Name: Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a operar un microbioreactor de alto rendimiento para la producción de anticuerpos IgG1 en células CHO. Este protocolo automatizado permite gestionar 48 cultivos paralelos con control de pH y oxígeno disuelto.

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Los autores desean agradecer a Scott Lute para el apoyo analítico que. Parcial de financiamiento interno y el apoyo a este trabajo fue proporcionado por el programa de ruta crítica de CDER (CA #1-13). Este proyecto fue apoyado en parte por una cita para el programa de participación de prácticas/investigación en la oficina de productos biotecnológicos, U.S. Food and Drug Administration, administrado por el Instituto Oak Ridge para la ciencia y la educación a través de un convenio interinstitucional entre el Departamento de energía de Estados Unidos y la FDA.

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Descargo de responsabilidad: Esta publicación refleja las opiniones del autor y no debe ser interpretada para representar puntos de vista o políticas del FDA.

Funcionamiento el sistema automatizado del biorreactor micro y eficiente consiste en la ejecución oportuna de múltiples pasos automatizados. Una de las partes más importantes del funcionamiento del sistema es el software de programación. Si hay algún error al escribir el programa, habrá graves errores en el experimento que puede resultar en cambios inesperados en el proceso, estrategia, estrategia de muestreo o calidad del producto final que puede invalidar los resultados del estudio de la alimentación. Otro aspecto importante del funcionamiento del sistema es Coloque y apriete correctamente la placa de la abrazadera para asegurar control adecuado de la. La indicación más común que la placa de fijación ha sido apretada irregularmente es variaciones inesperadas en las medidas de para los vasos 1, 6, 7 y 12 (esquina reactor de vasos). General inestabilidad indica un aflojamiento de las juntas de las líneas de entrada de gas en las placas de sujeción. Este escenario puede impedir alcanzar el set point de. Otra trampa común para evitar al comenzar un experimento es dejar que las células se sientan demasiado tiempo durante la etapa de inoculación, causando que resolver. Menos tiempo que las células pasan sentado, el menos posibilidades hay que progresivamente menor recuento del inóculo se agrega cronológicamente a los reactores que pueden inducir sesgos significativos que involuntariamente daña los resultados del estudio. Es mejor sembrar en etapas múltiples, es decir, inocular entre cada estación de la cultura uno con los pasos de pausa para que las células no están sentados en la placa de inoculación durante más de 15 minutos.
Sobre el uso día a día, mantener la esterilidad es vital. Aunque el sistema está en un gabinete de seguridad biológica, no se garantiza la esterilidad debido a frecuentes movimientos dentro y fuera de la campana. En consecuencia, todo lo que va en la campana debe ser rociado con IPA 70%. En segundo lugar, es esencial para asegurar que la formación mínima de espuma ocurre durante el cultivo; los medios de comunicación pueden atascar al gasear y agotar las líneas, resultando en daños de la placa de la abrazadera e incluso componentes abajo. Medidas preventivas además de espuma son fundamentales en cualquier diseño del biorreactor micro programa. En el caso de una espuma de"hacia fuera" sería beneficioso para seguir los fabricantes protocolo de limpieza y puede prevenir el daño permanente de las placas de sujeción. Como alternativa, uso de recipientes no sparged puede ser beneficioso para menores densidades celulares o cuando se ejecuta en modo por lotes, superficie más alta al cociente del volumen permite eficiente oxígeno incluso con la carencia de un sparger. Sin embargo, los buques no sparged no podrían ser útiles para culturas de célula alta densidad o de la perfusión como el espacio de cabeza no es suficiente para mantenerse al día con las culturas creciente consumo de oxígeno.
Hay numerosas ventajas proporcionadas por el sistema de microbioreactor, ya que permite que múltiples culturas controladas para ejecutarse en paralelo en pequeña escala con un mayor control de agitar los frascos. 17 por tanto, el sistema facilita la ejecución de estudios, hace estudios de clones de alto rendimiento y estudios de transfección de detección. Manejo automatizado de líquidos también reduce la variabilidad de Analista a Analista minimizando al mismo tiempo tediosa y mucho tiempo de trabajo para personal capacitado. Si bien hay varias ventajas al sistema, existen varias desventajas claves que deben considerarse. En primer lugar, un volumen de 15 mL de cultura limita significativamente en el proceso muestreo y material de cosecha final y varios Biorreactores alternativas a pequeña escala (hasta 500 mL) recientemente han estado disponibles. Un adelanto reciente al sistema es la integración del biorreactor automatizado microescala con el analizador del BioProfile FLEX 2 de Nova Biomedical, que mitiga el problema de proceso de muestreo en reduciendo el volumen de la muestra para el análisis de densidad y nutriente celular . Beneficios pueden incluir la configuración rápida y prácticamente sin limpieza hacia ahorros operacionales, sin embargo el costo de las unidades desechables debe ser considerado para proyectos de largo plazo que sea más costoso comprar las unidades que los sistemas convencionales reutilizables.
El método discutido en este trabajo es principalmente conveniente para el cultivo de células de modo por lotes, pero puede modificarse dependiendo de las necesidades del usuario. Cada estación tiene un control independiente de temperatura, mientras que DO y pH pueden variar en el nivel de reactores individuales. Sartorius ofrece también DoE software diseñado específicamente para permitir experimentos de planificación para ser adaptado para el sistema micro del biorreactor. Estudios de DoE de gran escala usando el nuevo software de DoE proporcionado por el fabricante pueden ayudar en los medios de comunicación y optimización de suplemento. Aunque no se utiliza aquí, el sistema microbioreactor permite también estudios batch alimentado. El sistema aún no ha sido optimizado para cultivos celulares de perfusión. Sin embargo, ha habido pocos estudios y ensayos para imitar la operación de cultivo de células de la perfusión en el actual sistema de biorreactor micro. 26 este método puede ser modificado para imitar culturas de perfusión de alta densidad por colocar la célula. Variando la altura a la que la pipeta se introduce en el reactor y optimizando el tiempo de adaptación, los medios de comunicación se pueden quitar y reponer a modo de profusión de espejo de la cultura. Hay nuevos productos en esta área en desarrollo que puede funcionar mejor que el sistema presentado aquí si se desea el modo de la perfusión de la cultura.
En Resumen, este estudio demuestra el uso de automatizado micro-biorreactores y asociados analítico para operaciones de cultivo de células CHO producir y caracterizar un anticuerpo IgG1 Monoclonal de modelo. Destaca el papel de micro-biorreactores de pequeña escala en la fabricación de bioprocesos y su impacto en el desarrollo de la cultura de célula y proyección de los medios de comunicación. Mientras que hay muchas ventajas a usar un sistema automatizado de pequeña escala, para obtener todos sus beneficios procesan de comprensión y caracterización analítica es imprescindible. Este estudio proporciona al usuario una guía para el uso de un sistema de reactor de microescala automatizado, que puede ser desarrollado y mejorado por las necesidades de investigación individual.

Anticuerpos monoclonales (mAbs) primero fueron producidos en las células de hibridoma de ratón en 19751. Desde entonces, un aumento en el desarrollo de la producción de proteína recombinante ha tenido lugar a humanizar mAbs aumento en vivo seguridad y eficacia2,3,4. La mayoría de los procesos de producción de proteínas recombinantes emplea células de ovario de hámster chino (CHO) por la facilidad con que pueden ser adaptados a los medios libres de suero, su capacidad para producir proteínas con modificaciones post-traduccionales similares a la de un humano innato proteína y su fiabilidad como anfitrión células5,6.
La demanda está creciendo para ofrecer el producto más rápido y para poblaciones de pacientes más grandes con una calidad constante. Además de los beneficios económicos, está aumentando el repertorio de patologías tratadas por mAbs, que ahora incluye enfermedades autoinmunes, complicaciones post-trasplantes, artritis y cáncer7. Rendimientos promedio para mAb comerciales modernas líneas de producción son típicamente en el rango de 5-6 g/L y continúan aumentando5. En parte, esto se ha logrado mediante ingeniería de células CHO y el análisis de la línea de producción mejorada utilizando biorreactores de alto rendimiento8. Sin embargo, se han atribuido más incrementos en la producción de proteínas para procesar mejoras, incluyendo los avances en la optimización de los medios de comunicación, las condiciones de cultivo celular y mejorado la alimentación estrategias7,9,10. La suplementación de nutrientes es esencial no sólo para el crecimiento celular adecuado sino también para la producción eficiente de proteínas de alta calidad. Además, las células requieren la adición estequiométrica de nutrientes específicos, que requieren entendimiento adicional para alimentar estrategia optimización6,11. Métodos de optimización tradicionales incluyen la valoración del componente de medios individuales y medios de comunicación con diseños de mezcla. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo, mano de obra intensivo e implican riesgos de error humano12,13.
Estudios de optimización de los medios de comunicación previamente confiaban en agitar matraces y bioreactores de 1-2 L que pueden ser prohibitivos en términos de materias primas y capital humano. También se han utilizado placas pero estos métodos proporcionan escalabilidad limitada. Además, esto todavía puede requerir varios funcionamientos desperdiciadores de tiempo que introducen variabilidad de lote a lote que oscurece la variabilidad CQA causada por la composición de los medios de comunicación y alimentación estrategia14,15,16. Por lo tanto, la necesidad de alto rendimiento y altamente consistente biorreactor paralelo sistemas surgieron17,18,19,20.
Con el costo significativo asociado con la operación de biorreactores de báscula de mesa tradicionales (0.5-5 L), microbioreactors ofrecer una alternativa de reducción de costos para evaluar biológicamente la producción de derivados de drogas. 21 -báscula de mesa de biorreactores de tanque agitado son confiables y proporcionan datos densos por medio de matrices sensoriales. Sistemas de control de retroalimentación permiten fácil supervisión de la operación. Sin embargo, el montaje, calibración, limpieza, los costos laborales, sustrato costos y requisitos de esterilización hacen biorreactores de tanque agitado-Balanzas costosos y mano de obra intensiva para operar. Agitar matraces y las placas de microtitulación quitar algunos de los costos y problemas relacionados con biorreactores de escala más grandes de la mano de obra, pero estas alternativas proporcionan un débil control sobre las condiciones de procesamiento y datos de baja densidad, a menudo solamente las mediciones de punto final. 22
Alternativamente, microbioreactors utilizar un pequeño volumen de trabajo para proporcionar un enfoque de escala hacia abajo a línea celular y el desarrollo del proceso por aguas arriba. La escala de los experimentos de microbioreactor puede disminuir perceptiblemente coste corriente a través del menor uso de energía, sustrato, mano de obra, espacio y utilidades. 23 Microbioreactors son como agitar matraces que son fáciles de manejar debido a su tamaño, pero conservan las ventajas de biorreactores Balanzas tradicionales a través del control feedback en línea de pH, temperatura, oxígeno disolución y ácido/base consumo, así como su salida de datos en tiempo real de parámetros de calidad incluyendo fuera de la composición del gas. Escala de Microbioreactor permite la capacidad de proyección de alto rendimiento, que puede ser útil para el desarrollo de proceso de selección y copia. 24
El biorreactor de microescala avanzada ha demostrado ser una herramienta eficaz para la caracterización de proceso CHO de la célula cultura y desarrollo18. Aquí, un sistema automatizado ambr15, consistiendo en 48 microbioreactors en paralelo, que han demostrado ser comparables al clásico revuelto de reactores de tanque en escala estudios,25 fue utilizado en una manera análoga al trabajo previo que optimizan los medios de comunicación composición para una línea de células de CHO-DG44 produciendo un modelo quimérico IgG16. Los efectos de diferentes condiciones de los medios de comunicación en crecimiento y un título fueron en comparación y analizados. En este trabajo se presenta una guía general para ejecutar el sistema de microbioreactor y análisis de muestras de crudo media.

<table><tbody><tr><td>Línea celular CHO DG44</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>AMBR 15 sistema de microbiorreactor automatizado</td><td>Sartorius</td><td>001-2804</td><td>microbiorreactor automatizado</td></tr><tr><td>AMBR 15 Cell Culture 24 Biorreactores desechables - Sparged</td><td>Sartorius</td><td>001-2B80</td><td></td>Puntas de</tr><tr><td>pipeta desechables de 1 mL, esterilizadas</td><td>Sartorius</td><td>A-0040</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta desechable de 5 mL puntas esterilizadas</td><td>Sartorius</td><td>A-0039</td><td></td></tr><tr><td>24 Placas de pocillos profundos</td><td>Sartorius</td><td>A-0038</td><td></td></tr><tr><td>1 Placas de pocillos</td><td>Sartorius</td><td>A-0068</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>contador de células automatizado</td></tr><tr><td>EX-CELL&nbsp; Antiespumante (irradiado con rayos gamma)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59920C-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td></td></tr><tr><td>100X Penicilina/Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Matraces de agitación F-Bottom (estériles, ventilados)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PBV12-5</td><td></td></tr><tr><td>Matraces giratorios de vidrio de 125 mL</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos PP de 250 ml (estériles)</td><td>Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>376814</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>BioRad Laboratories, Inc.</td><td></td><td></td>1450103</tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BioProfile FLEX Analizador</td><td>Nova Biomedical</td><td>49418</td><td>Analizador de nutrientes</td></tr><tr><td>Octet Red 96</td><td>Pall Fort&eacute; Biografía&nbsp;</td><td>99-0042</td><td>Proteína A Biosensor</td></tr><tr><td>Proteína A Biosensores de inmersión y lectura Pall</td><td>Fort&eacute; Biografía&nbsp;</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de polipropileno de 96 pocillos, fondo F, estilo chimenea, negro</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr></tbody></table>

microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de igg1 modelo en células cho

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Biorreactores de microescala automatizado (15 mL) pueden ser una herramienta útil para los ingenieros de la cultura de célula. Facilitan la ejecución simultánea de una amplia variedad de condiciones experimentales y reducir al mínimo variabilidad potencial de proceso. Las aplicaciones de este enfoque incluyen: copia proyección, cambios de temperatura y pH, optimización de medios de comunicación y suplemento. Además, los volúmenes de reactor pequeño son propicios para el gran diseño de los experimentos que investigan una amplia gama de condiciones. Esto permite que procesos upstream optimizarse considerablemente antes de escalar donde experimentación es más alcance limitada debido al tiempo y las restricciones económicas. Sistemas de biorreactor de microescala automatizados ofrecen diversas ventajas sobre el tradicional a pequeña escala unidades de cultivo de células, tales como agitar matraces o frascos de spinner. Sin embargo, en escala piloto proceso desarrollo significativo debe tener cuidado para asegurar que se realizan estas ventajas. Cuando se ejecuta con cuidado, el sistema permite la automatización de nivel alto, puede ser programado para funcionar de DOE con un mayor número de variables y puede reducir el tiempo de muestreo cuando se integra con un analizador de nutrientes o un contador de células. Integración de la heurística derivados del experto presentada aquí, con experimentos de biorreactor automatizado microescala actual puede minimizar errores comunes que impiden resultados significativos. En el extremo, no apegarse a los principios establecidos aquí puede conducir a daño al equipo que requiere reparaciones costosas. Además, los sistemas microbioreactor tienen volúmenes de pequeña cultura dificulta la caracterización de las condiciones de cultivo celular. El número y la cantidad de muestras tomadas en proceso en la cultura de modo de lote es limitada como volúmenes de funcionamiento no inferiores a 10 mL. Este método discuten las ventajas e inconvenientes de los sistemas del biorreactor de microescala.

Monitoreo de parámetros críticos de proceso y otros parámetros de la cultura de célula durante el funcionamiento de los cultivos celulares es un aspecto importante en bioprocesamiento. El contador de célula y analizador de nutrientes se utilizan para cuantificar cinco atributos que caracterizan el crecimiento celular, consumo de nutrientes y formación de subproducto. El recuento se obtuvieron todos los días para todas las condiciones de la cultura. Las densidades promedio células viables y viabilidades son como se ve en la figura 3 , junto con su intervalo de ±1 SD. También se muestran los perfiles de nutrientes y subproducto con el intervalo de ±1 SD a través de la fase estacionaria de las culturas. La pendiente de este perfil representa las tasas medias de glucosa y glutamina consumo y producción de lactato. En general, estos resultados demuestran la factibilidad de monitoreo estos atributos en el sistema de microbioreactor; así como la capacidad del sistema microbioreactor para mantener estos parámetros dentro de un rango ajustado.
La productividad total de los cultivos celulares se cuantificó usando un sistema biosensor de proteínas después de que los medios de cultivo celular cosechada fue pasado a través de un filtro de 0,22 micras PVDF. La productividad específica por celular que oscilan de 0.87 pg/célula-d a 1.15 pg/célula-d como se ve en la figura 4. Basado en estos resultados se puede investigar una amplia gama de condiciones para seleccionar la composición de los medios de comunicación y alimentación estrategias que maximicen la cantidad de proteína producida por una inversión mínima en procedimientos experimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> Figura 1 : Diseño del sistema de microbioreactor con 4 estaciones de la cultura (CS) con 12 recipientes de reactor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> Figura 2 : Ejemplo muestra placa set-up para una cuantificación básica con el experimento de regeneración en el sistema de biosensor proteínas. fila 1 (rojo "R") es reservado para la muestra de referencia (es decir, matriz ausente analito); fila 2 (Aguamarina) es un conjunto de normas (concentraciones en μg/mL); filas 3 y 4 (naranja) son sistemas de bajos y altos los controles positivos ("PL" y "PH", respectivamente); filas 5 a 10 (púrpura) contienen muestras desconocidas; filas 11 y 12 (gris) son posiciones de programa predeterminado para la regeneración ("R") y buffer de neutralización ("N"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> Figura 3 : una) promedio de perfiles de densidad y viabilidad de células viables sobre la edad de un lote. ± 1 SD también se muestra para indicar que el estricto control del crecimiento celular en los sistemas de microbioreactor. b) perfil nutriente promedio de glucosa y glutamina, así como el perfil promedio subproducto lactato. ± 1 SD también se muestra para indicar que un control estricto sobre la composición de los medios de comunicación en los sistemas de microbioreactor. (N = 3, todas las condiciones fueron funcionadas por triplicado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> Figura 4 : Representante diagrama de caja de productividad media específica de las diferentes condiciones de los medios de comunicación. (N = 3, todas las condiciones fueron funcionadas por triplicado) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se presenta un protocolo detallado para la operación concurrente de culturas de célula paralelo 48 bajo variadas condiciones en un sistema de microbioreactor. Proceso de cultivo celular, la cosecha y el análisis del título de anticuerpos posterior se describen.

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Este método puede ayudar a responder algunas de las preguntas importantes en el campo de la fabricación de procesos biológicos con respecto a los aspectos de la caracterización de la línea celular y la optimización media y de proceso. Las ventajas de esta técnica son que proporciona un mayor control en los matraces de agitación y permite la automatización y el rendimiento de un gran número de estudios a pequeña escala para la generación rápida de datos. Demostrando el procedimiento será, Sai Rashmika Velugula y Casey Kohnhorst, investigadores en mi laboratorio.Comience sumergiendo una vil de stock de tres veces 10 a la séptima célula de la demostración por mililitro de medio de congelación en un baño de agua Celsius de 37 grados. Cuando sólo quede una pequeña astilla de hielo, entubar suavemente la suspensión celular descongelada rápidamente unas cuantas veces y transfiera un mililitro de células a un matraz de agitación estéril ventilado de 125 mililitros que contenga 29 mililitros de medio OptiCHO. Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius y 8%CO2 con agitación de 130 RPM.Subculturing the cells after 72 hours in 100 milliliters of fresh 37 degrees Celsius medium in a 125 milliter spinner flask for another 72 hour incubation at 37 degrees Celsius and 8%CO2 with stirring at 70 RPM. En el tercer día de subcultura, agregue un medio precalentó fresco al matraz de hilandero para mantener las células al menos un 90% de viabilidad durante las últimas 24 horas de cultivo. A la mañana siguiente, haga clic en el icono del escritorio remoto y haga clic en Conectar.Cuando el escritorio remoto esté conectado, abra el software de contador de celdas e instale un nuevo Reagent Pak. A continuación, vacíe el residuo Trypan Blue y prepara el sistema. A continuación, minimice la conexión remota y abra el software del micro reactor biológico utilizando un experimento existente como plantilla para crear un nuevo experimento.Antes de iniciar una carrera, defina las placas utilizadas durante la carrera en la sección de imitación del software y coloque 12 recipientes de cultivo estériles en cada estación de cultivo. Coloque las placas de sujeción autoclavedas en la parte superior de los recipientes y coloque las placas de agitación en la parte superior de las placas de sujeción asegurándose de que cada pasador esté bien insertado. A continuación, fije las placas de sujeción con los tornillos y los guiños proporcionados.Para poner en marcha el sistema, escanee el código de barras proporcionado con cada recipiente de cultivo. El sistema inicializará y comprobará la presencia de los buques apropiados. Ajuste el control de temperatura a 37 grados centígrados y la agitación a 1.000 RPM y encienda el monitor PH de oxígeno disuelto.A continuación, ejecute el programa de carga media. Una vez cargado todo el medio, se añadirán 35 microlitros de EX-CELL Antifoam desde la placa Antiesptilla a los recipientes de cultivo. Después de 30 minutos comenzar a registrar el oxígeno disuelto y PH dentro de los medios de cultivo, permitiendo que el oxígeno disuelto alcance un punto de consigna de 50%Después del equilibrio de oxígeno disuelto, gire las adiciones de base de fondo para alcanzar un punto de consigna PH de 7.1 para todos los recipientes de cultivo.A la mañana siguiente, ejecute el paso PH pausado y transfiera todo el contenido del matraz spinner a un tubo cónico estéril de 250 mililitros para centrifugación. Resuspender el pellet en suficiente medio fresco como para que la densidad final sea de 10 veces a las sextas células CHO por mililitro después de añadir el inóculo a los recipientes de cultivo y añadir las células suspendidas en los pozos apropiados de una placa estéril de 24 pozos. Agregue tres mililitros de inóculo a cada pozo y coloque la placa de inóculo en el escritorio designado dentro de la capucha.Luego, deje que los recipientes de cultivo se equilibren durante al menos una hora e inicien el paso de recuento de cinco EX-CELL en el programa. Para el análisis diario de nutrientes y metabolitos en el segundo día, coloque las placas del soporte del tubo de muestra en sus cubiertas designadas y cargue los tubos de microcentrífuga abiertos en los soportes apropiados. A continuación, coloque las muestras en la bandeja del analizador para realizar el análisis de nutrientes.Para terminar la carrera primero apague el control de temperatura seguido de la agitación. Detenga el control PH de oxígeno disuelto y las adiciones de base de fondo, todos los demás controles y el monitor del sistema. Desenrosque la abrazadera y revuelva las placas, retire los recipientes de cultivo y atornille las placas de secado en la estación de cultivo.A continuación, ejecute el ciclo de secado de dos horas en el programa;haciendo clic en detener en el software de biorreactor una vez que el ciclo de secado ha terminado. Para cosechar las células, transfiera el fluido de cultivo celular de los recipientes del reactor a los tubos cónicos correspondientes para la centrifugación y filtre los sobrenadantes a través de filtros estériles PVDH de 0,22 micrómetros. A continuación, transfiera un mililitro de cada sobrenadante de cultivo celular estéril a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para un almacenamiento negativo de 20 grados centígrados hasta el análisis del título.Para medir los títulos IgG de las muestras, primero encienda el sistema de biosensores de ayuda a proteínas. Después de que la lámpara se haya calentado durante al menos una hora, deje que las muestras se equilibren a temperatura ambiente y presoak una punta de ayuda a la proteína por muestra en medio de células frescas durante al menos 30 minutos. A continuación, ajuste la temperatura de la placa a 26 grados centígrados.Cargue las muestras en el sistema y ejecute el ensayo utilizando el ensayo de alta sensibilidad predeterminado con la regeneración en el software de adquisición de datos. Usando el contador celular integrado, las densidades celulares y viabilidads medias viables se pueden obtener diariamente para todas las condiciones de cultivo. Utilizando el analizador de nutrientes también podemos obtener los perfiles de nutrientes y subproductos que demuestran la viabilidad de monitorear estos atributos en el sistema del reactor de microbio.Además, la productividad total de los cultivos celulares en las diversas condiciones de cultivo de interés se puede cuantificar utilizando el sistema de biosensores de ayuda a proteínas como se ha demostrado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el protocolo solo funciona si la programación se realiza correctamente;garantizando la ejecución oportuna de los pasos del protocolo con errores mínimos. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como: cromatografía líquida, espectrometría de masas y dispersión de luz multiángulo para responder preguntas adicionales sobre las propiedades físicas y químicas del producto fabricado.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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