Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la autoterapia del ojo, como cuál es la eficacia de un tejido de bioingeniería específicamente diseñado in vivo. Con esta técnica proporcionamos un método para producir y contornear el tejido de la retina, así como una estrategia para procesar el tejido para la implantación del ojo en un modelo animal. Comience lavando de una a cuatro piezas de membrana amniótica humana de 30 por 30 mm, o hAM.

Fije un andamio de nailon dos veces en 80 ml de PBS por lavado en una botella de 250 ml en una coctelera, a alta velocidad durante cinco minutos. Después del segundo lavado, agregue 40 ml de solución de Thermolysin a cada botella y agite las botellas dos veces durante cinco minutos a 450 rpm, seguidos de 30 segundos de vórtice. Después de la segunda ronda del tratamiento con Thermolysin, lavar las piezas dos veces más con 80 ml de PBS por lavado, como se ha demostrado.

A continuación, utilice pinzas largas y estériles para transferir las hAM individualmente, a una placa de cultivo de 10 cm, que contenga 10 ml de PBS. A continuación, coloque una membrana con el nailon hacia abajo en una segunda placa de cultivo de PBS de 10 cm y separe dos de los cuatro clips que sujetan la membrana al nailon. Inserte el anillo más pequeño del inserto de cultivo entre el nailon y la membrana, asegurándose de que la membrana cubra completamente el anillo más pequeño.

Sujete la segunda parte del inserto de cultivo a la parte superior de la membrana de modo que la membrana basal del hAM quede hacia el lado derecho hacia arriba en el inserto de cultivo y separe los dos últimos clips. A continuación, utilice unas tijeras estériles para recortar cualquier membrana fuera del inserto de cultivo según sea necesario. Y use fórceps para transferir la membrana a un pocillo de una placa de 12 pocillos, que contiene PBS para su almacenamiento a 37 grados Celsius y 5% de CO2.

Antes de la siembra, caliente los viales criogénicos que contienen una vez de 10 a la sexta célula EPR en 3 ml de medio EPR en un tubo cónico de 15 ml por vial. Cuando las células se hayan descongelado, pipetee para obtener suspensiones de células individuales en cada uno de los tubos, y cuente el número de células viables por exclusión de azul tripan. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos a una concentración de siete veces 10 a la quinta célula por mililitro en un medio RPE fresco.

A continuación, aspire el PBS de cada pocillo de la placa de 12 pocillos preparada y agregue 500 microlitros de células al centro de cada inserto de cultivo y 1 ml de medio RPE al fondo de cada pocillo. Luego regrese la placa a la incubadora de cultivo celular durante 30 días, cambiando el medio dos veces por semana hasta el final del cultivo. En el día 30 de cultivo, calentar una solución de gelatina al 8% en un baño de agua a 37 grados centígrados, durante 30 minutos.

Y llene la cámara interna de un vibratomo con cuatro grados Celsius de medio independiente del CO2. Use un bisturí para cortar un bloque de 5 cm por 5 cm de un bloque de gelatina al 20% almacenado a cuatro grados centígrados. Asegure la parte superior del bloque al soporte con un adhesivo adecuado.

Y coloque una nueva cuchilla en el vibrátomo. Ajuste el bloque hasta que esté al mismo nivel que la hoja de afeitar y llene el baño alrededor del soporte con un medio fresco independiente de CO2 de cuatro grados centígrados. Corte el bloque a una velocidad media hasta que el bloque se corte uniformemente con una superficie de avance lisa y establezca la posición en cero.

Luego aspire el medio alrededor de la gelatina hasta que la gelatina esté completamente seca. Y use fórceps para abrir con cuidado un inserto de cultivo sembrado con RPE en la parte superior del bloque. Utilice unas tijeras para quitar toda la membrana fuera del anillo de inserción y aspire todo el volumen de medio residual.

Agregue hasta 1 ml de solución de gelatina líquida al 8% a la membrana hasta que esté cubierta. Y retira con cuidado el exceso de gelatina. Después de cinco a ocho minutos, agregue cuatro grados Celsius de medio independiente de CO2 al baño hasta que la membrana solidificada esté cubierta.

Y con el vibratomo en la posición de 100 micras, corte una sección de la membrana a una velocidad media, teniendo cuidado de mantener la orientación del tejido. Corte una esquina de la sección con un bisturí para permitir la identificación de la orientación de la sección. Y use una espátula para transferir la membrana incrustada en gelatina a una de una placa de seis pocillos, llena con un medio de conservación de cuatro grados centígrados.

La orientación de la rebanada podría invertirse debido al movimiento liberado antes de la esquina que se está cortando. Por lo tanto, tenga cuidado de asegurar la posición de la rebanada justo después de la sección. A continuación, el tamaño del implante se puede ajustar al tamaño del ojo del receptor bajo un microscopio quirúrgico, previo al trasplante.

Por lo general, quedan unas pocas células muertas en la superficie de la membrana, después de la fijación en el inserto de cultivo, pero esas células se eliminan cuando se cambia el medio de cultivo. Las fibras de la membrana basal son visibles a un aumento mayor cuando no quedan células, lo que indica que el período de tratamiento con termolisina se ha optimizado. El epitelio de la retina se vuelve más fácil de ver bajo un microscopio, a medida que madura, formando una monocapa completa similar a un adoquín a las tres semanas.

A las cuatro semanas, el epitelio está lo suficientemente maduro como para estar preparado para la implantación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el estado de la gelatina depende de la temperatura. Por lo tanto, tenga cuidado de seguir estrictamente las temperaturas recomendadas.

Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la terapia con células madre exploren el potencial terapéutico de un tejido de bioingeniería en un modelo animal de retinosis pigmentaria. Aunque este método se puede utilizar para preparar un tejido sobre un andamio, para su posterior trasplante, también se puede aplicar a sistemas más complejos que contienen capas de fotorreceptores. Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad para manejar las membranas amnióticas humanas, que son muy delgadas y tienden a plegarse fácilmente.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de fijación de la membrana amniótica humana y de inclusión de gelatina son difíciles de aprender y requieren un enfoque de manejo particular.