera de la inserción de la cultura para cada pozo y renovar con medio fresco (1 mL fuera de la inserción de la cultura y 500 μl dentro). Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.</li>
</ol>6. preparación de la versión de epitelio pigmentario de la retina para el trasplante
Nota: A partir de 30 días de la cultura, el tejido está listo para el trasplante.
<ol><li>Caliente la solución de 8% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos llenar la cámara interna de vibratome con frío CO2-medio de independiente (a 4 ° C).</li>
	<li>
Coloque el bloque de gelatina 20% en el vibratome.
	<ol>
<li>Tomar la placa de cultivo de 6 cm que contiene el bloque de 20% de gelatina de la nevera. Con un bisturí, cortar un bloque de 5 cm x 5 cm. Pegar la parte superior del bloque para el apoyo con pegamento de cianoacrilato o su equivalente.</li>
		<li>Colocar una nueva hoja en el vibratome.</li>
		<li>Ajuste el nivel del bloque hasta que quede al mismo nivel de la hoja de afeitar.</li>
		<li>Llene la bañera alrededor de la ayuda con fresca CO2-medio independiente a 4 ° C. Cortar el bloque con el vibratome con una velocidad media hasta que el bloque se corta uniformemente, hacia una superficie lisa. Establecer la posición 0.</li>
		<li>Aspire el medio alrededor del bloque de gelatina hasta que esté completamente seca y luego tomar la placa de cultivo de 12 pocillos que contienen los tejidos de la incubadora a 37 ° C.</li>
		<li>Con fórceps, abra cuidadosamente el inserto de la cultura en la parte superior del bloque de gelatina. Cortar con las tijeras, todas las partes de las membranas que no contiene células (fuera del ring donde no fueron cultivadas células). Aspire el medio residual todo.</li>
		<li>Añadir 1 mL de la solución líquida de gelatina de 8% a 37 ° C para cubrir las membranas. Retire con cuidado el exceso. Espere 5-8 min para permitir que la gelatina se solidifique.</li>
		<li>Añadir fresco CO2-medio independiente (a 4 ° C) al baño hasta que la membrana está cubierta.</li>
		<li>Corte, con el vibratome en una posición de-100 μm, con una velocidad media, permaneciendo consciente de cómo se comporta el bloque. Al final de la sección, tenga cuidado de mantener la orientación del tejido.</li>
		<li>Con un bisturí, cortar una esquina para identificar la orientación de la sección.</li>
		<li>Recoger la membrana incrustada en gelatina con una espátula y colocar en una placa de 6 pozos llenada con el medio de conservación a 4 ° C, hasta el injerto en el ojo receptor.</li>
		<li>A la hora de los trasplantes, ajustar el tamaño del implante que el tamaño del ojo receptor bajo un microscopio quirúrgico (1-3 para las ratas, 10 – 15 mm2 para primates no humanos).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Olivier Goureau es el inventor en espera de patentes relacionadas con la generación de células de la retina de células madre pluripotentes humanas. Otros autores no tienen nada que revelar.

Hemos descrito un método para el cultivo de células RPE sobre un andamio biológico y su preparación para su implantación en modelos animales. Uno de los pasos críticos del protocolo es el mantenimiento de la orientación de la pieza a lo largo del procedimiento hasta su inclusión en gelatina. De hecho, se elimina el epitelio nativo de la membrana y su membrana basal se convierte expuestos9. Las células RPE deban ser sembrado en la cima de esta membrana del sótano. En preparación para incrustación d...

RPE es crucial para la supervivencia y la homeostasis de los fotorreceptores con el cual está firmemente asociado1. Varias condiciones patológicas alteran su funcionalidad y supervivencia, incluyendo RP y AMD.
RP es un grupo de mutaciones monogénicas hereditarias que afectan a las funciones de los fotorreceptores o las células RPE o ambos2,3. Se estima que las mutaciones que afectan específicamente el RPE células representan el 5% de RP2. AMD es otra condición donde se altera la capa RPE, pérdida de visión central en última instancia a líder. AMD es causado por las interacciones complejas de factores genéticos y ambientales y afecta a los ancianos4,5,6. Según las proyecciones, AMD será un motivo de preocupación para pacientes 196 millones en todo el mundo por 20207. Para estos trastornos, no hay cura efectiva existe, y una de las estrategias propuestas es el trasplante de nuevas células RPE para compensar muerto/no funcional preexistente de las células RPE8.
El modo de formulación de los productos finales a ser injertada es esencial para asegurar los mejores resultados funcionales. Células RPE inyectadas como una suspensión, a pesar de ser un método fácil y sencillo de entrega, plantear inquietudes acerca de su supervivencia, integración y funcionalidad9,10,11,12 , 13. los científicos están preparando más formulaciones complejas para ofrecer ingeniería de tejido retiniano9,13,14,15,16. En este contexto, hemos desarrollado un método original para generar el en vitro RPE tejido que podría ser utilizado para trasplante9.
Los bancos de células RPE derivados de células madre embrionarias humanas (ES) se utilizan en el presente Protocolo. Sin embargo, la alternativa RPE célula bancos procedentes de diferentes células (células madre pluripotentes humanas, las células RPE primarias, etc.) y distinguido con un método diferente también son adecuados para este protocolo. Incluye diferenciación dirigida protocolos con citoquinas y moléculas pequeñas17,18,19,20,21,22.
Para ser trasplantado, el tejido diseñado debe estar preparado en un andamio. En los últimos años, diferentes andamios han desarrollado basado en un polímero o en una matriz de origen biológico13,23,24. Aquí, el sustrato biológico utilizado es el jamón, pero otros substratos, como membranas de Bruch denudadas, podrían ser implementados. El método descrito en el presente documento tiene la ventaja de usar un andamio biológico más relevante para el entorno nativo de RPE.
Células madre derivadas de células RPE embrionarias humanas se cultivan durante al menos 4 semanas para completamente organizado como una monocapa de adoquines. En ese momento, el epitelio obtenido es funcional y polarizado9. Por último, como este tejido se arruga fácilmente, está incrustada en una capa delgada de un portador de hidrogel para darle más rigidez y elasticidad y para protegerlo durante el procedimiento de inyección. Este producto se almacena a 4 ° C hasta el injerto.

<table><tbody><tr><td>Cabina de bioseguridad estéril</td><td>TechGen International</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eliminación de residuos líquidos para aspiración</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2 controlado +37&nbsp; &deg; incubadora de celdas C</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; y micro; Pipeta L: P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; mL pipeta: P1000</td><td>Gilson F144566</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ayuda para pipetear</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &deg; C Frigorífico</td><td>Liebherr</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>WPI</td><td></td> Pinzas de 501758 <td></td></tr><tr><td>(x2)</td><td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Grant subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Centrífuga</td><td></td> Sartorius CP225D <td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>Agitador basculante horizontal</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>película de parafina plástica</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 &micro; m filtro de jeringa de un solo uso</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa sin aguja 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>Frascos 250 mL</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubos Falcon estériles</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos Falcon estériles</td><td>Dutscher</td> Inserto de cultivo <td>352098</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Placas de cultivo celular B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Castorama 3178040670105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysine</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td><td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>medio independiente de CO2</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>membrana amniótica humana</td><td>Banco de tejidos Hospital de San Luis (París, Francia)</td><td>No aplicable</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Varias condiciones patológicas del ojo afectan a la funcionalidad y la supervivencia del epitelio retiniano del pigmento (RPE). Estas son algunas formas de retinitis pigmentosa (RP) y degeneración macular senil (DMS). La terapia celular es una de las estrategias terapéuticas más prometedoras propuestas para curar estas enfermedades, con alentar ya resultados preliminares en seres humanos. Sin embargo, el método de preparación del injerto tiene un impacto significativo en sus resultados funcionales in vivo. De hecho, son menos funcionales que las misma células trasplantadas como un tejido retiniano células RPE injertadas como una suspensión. Adjunto, describimos un método simple y reproducible al ingeniero RPE tejido y su preparación para la implantación de una en vivo . Se siembran las células RPE derivadas de células madre pluripotentes humanas sobre un soporte biológico, la membrana amniótica humana (jamón). En comparación con andamios artificiales, este apoyo tiene la ventaja de tener una membrana del sótano que está cerca de donde se unen las células RPE endógenas la membrana de Bruch. Sin embargo, su manipulación no es fácil, y hemos desarrollado varias estrategias para su adecuado cultivo y preparación para injerto en vivo.

Jamones contienen una capa epitelial que debe retirarse antes de la siembra de las células RPE. Un tratamiento enzimático de la membrana se realiza con el thermolysin bajo agitación. En orden no para no perder la polaridad de la membrana (el epitelio está en un lado), se fija en un soporte que composición puede ser diferente según el proveedor (figura 1A). Comprobar la adherencia de la membrana para su apoyo en este paso y añadir clips si es necesario. En el ...

Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la autoterapia del ojo, como cuál es la eficacia de un tejido de bioingeniería específicamente diseñado in vivo. Con esta técnica proporcionamos un método para producir y contornear el tejido de la retina, así como una estrategia para procesar el tejido para la implantación del ojo en un modelo animal. Comience lavando de una a cuatro piezas de membrana amniótica humana de 30 por 30 mm, o hAM.Fije un andamio de nailon dos veces en 80 ml de PBS por lavado en una botella de 250 ml en una coctelera, a alta velocidad durante cinco minutos. Después del segundo lavado, agregue 40 ml de solución de Thermolysin a cada botella y agite las botellas dos veces durante cinco minutos a 450 rpm, seguidos de 30 segundos de vórtice. Después de la segunda ronda del tratamiento con Thermolysin, lavar las piezas dos veces más con 80 ml de PBS por lavado, como se ha demostrado.A continuación, utilice pinzas largas y estériles para transferir las hAM individualmente, a una placa de cultivo de 10 cm, que contenga 10 ml de PBS. A continuación, coloque una membrana con el nailon hacia abajo en una segunda placa de cultivo de PBS de 10 cm y separe dos de los cuatro clips que sujetan la membrana al nailon. Inserte el anillo más pequeño del inserto de cultivo entre el nailon y la membrana, asegurándose de que la membrana cubra completamente el anillo más pequeño.Sujete la segunda parte del inserto de cultivo a la parte superior de la membrana de modo que la membrana basal del hAM quede hacia el lado derecho hacia arriba en el inserto de cultivo y separe los dos últimos clips. A continuación, utilice unas tijeras estériles para recortar cualquier membrana fuera del inserto de cultivo según sea necesario. Y use fórceps para transferir la membrana a un pocillo de una placa de 12 pocillos, que contiene PBS para su almacenamiento a 37 grados Celsius y 5% de CO2.Antes de la siembra, caliente los viales criogénicos que contienen una vez de 10 a la sexta célula EPR en 3 ml de medio EPR en un tubo cónico de 15 ml por vial. Cuando las células se hayan descongelado, pipetee para obtener suspensiones de células individuales en cada uno de los tubos, y cuente el número de células viables por exclusión de azul tripan. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos a una concentración de siete veces 10 a la quinta célula por mililitro en un medio RPE fresco.A continuación, aspire el PBS de cada pocillo de la placa de 12 pocillos preparada y agregue 500 microlitros de células al centro de cada inserto de cultivo y 1 ml de medio RPE al fondo de cada pocillo. Luego regrese la placa a la incubadora de cultivo celular durante 30 días, cambiando el medio dos veces por semana hasta el final del cultivo. En el día 30 de cultivo, calentar una solución de gelatina al 8% en un baño de agua a 37 grados centígrados, durante 30 minutos.Y llene la cámara interna de un vibratomo con cuatro grados Celsius de medio independiente del CO2. Use un bisturí para cortar un bloque de 5 cm por 5 cm de un bloque de gelatina al 20% almacenado a cuatro grados centígrados. Asegure la parte superior del bloque al soporte con un adhesivo adecuado.Y coloque una nueva cuchilla en el vibrátomo. Ajuste el bloque hasta que esté al mismo nivel que la hoja de afeitar y llene el baño alrededor del soporte con un medio fresco independiente de CO2 de cuatro grados centígrados. Corte el bloque a una velocidad media hasta que el bloque se corte uniformemente con una superficie de avance lisa y establezca la posición en cero.Luego aspire el medio alrededor de la gelatina hasta que la gelatina esté completamente seca. Y use fórceps para abrir con cuidado un inserto de cultivo sembrado con RPE en la parte superior del bloque. Utilice unas tijeras para quitar toda la membrana fuera del anillo de inserción y aspire todo el volumen de medio residual.Agregue hasta 1 ml de solución de gelatina líquida al 8% a la membrana hasta que esté cubierta. Y retira con cuidado el exceso de gelatina. Después de cinco a ocho minutos, agregue cuatro grados Celsius de medio independiente de CO2 al baño hasta que la membrana solidificada esté cubierta.Y con el vibratomo en la posición de 100 micras, corte una sección de la membrana a una velocidad media, teniendo cuidado de mantener la orientación del tejido. Corte una esquina de la sección con un bisturí para permitir la identificación de la orientación de la sección. Y use una espátula para transferir la membrana incrustada en gelatina a una de una placa de seis pocillos, llena con un medio de conservación de cuatro grados centígrados.La orientación de la rebanada podría invertirse debido al movimiento liberado antes de la esquina que se está cortando. Por lo tanto, tenga cuidado de asegurar la posición de la rebanada justo después de la sección. A continuación, el tamaño del implante se puede ajustar al tamaño del ojo del receptor bajo un microscopio quirúrgico, previo al trasplante.Por lo general, quedan unas pocas células muertas en la superficie de la membrana, después de la fijación en el inserto de cultivo, pero esas células se eliminan cuando se cambia el medio de cultivo. Las fibras de la membrana basal son visibles a un aumento mayor cuando no quedan células, lo que indica que el período de tratamiento con termolisina se ha optimizado. El epitelio de la retina se vuelve más fácil de ver bajo un microscopio, a medida que madura, formando una monocapa completa similar a un adoquín a las tres semanas.A las cuatro semanas, el epitelio está lo suficientemente maduro como para estar preparado para la implantación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el estado de la gelatina depende de la temperatura. Por lo tanto, tenga cuidado de seguir estrictamente las temperaturas recomendadas.Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la terapia con células madre exploren el potencial terapéutico de un tejido de bioingeniería en un modelo animal de retinosis pigmentaria. Aunque este método se puede utilizar para preparar un tejido sobre un andamio, para su posterior trasplante, también se puede aplicar a sistemas más complejos que contienen capas de fotorreceptores. Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad para manejar las membranas amnióticas humanas, que son muy delgadas y tienden a plegarse fácilmente.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de fijación de la membrana amniótica humana y de inclusión de gelatina son difíciles de aprender y requieren un enfoque de manejo particular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.

Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Este protocolo describe cómo producir células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) de células madre pluripotentes. El método utiliza una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para dirigir la diferenciación de células madre en RPE inmaduro en catorce días y RPE madura y funcional después de tres meses.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

El primate no humano (NHP) es un modelo ideal para estudiar la terapéutica celular de la retina humana debido a las similitudes anatómicas y genéticas. Este manuscrito describe un método para el trasplante submacular de células epiteliales pigmentarias de la retina en el ojo NHP y estrategias para prevenir las complicaciones intraoperatorias asociadas con la manipulación macular.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Aprende a diseñar tejido epitelio pigmentario de retina usando células madre pluripotentes humanas y membranas amnióticas. Este método permite producir injertos para modelos animales y estudios terapéuticos.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

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