Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanomedicina sobre la eficacia y la seguridad del fármaco cargado en nanopartículas administradas a la madre y al feto. La principal ventaja de esta técnica es que facilita una medición bioquímica precisa de la cantidad de fármaco que se suministra a la placenta. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las complicaciones del embarazo mediadas por la placenta, ya que es importante garantizar una orientación precisa de la administración del fármaco a la placenta.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la evaluación por ultrasonido de alta frecuencia del desarrollo embrionario requiere paciencia y experiencia para dominarlo. Para la inyección intravenosa de nanopartículas, transfiera una rata embarazada de Embryonic Day 14.5 con venas de la cola dilatadas por calor a un retenedor y limpie la cola con un hisopo con alcohol. A continuación, inserte la punta de la aguja de una jeringa de insulina de calibre 28 en una vena de la cola dilatada y presione lentamente el émbolo durante cinco a 10 segundos con una presión uniforme para introducir las nanopartículas en la vena de la cola.

30 minutos después de la inyección, coloque la rata embarazada anestesiada en la cámara de imágenes de un sistema de imágenes de fluorescencia in vivo en posición supina. Seleccione la fluorescencia 2D y los parámetros fotográficos apropiados para obtener imágenes de las señales de fluorescencia verde de indocianina, y establezca la exposición en automático y las longitudes de onda de excitación y emisión en 710 y 820 nanómetros, respectivamente. A continuación, imagina al animal y devuelve a la rata preñada a su jaula.

48 horas después de la inyección, use pinzas de Graefe, pinzas de tejido de Graefe y tijeras de disección para recolectar los fetos y las placentas, y obtener imágenes de los tejidos recolectados como se acaba de demostrar para todo el animal. Para la evaluación por ultrasonido de alta frecuencia del desarrollo embrionario, 24 horas después de la inyección de nanopartículas, asegure la madre embarazada anestesiada en una plataforma de imágenes de ultrasonido precalentada de 37 a 42 grados Celsius en posición supina y coloque el transductor de 40 megahercios en el brazo mecánico. A continuación, ajuste la posición del transductor para obtener imágenes longitudinales del feto y la placenta con la región de interés dentro de la zona focal.

Para obtener imágenes y análisis en modo B, seleccione el modo B y baje el transductor sobre el abdomen hasta que el feto y la placenta estén a la vista. Haga clic en Escanear/Congelar para iniciar y detener la imagen, en Tienda de cine para almacenar el bucle de cine y en Tienda de fotogramas para almacenar las imágenes de fotogramas. A continuación, haga clic en Medir para analizar la longitud del saco gestacional, la longitud de la grupa de la corona fetal, el diámetro biparietal, la circunferencia abdominal, el diámetro de la placenta y el grosor de la placenta.

Para obtener imágenes y análisis Doppler de onda de pulso, utilizando la misma proyección de escaneo, primero haga clic en Color, luego seleccione Onda de pulso y coloque el cuadro de volumen de muestreo en el centro de la arteria umbilical. Haga clic en Escanear/Congelar para iniciar la adquisición de imágenes y en Cine Store para recopilar las imágenes de la arteria umbilical. A continuación, haga clic en Medir para calcular la velocidad máxima de la arteria umbilical.

Para obtener imágenes y análisis en modo Doppler color, utilizando la misma proyección de escaneo, haga clic en Color y ajuste la posición del transductor para obtener imágenes del corazón fetal como se muestra. A continuación, haga clic en Medir para calcular la frecuencia cardíaca fetal del bucle de imagen de cine almacenado. Para el análisis de cromatografía líquida de alta presión, o HPLC, primero inyecte una rata embarazada de Embryonic Day 14.5 con una dosis única de nanopartículas, como se demuestra.

Después de 24 horas, perfunda el corazón de la hembra embarazada con 50 mililitros de solución salina helada al 0,9% durante 10 minutos para eliminar cualquier nanopartícula no unida, y recoja los fetos y las placentas para almacenarlos a menos 80 grados centígrados. El día del análisis, agregue 500 microlitros de solución de homogeneización recién preparada a cada muestra de tejido de 200 miligramos y homogeneice las muestras dos veces a toda velocidad durante 30 segundos por disociación. Después de la segunda homogeneización, centrifugar las muestras y filtrar los sobrenadantes a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros en un vial de HPLC.

Coloque los viales de muestra en una bandeja de muestreador automático para inyección y encienda el desgasificador de HPLC para eliminar el aire del sistema. A continuación, encienda el flujo para equilibrar la columna con la fase móvil durante 30 minutos para reducir el ruido de referencia y ajuste la temperatura de la columna a 25 grados centígrados. A continuación, inyecte volúmenes de muestra de 20 microlitros a un caudal de un mililitro por minuto en 30 minutos y haga clic en Método de ejecución para comenzar el análisis.

Cuando se completen las corridas, cambie manualmente la fase móvil a acetonitrilo de grado HPLC y haga funcionar el acetonitrilo durante aproximadamente 15 minutos para proteger el sistema. Las imágenes in vivo revelan fuertes señales de color verde indocianina en el tejido uterino 30 minutos después de la inyección de nanopartículas conjugadas con fluorescencia unidas a sulfato de condroitina placentaria, mientras que las nanopartículas no unidas se localizan principalmente en el hígado y las regiones esplénicas. 48 horas después de la inyección, se observa una señal fluorescente en la placenta de los animales inyectados con nanopartículas unidas a sulfato de condroitina placentaria, sin que se detecten señales dentro del feto.

La monitorización ecográfica de alta frecuencia de animales inyectados con nanopartículas conjugadas con fluorescencia unidas a sulfato de condroitina placentaria revela una disminución significativa de los puntos de referencia clave del desarrollo fetal y placentario. Curiosamente, el tratamiento con nanopartículas unidas a metotrexato también perjudica ligeramente el desarrollo fetal y placentario, lo que indica que las nanopartículas pueden mejorar la entrega de metotrexato a la placenta a través del efecto mejorado de permeabilidad y retención. La medición de las concentraciones de metotrexato por HPLC indica un tiempo de retención de siete minutos dentro de las placentas de ratones inyectados en nanopartículas unidas a metotrexato.

24 horas después de la inyección, los niveles de metotrexato placentario en el grupo inyectado con nanopartículas unidas a metotrexato son significativamente más bajos que los medidos en el grupo de sulfato de condroitina placentario y nanopartículas unidas a metotrexato, sin que se haya detectado metotrexato en los fetos de este último. El metotrexato aún se puede detectar en la placenta 48 horas después de la inyección de sulfato de condroitina placentaria y nanopartículas unidas a metotrexato, lo que demuestra que el sulfato de condroitina placentaria y las nanopartículas unidas a metotrexato no pueden atravesar la placenta, minimizando así los posibles efectos adversos en el feto. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la placenta comienza a formarse alrededor del día embrionario 9 1/2 y, por lo tanto, el experimento de imágenes in vivo se realiza mejor en el día embrionario 10 1/2 o más tarde.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción y el análisis inmunofluorescentes, para responder preguntas adicionales sobre la localización de las nanopartículas dentro de la placenta. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina reproductiva exploraran la posibilidad de un tratamiento dirigido a la placenta en las complicaciones del embarazo.