Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación de la expresión génica, como la forma en que las proteínas de unión al ARN se ensamblan en ARN particulares in vivo y, por lo tanto, imponen la regulación génica postranscripcional. La principal ventaja de esta técnica es que no necesita ningún tipo de clonación ni manipulación genética. Se puede adaptar a cualquier organismo modelo o subtipo.

Para diseñar oligonucleótidos, analice la estructura secundaria del ARNm o un fragmento del mismo utilizando herramientas en línea. Primero, ingrese la secuencia de nucleótidos en el cuadro vacío, luego, en el cuadro Opciones básicas, seleccione energía libre mínima y evite pares de bases aislados. En el cuadro Opciones de salida, seleccione el gráfico interactivo de estructura secundaria de ARN y, por último, haga clic en el botón Continuar.

Aparecerá una nueva ventana que muestra la estructura secundaria del ARNm de interés. Seleccione al menos tres secuencias diferentes de 21 a 24 nucleótidos de longitud dentro del ARNm de interés, preferiblemente en regiones que carecen de estructuras secundarias extensas y ubicadas en regiones no traducidas de 3 primos. Seleccione regiones con una relación guanidina/citosina cercana al 50% y que carezcan de repeticiones en tándem de nucleótidos para evitar la posible formación de horquillas o autorecocido.

Diseñar manualmente oligonucleótidos de ARN modificados con metoxi de 2 primos que lleven un resto de biotina en el 3-primo y que sean totalmente complementarios a las regiones seleccionadas dentro del ARNm objetivo deseado. Utilice una herramienta en línea adecuada para ajustar la temperatura de fusión de los híbridos de ARN a entre 60 y 65 grados y que tenga una buena complejidad de secuencia lingüística. Utilice la herramienta de búsqueda de alineación local básica para buscar una posible hibridación cruzada de ASO con otros ARNm en el transcriptoma.

Seleccione Nucleotide BLAST, inserte la secuencia en el cuadro vacío y seleccione el organismo de interés. Mantenga los parámetros restantes como predeterminados y haga clic en BLAST. Transfecte células HEK293 al 70% de confluencia en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros mezclando dos microgramos del gen reportero con 20 microlitros de reactivo de transfección y añadiéndolos a las células.

Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados durante 48 horas antes de la cosecha. El día de la cosecha, retire el medio con una pipeta serológica y lave rápidamente las células dos veces con 10 mililitros de PBS precalentado a 37 grados centígrados. A continuación, agregue seis mililitros de PBS al plato y colóquelo en hielo.

A continuación, exponga las células a la luz ultravioleta a 100 milijulios por centímetro cuadrado en un reticulante UV. Después de la exposición a los rayos UV, raspe las células y el PBS y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. A continuación, gire las células a 250 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de eliminar el sobrenadante con una pipeta, vuelva a suspender las células en dos mililitros de tampón de lisis preenfriado pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco o seis veces mientras mantiene el tubo en hielo. Transfiera el lisado con una pipeta a un tubo de cinco mililitros colocado en hielo y sonique durante tres rondas que consisten en ráfagas de 20 segundos a una amplitud de 10 micras con 30 segundos de períodos de enfriamiento en hielo. Después de transferir el lisado a tubos de dos mililitros, centrifugar a 15.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Recoja el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo. Para comenzar el aislamiento del ARN, equilibre un miligramo de perlas magnéticas acopladas a oligo(dT) en 500 microlitros de tampón de lisis. Retire el tubo del rotor, colóquelo en una rejilla magnética y retire el tampón de lisis.

Combine cuatro miligramos de extracto de proteína HEK293 con las perlas magnéticas acopladas a oligo(dT)25. Mezcle las muestras vigorosamente, luego incube durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Coloque los tubos en un soporte magnético durante 10 segundos, luego retire el sobrenadante.

Mantenga el sobrenadante en hielo para las siguientes rondas de recuperación. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado A a las perlas y al vórtice durante cinco segundos. Recoja las perlas con un imán y luego lave las perlas dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado B.To eluir el ARN, agregue 30 microlitros de Tris-HCl de 10 milimolares e incube el tubo a 80 grados Celsius durante dos minutos con agitación continua a 1, 000 RPM.

Transfiera el tubo directamente al soporte magnético y recoja el eluido lo más rápido posible después de unos 10 segundos para evitar la posible reunión de los ARNm a las perlas a temperaturas más bajas. Los eluidos de las rondas repetidas se combinan y se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados. Para capturar ARNm específicos, agregue 30 microlitros de perlas magnéticas acopladas a estreptavidina a un mililitro de tampón de unión y lavado que contenga 0,1 miligramos por mililitro de ARN de transferencia de E. coli.

Equilibre en un rotor durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, lavar las cuentas tres veces con 750 microlitros de tampón de encuadernación y lavado. Agite el tubo, luego retire el tampón B&W, luego vuelva a suspender en 30 microlitros de tampón y manténgalo en hielo hasta su uso.

Diluir aproximadamente 35 microgramos de proteína total del poli(A)aislamiento previo en 100 microlitros de tampón de unión y lavado, luego agregar 200 picomoles del oligonucleótido antisentido apropiado e incubar a 70 grados Celsius durante cinco minutos para facilitar el recocido. Retire todo el bloque de calor del dispositivo y colóquelo a temperatura ambiente durante 10 minutos para que se enfríe lentamente. A continuación, agregue los 30 microlitros de perlas magnéticas equilibradas acopladas a estreptavidina a la muestra, luego incube la mezcla durante 30 minutos a 25 grados Celsius con agitación constante a 950 rpm en un mezclador.

Coloque el tubo en el soporte magnético, retire el sobrenadante y lave las cuentas tres veces con 750 microlitros de tampón de unión y lavado precalentado a 55 grados centígrados. Agregue 20 microlitros de Tris-HCl de 10 milimolares y colóquelo a 90 grados centígrados con agitación constante a 950 rpm durante 10 minutos para eluir el ARN. Después de 10 minutos, coloque el tubo en el soporte magnético e inmediatamente recoja el eluido.

Se trata de un gel de agarosa utilizado para la detección de ARNm con RT-PCR utilizando cebadores específicos tras la captura con oligo(dT) y un oligonucleótido antisentido a los ARNm p27 del extracto celular HEK293. También se muestra un control sin oligonucleótidos antisentido. Los carriles de entrada muestran el ARN total de las células reticuladas.

Además, también se muestran los resultados de la competencia con poly(A). Aquí se muestra un análisis de inmunotransferencia de proteínas unidas a ARNm con anticuerpos que detectan el antígeno humano R, proteína de unión al ARN desconocida y beta-actina, que es una proteína de control negativa. La transferencia muestra que el antígeno humano R se detectó con éxito en aislados de poli(A)ARN tras la captura de ARNm p27 con oligonucleótidos antisentido.

No se detectó el antígeno R humano en los aislados de control sin oligonucleótidos antisentido. Los carriles de entrada muestran las proteínas en el extracto de células reticuladas y también se muestran los resultados de la competencia con poli(A). Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectrometría de masas para analizar sistemáticamente toda la muestra de proteína que interactúa con un ARN particular in vivo.

Es importante destacar que TRIP es un enfoque versátil que se puede adaptar a todos los tipos de ARN poliadenilados en todos los organismos para comprender la disposición dinámica de las interacciones de las proteínas de ARN. Por lo tanto, se puede utilizar para investigar ARN controlados por el desarrollo o relacionados con la enfermedad y, con el tiempo, puede conducir a nuevos objetivos para la intervención terapéutica.