Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre los mecanismos de autoinmunidad, inmunodeficiencia, tolerancia central e involución del timo. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro longitudinal in vivo del reclutamiento de progenitores y la salida de células T maduras dentro de segmentos de timo de ratón vascularizado e injertado. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo y la función del timo, también se puede aplicar a otros tejidos como los islotes pancreáticos o los glomérulos renales.

Para aislar el timo, coloque el ratón sobre toallas de papel absorbentes estériles en la posición dorsal erguida en una capucha de flujo laminar y rocíe y limpie el abdomen del ratón con 70% de etanol. Haz una incisión superficial en forma de V en la parte inferior del abdomen para exponer la cavidad torácica y usa un par de tijeras diseccionadas rectas de 10 centímetros para hacer una incisión de 0.5 a un centímetro en el pecho a lo largo de la línea media ventral. Dobla la piel sobre cada lado del pecho para exponer la cavidad torácica y haz dos incisiones laterales más profundas de 0,5 a un centímetro a través del diafragma y la caja torácica para acceder al mediastino superior en la cavidad torácica anterior.

El timo debe aparecer como dos lóbulos pálidos justo encima del corazón. Coloque las puntas curvas del óp parte del timo y tire verticalmente para extraer el órgano completo, evitando el plegado de la caja torácica con un par de fórceps rectos. A continuación, sumerja el timo aislado en un plato estéril de 60 mililitros que contenga PBS estéril en frío sobre hielo y use un bisturí para cortar el istmo conectivo para separar los lóbulos timicos.

Antes del trasplante, etiqueta y pesa cada ratón receptor y coloca al primer animal en una posición lateral reclinado lateral lateral con un ojo expuesto directamente a la lente de un microscopio diseccionador. Usando tijeras Vannas, exteje uno de los lóbulos timicos aislados de hasta un milímetro de ancho siguiendo un patrón en zigzag para asegurarse de que cada segmento contiene algo de corteza timica y tejido de médula. Es fundamental recortar el timo justo antes de la implantación, ya que las piezas grandes pueden no injerto correctamente.

A continuación, comenzando en la base de la córnea del área quirúrgica, utilice la punta de una aguja de 40 milímetros de 18 milímetros para hacer una pequeña incisión en las capas externas de la córnea de modo que se pueda introducir la punta de un par de tijeras diseccionadas. Utilice las tijeras para hacer una incisión de flanco de cinco a 10 milímetros directamente alrededor de la base de la córnea mientras usa fórceps de extremo plano para mantener firmemente la córnea abierta para evitar el resedimiento. Agarrando el epitelio corneal cortado con los fórceps planos, mantener la abertura en la córnea mientras se inserta un segmento timico a través de la abertura.

Es importante insertar la pieza del timo rápidamente a través de la abertura corneal para evitar el resedor espontáneo antes de que se introduzca el tejido. Tenga cuidado de preservar la integridad del tejido en este paso. Presione suavemente sobre la superficie del ojo para deslizar el segmento de tejido introducido a una posición lateral con respecto a la pupila para preservar la función del ojo.

Y utilice fórceps planos para presionar ambos lados de la abertura corneal firmemente uno contra el otro durante tres a cinco segundos para promover el autosellado. Si el trasplante se va a realizar en ambos ojos, gire el ratón hacia el lado lateral opuesto para una segunda implantación como acaba de demostrar. Una vez completada la cirugía, vuelva a colocar el ratón en una jaula vacía precalentada con una lámpara de calor con monitoreo hasta la recumbancia completa.

En el punto de tiempo experimental apropiado, coloque un ratón receptor anestesiado en una plataforma de microscopio de etapa fija en una posición lateral en una almohadilla de calor con un ojo hacia arriba. E inserte la cabeza del ratón en un soporte de cabeza estereotaxico. Ajuste la perilla para sujetar la cabeza del ratón en la posición lateral lateral para permitir el acceso directo del objetivo del microscopio al ojo que sostiene el injerto de timo y tire hacia atrás de los párpados mientras sostiene el ojo en el margen corneal con un par de puntas de pinza cubiertas por un tubo de polietileno unido a una articulación universal sólida UST-2.

Añadir unas gotas de solución salina estéril o lágrimas artificiales entre la córnea y la lente antes de colocar el objetivo del microscopio 5X en el ojo del ratón y localizar el timo en el campo del microscopio. A continuación, cambie a un objetivo de inmersión en agua de mayor resolución con una larga distancia de trabajo y seleccione el modo de adquisición en el software del microscopio. Inicie el modo de escáner de resonancia y seleccione el modo de imagen XYZT.

Encienda el láser de argón y ajuste la potencia al 30% para la excitación de fluorescencia. Seleccione una línea láser de excitación adecuada y establezca el control del divisor de haz acousto-óptico para las longitudes de onda de emisión adecuadas utilizando la detección de reflexión simultáneamente para detectar la retroflujo y delinear la estructura del tejido. Recoja la emisión en la longitud de onda seleccionada y establezca una resolución de 512 por 512 píxeles.

A continuación, haga clic en live para iniciar la imagen, ajustando los niveles de ganancia según sea necesario. Concéntrese en la parte superior del implante timico y seleccione comenzar a definir el comienzo de la pila Z. A continuación, concéntrese en el último plano del timo implantado que se puede visualizar y seleccione el extremo para definir el final de la pila Z utilizando un tamaño de paso Z de cinco micrómetros.

Establezca el intervalo de tiempo para la adquisición de cada pila Z durante 1,5 a dos segundos y seleccione la opción acquire-until-stopped para la creación de imágenes continuas. A continuación, haga clic en Iniciar para inicializar la grabación. Aquí, se muestran imágenes de campo brillante y fluorescencia de la misma zona del implante de timo que pueden servir para un doble seguimiento macroscópico del crecimiento tisular y se muestran estudios de involución y continuación.

La imagen de campo brillante también facilita la visualización de la vascularización del tejido implantado, permitiendo el estudio único de la dependencia de la fisiología del timo en el suministro de sangre con el tiempo. Este modelo permite la visualización de la transmigración celular desde el torrente sanguíneo en el timo implantado, el seguimiento de los contactos entre las células progenitoras GFP-positivas que entran en el implante timico con células epiteliales y estromales timicas residentes etiquetadas por RFP durante los procesos de diferenciación y selección, así como el seguimiento de las células inmunitarias egresivas del timo en los vasos sanguíneos periféricos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la exposición tisular para un injerto óptimo y también limitar el tamaño de la incisión en el ojo para permitir la escisión de fragmentos ilesos a través de la córnea mientras se reduce la fibrosis durante la curación.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como tratamientos de control localizados e incisión de otros tejidos en el ojo contralateral para responder preguntas adicionales sobre disfunciones inmunitarias relacionadas con infecciones, determinantes de involución y mecanismos de tolerancia al trasplante. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran el desarrollo de células T, incluyendo el reclutamiento de progenitores, la dinámica del ojo del timo y los pasos maduros de la egresión de células T in vivo.