Name: Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a generar células NK humanas knockout mediante ribonucleoproteínas Cas9. Este protocolo permite modificar genes como TGFBR2 con alta eficiencia para investigar biología de células NK y potenciar inmunoterapia contra tumores sólidos.

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Reconocemos Brian Tullius para su ayuda en editar el manuscrito.

Buffy coats de donante sano se obtuvieron como material de la Central Ohio región Cruz Roja Americana. Esta investigación fue determinada para ser exento Investigación Hospital institucional Informe Junta de todo el país de los niños.
1. expansión y purificación de células NK humano
<ol><li>Aislante PBMCs de la capa anteada12.<ol>
<li>Capa de 35 mL de muestra de la capa anteada en 15 mL de Ficoll-Paque.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 20 minutos sin freno y recopilar la PBMC de la interfaz.</li>
		<li>Lavar las PBMCs recuperados tres veces mediante la adición de por lo menos un volumen igual de PBS, centrifugar a 400 x g durante 5 minutos y aspirando la PBC lavan. Células NK pueden ser aislado en esta etapa por el RosettesSep13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expandir las células NK mediante la estimulación con irradiado 10 x 106 mbIL21-expresar las células de alimentador a los 0, 7 y 14 días. Sustituir los medios de comunicación con fresco RPMI con 10% FBS, 1% glutamina, 1% penicilina estreptomicina y 100 UI/mL de IL-2 para el volumen de los medios de comunicación todo cada día.</li>
</ol>2. gRNA diseño y selección
<ol><li>Elegir los loci genómicos específicos a destino, utilizando herramientas en línea, por ejemplo, NCBI, conjunto. Ejemplo. Descripción: Transformación del receptor del factor de crecimiento beta 2 (TGFBRR2) ectodominio Ver registro: PF08917 Ver InterPro: IPR015013 Posición: 49-157 aa Secuencia específica: Exón 4 del gen TGFBR2 (ENSG00000163513)</li>
	<li>Para diseñar los gRNAs, herramientas CRISPR diseño web tales como http://crispr.mit.edu y 'Benchling.'<ol>
<li>Entrar en la secuencia del ADN elegida en el paso 2.1. Elegir a humanos (hg 19) como un genoma de destino. Guías de CRISPR (20 nucleótidos seguido de una secuencia de PAM: NGG) sea sometido a análisis de la secuencia entrada antes. También se muestra a posibles coincidencias de objetivo por todo el genoma seleccionado.</li>
		<li>Elegir el mejor tres gRNAs que tienen el puntaje más alto, basado en sus tasas en meta y objetivo. Por ejemplo, la tabla 1 muestra los RNAs CRISPR diseñado a exón 4 del gen TGFBR2 sugerido por herramientas de CRISPR diseño web.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orden de los RNAs CRISPR como crRNAs sintético de secuencia-específica.</li>
	<li>Orden conservado, transactivating RNA (tracrRNA) para interactuar a través de la homología parcial con el crRNA.</li>
</ol>3. diseño eliminación cartillas de evaluación
<ol><li>Diseño de primers que abarca los sitios de clivaje gRNA para ensayo de mutación de T7E1.</li>
	<li>Bp de cartillas al menos 100 uso del sitio de la hendidura prevista para asegurar la inserción-deleción pequeña (indels) en el sitio de destino sgRNA aparecerá en gel de agarosa al 1,5% siguiendo el ensayo de mutación. La tabla 2 muestra los iniciadores que se utilizan para amplificar el ectodominio de TGFBR2.</li>
</ol>4. transducción de las células NK humanas de primaria y ampliado
Nota: Transducción de Cas9/RNPs elementos en NK realiza electroporación con sistema 4D como sigue.
<ol><li>
Célula Preparación
	<ol>
<li>
Para las células NK primarias, incubar células NK recién aisladas en Medio RPMI en presencia de 100 UI/mL de IL-2 por 4 días y realizar la electroporación en día 5. Sustituir los medios de comunicación todos los días como se describe anteriormente y el día antes de transducción de señales.</li>
		<li>
Para las células NK expandidas, estimular las células en el día 0 con células de alimentador irradiados en una proporción de 1:1 y realizar la electroporación en día 5 o 6 o 7. Sustituir los medios de comunicación todos los días como se describe anteriormente y el día antes de transducción de señales.</li>
		<li>En el día de la electroporación, preparar un matraz T25 con 8 mL de RPMI fresco que contiene 100 UI/mL de IL-2 para las células que experimentaban la electroporación y frascos incubate previamente en un humidificado 37 ° C y 5% CO2 la incubadora. Nota: Las células descongeladas o células que han sufrido 2nd o 3rd estimulación pueden ser electroporated en cualquier momento después de su recuperación como se describe.</li>
		<li>Tomar 3-4 x 106 células por condición para 26 μl de mezcla de transducción de señales. Nota: Muy alta concentración de las células NK en la solución de electroporación mejora la tasa de transducción de señales.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con PBS para eliminar todos los FBS, que comúnmente contiene actividad Rnasa. Los hace girar cada vez a 300 x g durante 8 minutos. Nota: Tener en cuenta 7 condiciones de electroporación para Cas/RNPs como una gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) y una combinación de dos gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 gRNA3, gRNA2 + gRNA3) y un control con ningún Cas9/RNPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formar el crRNA:tracerRNA / complejo
	<ol>
<li>Resuspender el crRNAs (gRNA1, gRNA2 y gRNA3) y tracerRNA en solución a concentraciones finales de 200 μM de TE 1 x. 2.2 mezcla μL de cada gRNA 200 μM con 200 μM tracerRNA como se muestra en la tabla 3.</li>
		<li>Calentar las muestras a 95 ° C por 5 min y dejar para enfriar sobre la mesa a temperatura ambiente (15-25 ° C). Tienda resuspendió RNAs y crRNA: tracerRNA/complejo a-20 ° C para su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formar el complejo RNP Nota: para ahorrar tiempo, forman el compleja durante el lavado la RNP paso 4.1.5.
	<ol>
<li>Para crRNA:tracrRNA solo duplex reacción, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μM como se muestra en el ejemplo en la tabla 4.</li>
		<li>Para la transducción de la combinación de crRNA:tracrRNA dúplex, diluir Cas9 endonucleasa a 36 μM como se muestra en el ejemplo de tabla 5.
</li>
		<li>Añadir Cas9 endonucleasa a crRNA:tracrRNA dúplex lentamente mientras el remolino la punta de la pipeta, más de 30 s a 1 minuto.</li>
		<li>Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Si no está listo para utilizar la mezcla después de la incubación, mantenga la mezcla en hielo hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporación
	<ol>
<li>Añadir el suplemento entero a la solución de electroporación P3 y mantenerlo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células (3-4 x 106 células de paso 4.1.5) en 20 μL de solución de electroporación de D 4 primaria P3. Evitar las burbujas de aire mientras el pipeteo. Nota: las celdas no deben dejarse durante mucho tiempo en la solución de P3.</li>
		<li>Inmediatamente añadir 5 μl de complejo RNP (paso 4.3) a la suspensión de células.</li>
		<li>Añadir 1 μL de 100 μM Cas9 electroporación el reforzador a la Cas9/RNPs/celda de la mezcla.</li>
		<li>Transferencia de mezcla Cas9/RNPs/cell en tiras de electroporación de 20 μL.</li>
		<li>Golpee suavemente las tiras para asegurarse de que la muestra cubre la parte inferior de las tiras.</li>
		<li>Iniciar sistema de electroporación de 4D y elegir el programa EN-138 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. post transducción
<ol><li>Que las células descansar durante 3 minutos en las tiras.</li>
	<li>Añadir 80 μl de los medios de cultivo previamente equilibrado a la cubeta y suavemente, transferir la muestra en matraces.</li>
	<li>48 horas después de la transducción de señales, extraer la DNA de genomic de 5 × 105 células para las canceladuras del gene de detección.</li>
	<li>Amplificar el gen de interés utilizando los cebadores diseñados en el paso 3.2 con kits de Taq ADN polimerasa.</li>
	<li>Forma de heterodúplex de amplicones PCR para la digestión T7EI e incubar el producto durante 30-60 minutos con una enzima T7EI en 37 ° C. Nota: El T7EI es preferido para la detección es rápida, simple y proporciona limpiar resultados de electroforesis en comparación con el ensayo de topógrafo. Sin embargo, este método no puede detectar inserciones y canceladuras de < 2 bases que son generados por no homóloga se terminan uniendo actividad (NHEJ) Cas9 RNPs experimentos14.</li>
	<li>Ejecutar el ADN digerido en 1.5% gel de agarosa a 110 V de 30-45 minutos, cada 15 minutos visualizar el gel.</li>
	<li>Estimular el resto de las células con expresión de mbIL21 células de alimentador en una proporción de 1:1.</li>
	<li>Cinco días después de la estimulación extraer el ARN para el nivel de expresión génica utilizando qPCR.</li>
	<li>Ensayos de conducta calceína según lo divulgado previamente12. Brevemente, cargar las células de la blanco con calceína AM (en el ejemplo mostrado, se utilizó las células DAOY de 3 μg/mL/1.000.000). Preparar las células de NK para los ensayos de citotoxicidad por descansar durante la noche en IL2 (100 UI/mL) más o menos 10 ng/mL solubilidad TGFβ. Realizar ensayos de calceína en las mismas citoquinas como las células NK se descansaban en la noche a la mañana.</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
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<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition%2C+preparation%2C+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL sirve ha servido como consultor para Courier Therapeutics, terapéutica de obsidiana, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories y Miltenyi Biotec y tiene participación, liderazgo en la terapéutica de CytoSen.

Modificación de ADN-dependiente de las células NK ha sido desafiante4,9. Nosotros, por lo tanto, introduce directamente un complejo de ribonucleoproteína sintéticamente preformado (RNPs) y proteína Cas9 como purificado de la proteína primaria y ampliado de las células NK8. Este método nos permitió eliminar el recubrimiento de jales, y otros procesos transcripcionales y traduccional Iniciado por ARN polimerasa II, que puede causar apoptosis...

Inmunoterapia de cáncer se ha avanzado en los últimos años. Las células T antígeno quimérico genéticamente del receptor (coche) son un excelente ejemplo de ingeniería células inmunes desplegado en inmunoterapia del cáncer. Estas células fueron recientemente aprobadas por la FDA para el tratamiento contra CD19 + B de células malignas, pero éxito hasta el momento se ha limitado a enfermedades teniendo unos antígenos targetable y dirigidas a tal limitado repertorio antigénico son propensa al fracaso por escape inmune. Además, las células de T del coche se han enfocado en el uso de células de T autólogas debido al riesgo de enfermedad injerto contra – host causado por células T trasplante allogeneic. En contraste, las células NK son capaces de matar a objetivos de tumor de manera independiente del antígeno y no causan Eich, que hace un buen candidato para cáncer inmunoterapia6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnología ha sido utilizada recientemente en células inmunes ingeniería y reprogramar genéticamente las células NK con los plásmidos ha sido siempre un reto. Esto ha sido debido a las dificultades en la entrega del transgen de una manera dependiente de ADN como transducción retroviral y lentivirales causando sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células y la producción limitada de ingeniería genética de las células NK4 , 9.
Muchas células inmunes innatas expresan altos niveles de receptores para patrones moleculares asociados a patógenos como gen inducible por ácido retinoico me (RIG-I), que permiten una mayor reconocimiento de ADN extraño. Supresión de estas vías ha permitido una mayor eficiencia de transducción en las células NK al utilizar métodos basados en DNA para la modificación genética10.
Aquí describimos el método para el uso de un genoma de ADN libre edición de primarias y expansión humana las células NK utilizando complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs se compone de tres componentes, recombinante proteína Cas9 complexed con sintético RNA solo guía conformada por un complejo crRNA y tracerRNA. Estos Cas9/RNPs son capaces de unirse genómicas objetivos con mayor eficiencia en comparación con los enfoques de ADN-dependiente extranjeras debido a su entrega como complejos funcionales. Además, separación rápida de Cas9/RNPs de las células puede reducir los efectos off-target como inducción de la apoptosis. Por lo tanto, puede utilizarse para generar knock-out o knock-ins cuando se combina con el ADN por recombinación homóloga6,7. Demostramos que la electroporación de Cas9/RNPs es un método fácil y relativamente eficiente que supera las limitaciones anteriores de modificación genética en las células NK.
TGFβ es una citocina inmunosupresora importante, que inhibe la activación y funciones de las células NK. Se ha sugerido que dirigidas a la vía TGFβ pueden aumentar las funciones inmunes celulares. Hemos dirigido la región codificación ectodominio TGBR2 que une TGFβ11. Resultados representativos muestran una disminución significativa en el nivel de expresión del mRNA de este gen y además demuestran que las células NK modificadas volverse resistentes a los TGFβ. Además, las células modificadas retienen la viabilidad y potencial proliferativo, son capaces de ser post-electroporación ampliada utilizando células de alimentador irradiados. Por lo tanto, el método siguiente es un enfoque prometedor para manipular genéticamente las células de NK para cualquiera más clínico o con fines de investigación.

<table><tbody><tr><td>RosetaSep&comercio; Cóctel de enriquecimiento de células NK humanas</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15065</td><td>La rosetaSep&trade; El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas está diseñado para aislar células NK de la sangre total mediante selección negativa.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque&reg; PLUS</td><td>GE Healthcare - Ciencias de la Vida</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Las tecnologías integradas de ADN de CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td></td><td>1072532</td><td>TracrRNA que contiene modificaciones químicas patentadas que confieren una mayor resistencia a la nucleasa. Se hibrida a crRNA para activar la enzima Cas9</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>Producidas sintéticamente como Alt-R&reg; CRISPR-Cas9 crRNA, basado en la secuencia de ARNg diseñado dirigido al gen de intrest</td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Kit de detección de edición genómica</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>1075931</td><td>Cada kit contiene endonucleasa T7EI, tampón de reacción T7EI y controles de ensayo T7EI.</td></tr><tr><td>Platino&reg; Taq ADN Polimerasa Alta Fidelidad</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; Sistema</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IL-2 recombinante humana</td><td>Novartis</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3 Célula primaria 4D-Nucleofector&comercio; X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>Contiene pmaxGFP&trade; Vector, Nucleofector&comercio; Solución, Suplemento, Nucleocuvette de 16 pocillos&trade; Tiras</td></tr><tr><td>no objetivo: siRNA personalizado, estándar 0.05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nucleasa 3NLS</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nucleasa</td></tr><tr><td>DNeasy&reg; Sangre & Manual de pañuelos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Kit de control CRISPR-Cas9,</td><td>tecnologías de ADN integrado</td> humano <td>1072554</td><td>incluye tracrRNA, crRNA de control positivo HPRT, crRNA #1 de control negativo, mezcla de cebadores HPRT y tampón dúplex sin nucleasas.</td></tr><tr><td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; Cas9 Potenciador de Electroporación</td><td>Tecnologías de ADN Integradas</td><td>1075915</td><td>Cas9 Potenciador de Electroporación</td></tr></tbody></table>

generación de células nk humano primario y ampliado de knock-out utilizando ribonucleoproteínas cas9

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 tecnología está acelerando ingeniería del genoma en muchos tipos celulares, pero hasta el momento, genes y modificación genética estable han sido difíciles en primarias células de NK. Por ejemplo, entrega de transgenes mediante transducción retroviral o lentivirales dio lugar a una producción limitada de ingeniería genética de las células NK por sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células. Aquí describimos un método libre de ADN para la edición del genoma de humanos primarias y ampliadas las células NK mediante complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permite eficiente nocaut del TGFBR2 y HPRT1 genes en las células NK. Datos de RT-PCR demostraron una disminución significativa en el nivel de expresión del gen, y un ensayo de citotoxicidad de un producto representativo de la célula sugiere que las células NK modificado de RNP se hizo menos sensibles a TGFβ. Células genéticamente modificadas podrían ser ampliada post-electroporación por estimulación con mbIL21-expresando irradiado células de alimentador.

Eficiencia de electroporación
Para optimizar la electroporación de Cas9/RNPs, probamos 16 programas diferentes con transducción de siRNA dirigidas no a GFP y plásmido de ADN en las células NK. Análisis de citometría de flujo mostraron que los EN-138 tenía el mayor porcentaje de viabilidad y transducción de la eficiencia de las células (células GFP vivo positivo de 35%) para ambas partículas (fi...

Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular NK sobre el papel y la función de genes y vías específicos que regulan la función de las células efectoras. La principal ventaja de esta técnica es su alta tasa de éxito en comparación con los enfoques dependientes del ADN, lo que permite un knockout altamente eficiente de uno de los genes clínicamente más relevantes en la terapia con células NK. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia de tumores sólidos y tumores cerebrales que expresan TGF-beta como medio de escape inmunológico.Para la transducción primaria de células NK, incubar tres veces 10 a las cinco células NK recién aisladas por mililitro de medio RPMI suplementado con 100 UI por mililitro de IL2 por matraz T75 durante cuatro días reemplazando el medio cada dos días y el día antes de la transducción. Para la transducción de células NK ampliadas, estimule las células NK primarias en el día cero con células alimentadoras K562 que expresen IL21 unidas a la membrana radiadas en una proporción de uno a uno, reemplazando el medio cada dos días y el día antes de la transducción. El día de la electroporación, llene

generation-knock-out-primary-expanded-human-nk-cells-using-cas9

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica para la modificación genética mediada por la ribonucleoproteína Cas9 de células asesinas naturales primarias (NK). Una ribonucleoproteína Cas9, que consiste en una endonucleasa Cas9 unida a un ARN guía (ARNg) formado por el emparejamiento de bases de un ARN CRISPR (ARNcr) y un ARNc transactivador (ARNtrac), se introduce en las células asesinas naturales primarias mediante electroporación. La ribonucleoproteína se dirige y escinde el ADN del huésped en el sitio...

Una técnica para la edición de genes en células asesinas naturales utilizando CRISPR Cas9

Las herramientas de edición del genoma, como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated), han mejorado en gran medida la eficiencia de la selección de genes en células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Este manuscrito describe un protocolo para generar un indicador de hiPSC específico del linaje utilizando la recombinación homóloga asistida por el sistema CRISPR/Cas.

Generación eficiente de hiPSC Neuronales Lineage Reporteros Knockin concreto utilizando la CRISPR / Cas9 y Cas9 Doble Sistema Nickase

Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Hemos desarrollado un protocolo simple y económico para cargar complejos de ribonucleoproteína Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) dentro de partículas similares a virus. Estas partículas, llamadas "Nanoblades", permiten la entrega eficiente del complejo Cas9/sgRNA en células inmortalizadas y primarias, así como in vivo.

Entrega del complejo de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA en células inmortalizadas y primarias a través de partículas similares a virus ("nanocuchillas")

Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

El protocolo describe cómo generar mioblastos knock-out utilizando CRISPR/Cas9, desde el diseño de arneses guía hasta la clonación celular y caracterización de los clones knock-out.

Desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus

A medida que los protocolos relacionados con CRISPR se vuelven cada vez más útiles y accesibles, aún pueden surgir complicaciones y obstáculos en condiciones experimentales específicas. Este protocolo describe la creación de una línea celular humana knockout de serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK1/RIP1) que interactúa con el receptor utilizando CRISPR/Cas9 y destaca los posibles desafíos encontrados durante este proceso.

Generación de una línea celular RIP1 knockout U937 utilizando el sistema CRISPR-Cas9

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Aprende a generar células NK humanas knockout mediante ribonucleoproteínas Cas9. Este protocolo permite modificar genes como TGFBR2 con alta eficiencia para investigar biología de células NK y potenciar inmunoterapia contra tumores sólidos.

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

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