Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus
27 de septiembre de 2018
Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del sistema, como el mecanismo de regulación detrás de la red mitótica y las propiedades y funciones dinámicas del reloj del ciclo celular. La principal ventaja de esta técnica es que generará una gran cantidad de gotas con múltiples ciclos celulares en cada una, proporcionándonos un marco de alto rendimiento para la manipulación y análisis cuantitativo. Para empezar, deseche lotes de huevos que tengan límites poco claros entre los polos animales y vegetales o manchas blancas irregulares en la parte superior de los postes de animales.
A continuación, seleccione un lote apropiado de huevos de una rana hembra y transfiera los huevos a un vaso de precipitados de 600 mililitros. Vierta un exceso de tampón MMR 0.2x, y agregue suavemente cisteína en tampón de extracto 1x a los huevos. Después de esto, agitar el vaso vigorosamente a mano para eliminar las capas de gelatina de los huevos.
Repita este lavado tres veces con un total de 800 mililitros de tampones de cisteína o hasta que los huevos se agreguen y se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados. Después de retirar la capa de jalea, lave los huevos cuatro veces en un litro de solución 0.2x MMR. Use una pipeta de vidrio para recoger y desechar los huevos que se vuelven blancos.
Vierta el tampón MMR fuera del vaso de precipitados y agregue 200 mililitros de solución de ionóforo de calcio en los huevos. Use una pipeta de vidrio para agitar los huevos suavemente hasta que se activen y retire la solución de ionóforo de calcio. Dejar los huevos en solución de ionóforo de calcio durante demasiado tiempo iniciará la apoptosis.
Remuevemos los huevos durante 1,5 minutos y comprobamos la eficiencia de activación. Si no están activados, reanude la agitación y compruebe con más frecuencia hasta que se logre una activación del 90%. Después de que los huevos se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados, compruebe la eficiencia de activación.
Los huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal. A continuación, lavar los huevos dos veces con un volumen total de 50 mililitros de tampón de extracto complementado con inhibidores de la proteasa. Luego, transfiera cuidadosamente los huevos a un microtubo de tapa de presión de 0,4 mililitros.
Centrifugar el microtubo durante 60 segundos a 200 g y luego a 600 g durante 30 segundos para empacar los huevos. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para eliminar el exceso de tampón en la parte superior de los huevos después de cada paso. Después de esto, tritura los huevos a 15.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Usa una cuchilla de afeitar para cortar los tubos para separar las tres capas de huevos triturados y mantener el citoplasma crudo en la capa media. A continuación, transfiera el citoplasma crudo para limpiar los tubos de ultracentrífuga. Complementar el citoplasma con inhibidores de la proteasa y citocaplasina B a 10 microgramos por mililitro cada uno.
Centrifugar el citoplasma crudo a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, usa una cuchilla de afeitar para cortar el tubo y mantener el citoplasma en la capa media. Coloque los extractos recién preparados sobre hielo.
En primer lugar, agregue el ARNm securin-mCherry a los extractos preparados. A continuación, añada 200 microlitros de 2%fluorosurfactante PFPE-PEG a la mezcla de ARNm de extracto. Utilice un mezclador de vórtice para generar gotas, ajustando la velocidad del vórtice y la duración según sea necesario.
A continuación, inspeccione visualmente las gotas para asegurarse de que son uniformes en tamaño. Usando una pipeta de 200 microlitros, transfiera las gotas flotando en la parte superior y un volumen igual de surfactante a un tubo pcR. Sumerja un tubo de vidrio en la capa de gotas y espere hasta que las gotas llenen aproximadamente el 75% del tubo.
A continuación, empuje el tubo en la capa de surfactante, y llene el tubo por completo. A continuación, llene un plato con fondo de cristal con aceite mineral. Luego, usa pinzas finas para sumergir el tubo lleno de gotas en el aceite.
Utilice una pipeta de vidrio para eliminar los restos visibles o las gotas con fugas. Para evitar el movimiento y la fuga de gotas, el tubo de vidrio lleno de gotas debe sumergirse debajo del aceite mineral con cuidado. Podemos empujar el tubo en ambos extremos con equilibrio o añadir unas gotas de aceite mineral en los extremos del tubo simultáneamente primero.
Después de esto, utilice un microscopio de epifluorescencia equipado con una etapa xy motorizada para tomar imágenes de las gotas. Graba vídeos de lapso de tiempo en el campo brillante y múltiples canales de fluorescencia cada seis a nueve minutos hasta que las gotas pierdan su actividad. Usando este protocolo, se produjo una oscilación mitótica tanto en células simples y libres de energía nuclear como en células complicadas con núcleos.
Las gotas libres de núcleos generaron oscilación mitótica de hasta 30 ciclos sin amortiguar durante 92 horas. También se examinó la capacidad del oscilador mitótico para conducir eventos mitóticos aguas abajo. El oscilador mitótico autosostenido impulsó los cambios de morfología nuclear observados a través de la alteración autónoma de distintas fases del ciclo celular.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener en cuenta el momento en que se hace el extracto, ya que es sensible al tiempo, y siempre mantener los huevos y extraer en hielo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del sistema exploraran los principios fundamentales de las propiedades complejas del reloj, como la tunabilidad y la estocástica en Xenopus laevis.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para generar oscilaciones mitóticas autosostenidas in vitro a nivel de célula individual, utilizando extractos de huevo de Xenopus laevis encapsulados en microemulsiones de agua-en-aceite. Esta técnica tiene como objetivo mejorar nuestra comprensión de la red mitótica y de la dinámica del ciclo celular.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Biología de sistemas
- Biofísica
Antecedentes
- Comprender los mecanismos que regulan la red mitótica es fundamental.
- Los relojes del ciclo celular desempeñan un papel importante en los procesos celulares.
- Se necesitan técnicas de alto rendimiento para el análisis cuantitativo.
- Los huevos de Xenopus laevis proporcionan un modelo para estudiar estos procesos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para generar oscilaciones mitóticas in vitro.
- Facilitar el análisis de alto rendimiento de la dinámica del ciclo celular.
- Explorar los mecanismos reguladores de la red mitótica.
Métodos Utilizados
- Encapsulación de extractos de óvulos de Xenopus laevis en microemulsiones.
- Preparación de óvulos mediante la eliminación de las capas de gelatina.
- Uso de tampón 0.2x MMR y cisteína en el proceso de extracción.
- Agitación enérgica para garantizar una adecuada extracción y encapsulación.
Resultados principales
- Generación exitosa de gotas con múltiples ciclos celulares.
- Establecimiento de un marco de alto rendimiento para el análisis.
- Obtención de conocimientos sobre las propiedades dinámicas del reloj del ciclo celular.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de la regulación del ciclo celular.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque novedoso para estudiar las oscilaciones mitóticas.
- Permite la manipulación y el análisis cuantitativos de los ciclos celulares.
- Investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para explorar la biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este sistema de célula artificial basado en gotas permite el análisis de alta capacidad con resolución a nivel de célula individual de las oscilaciones mitóticas, abordando una limitación clave de los ensayos con extractos en masa que sufren desincronización y señales amortiguadas. Al mantener las oscilaciones durante más de 30 ciclos en compartimentos de extracto de huevo de Xenopus laevis, el método proporciona una plataforma reproducible para la manipulación cuantitativa de la dinámica del ciclo celular. Esto facilita la validación de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento, al vincular la función del oscilador con eventos mitóticos posteriores, como la dinámica de la envoltura nuclear y la condensación cromosómica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la actividad del oscilador mitótico con lecturas fenotípicas descendentes en un sistema controlado y ajustable.
- Valor operativo: Proporciona oscilaciones sostenidas y sincrónicas en miles de gotas, reduciendo el ruido y aumentando el poder estadístico en estudios de interacción con el blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia multicanal de osciladores y procesos descendentes, lo que permite la estandarización de ensayos para la selección de compuestos.
- Valor operativo: Permite formatos basados en gotas escalables, compatibles con la automatización y el monitoreo en tiempo real de perturbaciones del ciclo celular.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la fidelidad del sistema relevante para la enfermedad al reproducir los ciclos de ensamblaje y desensamblaje nucleares, lo que permite alinear biomarcadores con la progresión mitótica.
- Valor operativo: Facilita la continuidad preclínica al permitir el seguimiento longitudinal de la función del oscilador y de los eventos mitóticos en compartimentos individuales.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar una lectura cuantitativa y escalable de la función del oscilador mitótico que orienta las decisiones de identificación de compuestos prometedores y avance preclínico mediante datos dinámicos con resolución a nivel de célula individual.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la correlación en tiempo real entre la fase del oscilador y los cambios en la morfología nuclear.
- Selección: Ofrece sistemas listos para ensayos, reproducibles y con una producción oscilatoria sostenida, adecuados para la selección de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona mediciones de parámetros múltiples y con registro temporal de la amplitud, el período y la sincronía del oscilador, para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante la reproducción fiel de los eventos mitóticos posteriores al oscilador.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma microfluídica reutilizable para la optimización iterativa de compuestos que modulan el ciclo celular en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al desacoplar el comportamiento del oscilador a nivel de célula individual de los artefactos derivados del promedio poblacional.
- Valor operativo: Permite la estandarización y la reproducibilidad mediante la uniformidad de las gotas y la composición controlada del extracto.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto al vincular la modulación del objetivo con salidas fenotípicas dinámicas en un formato de alto rendimiento.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante la cuantificación de los efectos del compuesto sobre la estabilidad del oscilador y la progresión mitótica subsiguiente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de extractos de óvulos de Xenopus y en la generación de gotas microfluídicas.
- Depende del acceso a mezcladores vortex, microscopios de fluorescencia con platina motorizada y capacidades de imagen multicanal.
- Necesita la estandarización de la calidad del extracto y de las concentraciones de surfactantes entre lotes para lograr oscilaciones consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación al incorporar núcleos u otros componentes subcelulares para modelar una mayor complejidad.
- Está limitado por la naturaleza sensible al tiempo de la actividad del extracto y por la necesidad de mantener las muestras en hielo para preservar su función.
