Caracterización de microbioma marca Next-Generation 16S rRNA Amplicon ordenando

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología de enfermedades transmitidas por vectores, como por ejemplo, ¿qué papel desempeña el microbioma vectorial en la dinámica de los patógenos y cómo se forman y varían los microbiomas vectoriales? Las principales ventajas de esta técnica son que permite una alta replicación y una alta resolución e identificación, lo que permite al usuario caracterizar con precisión el microbioma vectorial en diferentes condiciones ecológicas y ambientales. La demostración visual de este método es importante, ya que los pasos de configuración de la secuenciación del microbioma son difíciles de aprender, y hay muchos productos y técnicas diferentes disponibles, pero pocos recursos disponibles para aprender estos pasos.

Comience este procedimiento con la recolección de garrapatas, como se describe en el protocolo de texto. Para eliminar los contaminantes de la superficie de las garrapatas, agregue 500 microlitros de peróxido de hidrógeno y vórtice durante 15 segundos. Repita este lavado con etanol al 70% y luego agua destilada dos veces.

Coloque las garrapatas en un nuevo tubo de PCR y deje que se sequen al aire. En este tubo, rompe mecánicamente los tejidos de las garrapatas aplastándolas con un mortero. Purifique el ADN de garrapatas individuales, siguiendo las instrucciones proporcionadas en un kit de extracción de ADN disponible comercialmente.

Eluir hasta un volumen final de 100 microlitros. La creación de un control negativo en la etapa de extracción es fundamental para diferenciar posteriormente los contaminantes sospechosos de los verdaderos microbios vectores. También es necesario utilizar una técnica estéril durante la etapa de extracción y las etapas posteriores de PCR para minimizar el impacto de la contaminación común en la secuenciación 16S.

Configure la PCR del amplicón en una reacción de 27,5 microlitros que contenga cinco microlitros de cada cebador en un micromolar y 12,5 microlitros de mezcla de PCR disponible en el mercado. También incluye cinco microlitros de ADN extraído de garrapatas individuales a una concentración de cinco nanogramos por microlitro. Mueva los tubos a un termociclador y ejecute el programa enumerado en el protocolo de texto.

Una vez realizada la PCR, visualice el producto de PCR cargando de cuatro a seis microlitros por muestra en un gel de agarosa al 1,5%. Busque una banda en 460 pares de bases para confirmar la amplificación. Utilizando un nuevo tubo de PCR para cada muestra, combine el producto de PCR con agua bidestilada para obtener un total de 60 microlitros.

En el caso de muestras con bajas concentraciones de ADN, realice una PCR con amplicón por triplicado para reducir el sesgo de amplificación y agrupe las muestras para concentrarlas. Lleve las perlas paramagnéticas a temperatura ambiente y vértice bien antes de usarlas. Añadir 48 microlitros de perlas paramagnéticas a 60 microlitros de la muestra e incubar durante cinco minutos.

Coloque los tubos en una rejilla magnética durante cinco minutos hasta que la solución se vuelva clara. A continuación, retira el sobrenadante. Con los tubos en la rejilla magnética, agregue 500 microlitros de etanol al 80% recién preparado.

Inmediatamente después de agregar etanol a todos los tubos, pipetear el líquido, no retire las perlas. Repita la adición y eliminación de etanol una vez más. Seque las muestras al aire para eliminar el exceso de etanol dejando los tubos abiertos en la rejilla magnética durante cinco minutos o hasta que se vean pequeñas grietas en las perlas.

Ahora, agregue 20 microlitros de tampón TE e incube las muestras del imán a temperatura ambiente. Después de cinco a 10 minutos, vuelva a colocar los tubos en el imán. Una vez que las perlas y el líquido estén separados, transfiera los sobrenadantes a un tubo nuevo para obtener el producto PCR limpio.

Asigne combinaciones de cebadores únicas a cada muestra, seleccionando cebadores directos o inversos, o ambos, de un kit de índices de biblioteca disponible en el mercado. Para adjuntar los cebadores o índices duales a las muestras, prepare una reacción de PCR que contenga 2,5 microlitros de cada cebador, 12,5 microlitros de mezcla maestra de PCR disponible comercialmente, cinco microlitros de agua destilada doble y 2,5 microlitros de producto de amplicón limpio. Mueva los tubos a un termociclador programado como se detalla en el protocolo de texto.

Una vez realizada la PCR, visualice el producto de PCR cargando de cuatro a seis microlitros por muestra en un gel de agarosa al 1,5%. Busque una banda en 550 pares de bases para confirmar la amplificación antes de realizar el procedimiento de limpieza como antes. Para realizar una cuantificación precisa de cada producto purificado con código de barras, ejecute qPCR en cada muestra y estándar por triplicado, y ejecute cada muestra a tres o más niveles de dilución.

Prepare 10 reacciones de qPCR de 10 microlitros que contengan seis microlitros de qPCR Master Mix, dos microlitros de agua bidestilada y dos microlitros de la muestra o patrón. Mueva la placa de qPCR a un instrumento de PCR en tiempo real programado como se describe en el protocolo de texto y realice la ejecución. Después de la cuantificación, cree la biblioteca combinada agregando volúmenes iguales de todas las bibliotecas individuales en un solo tubo.

Después de diluir y desnaturalizar la biblioteca combinada y el control de secuenciación, cargue la mezcla combinada en la celda de flujo de secuenciación. Limpie a fondo la celda de flujo antes de cargarla para obtener una óptica óptima. A continuación, cargue la celda de flujo en el secuenciador y realice el análisis de la secuencia de amplicones.

Aquí se muestran las curvas de rarefacción para la normalización del recuento de secuencias. Estas curvas indican que el cifrado a 2000 secuencias por muestra debería ser suficiente para capturar la diversidad completa de las unidades taxonómicas operacionales observadas. Después de enrarecer y filtrar la calidad de las lecturas de secuencia, se realiza la salida de diversidad alfa y beta.

Aquí se muestra un gráfico de análisis de coordenadas principales generado automáticamente que muestra cómo difiere la composición del microbioma de las garrapatas según el tratamiento. Además, la visualización de los microbios presentes dentro de cada muestra, que se muestra aquí a nivel de filo, se crea automáticamente para todas las muestras. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener una técnica estéril para minimizar el efecto de la contaminación microbiana que puede afectar críticamente la interpretación de los datos de la secuencia.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción histológica, para responder a preguntas adicionales como, ¿dónde se encuentran los microbios observados dentro del vector? Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ecología molecular exploraran el papel de las interacciones microbianas dentro del vector e investigaran cómo esto puede afectar la transmisión de patógenos.