Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9
14 de junio de 2018
Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular NK sobre el papel y la función de genes y vías específicos que regulan la función de las células efectoras. La principal ventaja de esta técnica es su alta tasa de éxito en comparación con los enfoques dependientes del ADN, lo que permite un knockout altamente eficiente de uno de los genes clínicamente más relevantes en la terapia con células NK. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia de tumores sólidos y tumores cerebrales que expresan TGF-beta como medio de escape inmunológico.
Para la transducción primaria de células NK, incubar tres veces 10 a las cinco células NK recién aisladas por mililitro de medio RPMI suplementado con 100 UI por mililitro de IL2 por matraz T75 durante cuatro días reemplazando el medio cada dos días y el día antes de la transducción. Para la transducción de células NK ampliadas, estimule las células NK primarias en el día cero con células alimentadoras K562 que expresen IL21 unidas a la membrana radiadas en una proporción de uno a uno, reemplazando el medio cada dos días y el día antes de la transducción. El día de la electroporación, llene un matraz T25 con ocho mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con 100 UI por mililitro de IL2 por celda experimental y coloque los matraces en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de CO2.
Mientras el medio se equilibra, agregue tres o cuatro veces 10 a la sexta celda por condición por 26 microlitros de mezcla de transducción en un tubo cónico y granule las celdas por centrifugación. A continuación, lave las células tres veces en 12 mililitros de PBS estéril por lavado para eliminar todo el FBS de las suspensiones celulares. Mientras se lavan las células, vuelva a suspender cada ARN CRISPR y ARNtrac hasta concentraciones finales de 200 micromolares.
Mezcle 2,2 microlitros de cada ARN CRISPR con un volumen de 200 micromolares de ARNtrac por muestra y caliente las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente y almacene los complejos de ARN/ARNtrac CRISPR a 20 grados centígrados negativos hasta su uso. Para formar los complejos de ribonucleoproteínas, agregue la endonucleasa Cas9 al complejo de ARN CRISPR / ARNtrac correspondiente apropiado con remolinos durante 30 a 60 segundos e incube los complejos de ribonucleoproteínas Cas9 resultantes a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos.
Después del último lavado, agregue todo el volumen de suplemento de electroporación del kit Nucleofector solution P3 y vuelva a suspender cada pellet celular en 20 microlitros de la solución primaria P3 4D-Nucleofector teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. Agregue inmediatamente cinco microlitros de cada complejo de ribonucleoproteínas a la suspensión celular apropiada y agregue un microlitro de 100 micromolares de potenciador de electroporación Cas9 a la mezcla de células del complejo de ribonucleoproteínas Cas9. Transfiera 26 microlitros de la solución celular de ribonucleoproteína Cas9 a pocillos individuales de una tira de Nucleocuvette y golpee suavemente la tira para asegurarse de que las muestras cubran el fondo de cada pocillo.
A continuación, inicie el programa 4D-Nucleofector system EN138. Al final de la transducción, deje reposar las células durante tres minutos. A continuación, añada 80 microlitros del medio de cultivo preequilibrado a cada cubeta y transfiera suavemente las muestras a un matraz por condición a 37 grados centígrados de incubación.
Después de 48 horas de cultivo, extraiga el ADN genómico de cinco veces 10 a las cinco células transducidas para la detección de la deleción génica de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, estimule el resto de las células transducidas con células alimentadoras frescas que expresen IL21 unidas a la membrana en una proporción de uno a uno y extraiga el ARN después de cinco días de cocultivo de acuerdo con los protocolos estándar para el análisis de expresión génica por PCR cuantitativa. El análisis de citometría de flujo revela que el programa EN138 da como resultado el mayor porcentaje de viabilidad celular y eficiencia de transducción de los programas disponibles del sistema Nucleofector.
Por ejemplo, utilizando los ARN guía proporcionados comercialmente, HPRT1 humano se elimina con éxito en células NK humanas expandidas. Además, las ribonucleoproteínas Cas9 que contienen ARN2 guía, ARN1 guía más ARN2 guía y ARN3 guía exhiben un knockout exitoso del gen de dos ectodominios del receptor TGF-beta, mientras que el ARN1 guía por sí solo no induce ninguna deleción de inserción detectable por T7E1. De hecho, el uso del programa EN138 para la electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 da como resultado una reducción del 60% en la expresión del ARNm del receptor TGF-beta dos en las células transducidas a través de este programa.
Además, el cocultivo de las células transducidas con TGF-beta y una línea celular de meduloblastoma primario humano no afecta significativamente la citotoxicidad de las células NK en comparación con las células transducidas de control no tratadas con TGF-beta, enfrentándose a una falta correspondiente de la función del receptor TGF-beta dos en las células modificadas con ribonucleoproteína Cas9 a nivel de proteína. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseñar varios ARN guía diferentes para encontrar el mejor resultado de edición de genes.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación del ADN o el ensayo de mutación T7E1, para responder a preguntas adicionales sobre la eficiencia de la edición de genes o cómo determinar posibles mutaciones genéticas fuera del objetivo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer exploraran el potencial del uso de células NK editadas genéticamente en el tratamiento del cáncer. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la edición de genes de células NK humanas primarias.
Para obtener más información sobre la expansión de la célula NK después de este proceso, consulte nuestro artículo anterior de Jove. No olvide que trabajar con sangre humana puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones universales de salud y seguridad al realizar este procedimiento.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para modificar genéticamente las células asesinas naturales (NK) humanas utilizando Ribonucleoproteínas Cas9 (Cas9/RNPs). El método permite la generación de células NK deficientes en TGFBR2 y HPRT1, facilitando la investigación sobre la biología de las células NK y la inmunoterapia.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Edición genética
Antecedentes
- Las células asesinas naturales (NK) juegan un papel crucial en la respuesta inmune.
- Entender las funciones de los genes en las células NK puede mejorar los enfoques de inmunoterapia.
- Los métodos actuales para la edición genética en células NK tienen limitaciones.
- Este protocolo tiene como objetivo mejorar la eficiencia del knockout génico en las células NK.
Propósito del estudio
- Establecer un método confiable para modificar las células NK.
- Investigar los roles de genes específicos en la función de las células NK.
- Explorar las implicaciones para la inmunoterapia dirigida a tumores sólidos.
Métodos utilizados
- Aislamiento y cultivo de células NK primarias en medio RPMI.
- Transducción de células NK utilizando IL2 y células alimentadoras.
- Electroporación para introducir Cas9/RNPs en las células NK.
- Evaluación de la eficiencia del knockout génico y la funcionalidad.
Resultados principales
- Generación exitosa de células NK deficientes en TGFBR2 y HPRT1.
- Alta tasa de éxito en el knockout génico en comparación con los métodos tradicionales.
- Aplicaciones potenciales en la mejora de la terapia de células NK para tumores.
- Conocimientos sobre los mecanismos de escape inmune en tumores.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque robusto para la modificación de células NK.
- Los hallazgos contribuyen a entender la biología y la terapia de las células NK.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para aplicaciones clínicas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Efficient genome editing of primary human NK cells addresses a critical bottleneck in immunotherapy development, enabling mechanistic interrogation of immune evasion pathways such as TGF-beta signaling. This DNA-free Cas9/RNP approach improves target validation confidence by reducing procedure-associated apoptosis and increasing knockout efficiency, supporting de-risking of NK cell-based therapeutics. The method enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by generating functionally modified NK cells that retain expansion capacity and cytotoxic potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in primary human NK cells to clarify roles of TGFBR2 and HPRT1 in effector cell regulation.
- Operational Value: Provides a high-success-rate alternative to viral transduction, minimizing apoptosis and improving yield of genetically modified NK cells.
- Predictive Value: Supports assessment of gene knockout impact on TGF-beta sensitivity, informing mechanistic de-risking of immunotherapy candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates knockout NK cells suitable for functional assays, including cytotoxicity and gene expression analysis via RT-PCR and flow cytometry.
- Operational Value: Enables standardized preparation of edited NK cells using defined electroporation parameters (EN138 program) for reproducible transduction efficiency.
- Scalability: Supports post-electroporation expansion using irradiated mbIL21-expressing feeder cells, facilitating scale-up for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Produces TGFBR2-deficient NK cells with reduced sensitivity to TGF-beta, modeling immune escape mechanisms in solid and brain tumors.
- Preclinical Continuity: Allows co-culture with tumor cell lines (e.g., medulloblastoma) to evaluate functional resistance to immunosuppressive cytokines.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of gene-edited NK cell persistence and function after modification, supporting go/no-go decisions in immunotherapy development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation through gene knockout, enabling screening-ready cell products, and informing preclinical assessment of immunomodulatory resistance.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of gene roles in NK cell effector function, particularly in TGF-beta-mediated immune suppression pathways.
- Screening: Generates assay-ready NK cells with quantifiable outputs (viability, transduction efficiency, gene expression) for compound or condition comparison.
- Analytics: Delivers measurable endpoints including mRNA reduction (60% for TGFBR2), viability rates, and cytotoxicity shifts for data-driven decision making.
- Translational Research: Connects genetic modification to functional outcomes in tumor co-culture models, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for NK cell editing that can be applied across multiple genetic targets and therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling efficient, DNA-free knockout in primary human NK cells.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through defined electroporation conditions and feeder cell-based expansion.
- Strategic Value: Reduces biological risk in NK cell therapy development by clarifying gene function and immune escape mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunotherapy targets through mechanistic de-risking of TGF-beta resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary NK cell isolation, culture, and electroporation techniques.
- Dependent on access to Nucleofector 4D system, Cas9 protein, and synthetic guide RNAs.
- Necessitates standardization of guide RNA design and validation across targets to ensure editing efficiency.
- Involves optimization of cell-to-complex ratios and incubation timing for RNP formation and delivery.
- Limited by primary NK cell donor variability and expansion potential post-electroporation.
