Name: Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprende a reconstituir oscilaciones mitóticas en microemulsiones de extractos de huevo de Xenopus laevis. Este método permite el análisis de alta capacidad de la dinámica del ciclo celular y las propiedades del reloj mitótico.

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Agradecemos a Madeleine Lu para construir mCherry securin plásmido, vuelta hombre Lee, Kenneth Ho y Allen P Liu para los debates sobre la generación de gotas, Jeremy B. Chang y James E. Ferrell Jr para proporcionar la que construcción de GFP-NLS. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (carrera temprana Grant #1553031), los institutos nacionales de salud (MIRA #GM119688) y una beca de investigación de Sloan.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. preparación de materiales para la reconstitución del ciclo celular y detección
<ol><li>
Asamblea de Gibson la clonación para la construcción de ADN de plásmido y purificación de mRNA de mCherry securin
	<ol>
<li>Preparar tres fragmentos de la DNA incluyendo una columna vertebral del vector pMTB2, securin y mCherry mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y gel de purificación21,22.</li>
		<li>Medir las concentraciones de fragmentos mediante un fluorospectrometer. Combinar 100 ng de troncales con securin mCherry inserciones en un 1: relación molecular 1:1 y añadir agua desionizada para ajustar el volumen total de reacción a 5 μl.</li>
		<li>Preparar 6 mL de 5 x buffer de reacción isotérmica de la Asamblea con 3 mL de 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 300 μL de 1 M de MgCl2, 600 μl de dNTP 10 mM, 300 μL de 1 M TDT, 1.5 g de PEG-8000 y 20 mg de NAD23.</li>
		<li>Añadir los fragmentos combinados a 15 μl de 1 Tampón de reacción x Asamblea isotermo alícuota. Incubar la reacción en un tubo de reacción de PCR a 50 ° C durante 15 minutos.</li>
		<li>Hacer una agarosa 0.8% gel y funcionan con una tensión de 10 V/cm para verificar la eficiencia recocida de estos fragmentos.</li>
		<li>Purificar el plásmido construido y eluir con 15 μl de agua libre de ARNasa. Transformar 1 μl del plásmido purificado ADN en 50 μl de competentes DH5α e. coli las células24 para uso futuro.</li>
		<li>Extraer y purificar el plásmido ADN de mCherry securin de los competentes DH5α e. coli las células.</li>
		<li>Transcribir el ADN del plásmido linearizado de mCherry securin en mRNA y purificar el mRNA. Utilice un espectrofotómetro para verificar que la concentración de mRNA es más de 100 ng/μl y la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm es aproximadamente 2.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de demembranated laevis de Xenopus espermatozoides DNA Nota: Adaptado de Murray 19911.<ol>
<li>Eutanasia de adultos machos Xenopus laevis25 y diseccionar los testículos de cuatro ranas macho26,27.</li>
		<li>Coloque los testículos de cuatro ranas en el mismo plato de Petri de 100 mL. Enjuague los testículos tres veces en 50 mL de solución fría 1 x MMR (2 mM KCl, 0.1 M de NaCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA).</li>
		<li>Retire el exceso de sangre y la grasa de los testículos en un plato de petri 100 mL y lavar dos veces en tampón frío preparación nuclear (NPB) (250 mM sacarosa, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8.0, trihydrochloride espermidina de 0,5 mM, 0,2 mM tetrahydrochloride de espermina).</li>
		<li>Elimine el preparación nuclear de tampón (NPB) y trocear los testículos con longitudes inferiores a 0,2 cm con tijeras de disección agudas en un plato de Petri de 100 mL. Añada 8 mL de NPB frío a los testículos para más descomposición.</li>
		<li>Malla de nylon de uso las telas con un tamaño de 70 μm de poro para filtrar los testículos y recoja la muestra de semen en un tubo cónico de 15 mL. Desactivación de los espermatozoides recolectados a 1.730 x g durante 10 minutos a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Fuente de las células de la esperma con 1 mL de NPB y 50 μl de 10 mg/mL lysolecithin e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos de demembranate células de la esperma.</li>
		<li>Lavar el esperma demembranated ADN con 10 mL de NPB frío con la solución de BSA 3% tres veces.</li>
		<li>Medir la densidad de espermatozoides DNA con un hemocitómetro.</li>
		<li>Congelar el esperma de ADN en 5 alícuotas μL en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C. La concentración óptima de DNA de la esperma es aproximadamente 105 núcleos/μl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificación de proteínas de señal de localización Nuclear de GFP (GFP-NLS)
	<ol>
<li>Transformar el plásmido con la GST-etiqueta GFP-NLS BL21 (DE3) competente e. coli las células5.</li>
		<li>Incube las células sin antibióticos a 37 ° C por 1 h y luego en una placa de agarosa LB con ampicilina 100 de μg/mL.</li>
		<li>Incubar la placa a 37 ° C de 14 a 18 horas crecer las células en colonias individuales. Recoger e inocular las colonias individuales en 4 mL de medio LB con ampicilina 100 de μg/mL. Agitar las células a 37 ° C durante 12 horas.</li>
		<li>Preparar la media de YT esterilizado (16 g de Bacto-triptona, 10 g de extracto de Bacto-levadura, 5 g de NaCl) y el calor de la media de YT a 37 ° C.</li>
		<li>Inocular 1 mL de las células incubadas durante la noche en medio LB en 250 mL de medio de YT precalentado con 100 ampicilina μg/mL y agitar durante 2 horas para aumentar la densidad celular.</li>
		<li>Medir la densidad óptica (OD) de celular cada 30 minutos, utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Añadir 0,1 mM IPTG en células para inducir la expresión de la proteína GFP-NLS una vez que el valor de OD alcanza 0,1.</li>
		<li>Agitar las células a 18 ° C durante la noche para reducir la tasa de crecimiento de la célula y permiten la síntesis y la mejor expresión de la proteína.</li>
		<li>Desactivación de las células a 34.524 x g a 4 ° C durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 40 mL de tampón PBS (suministrado con 800 μl de lisozima de 50 mg/mL, 100 μl de PMSF 0,2 M, 13.2 μl de una mezcla de 10 mg/mL de leupeptin, pepstatin y chymostatin y 8 μl de EDTA de 0,5 M) e incubar a 4 ° C durante 20 minutos.</li>
		<li>Romper a las células utilizando un sonicador a una frecuencia de 20 kHz para 4 x 30 s, con 30 intervalos s cada sonicación para liberar expresado proteína GFP-NLS.</li>
		<li>Gira a 20.000 x g durante 35 minutos para eliminar las células rotas.</li>
		<li>Utilizar la cromatografía de afinidad para extraer y purificar la proteína GFP-NLS.</li>
		<li>Lavar la mezcla de grano de 1,5 mL tres veces con 15 mL de tampón PBS e incubar 250 mL de lisado con granos durante 4 horas a 4 ° C con la inversión.</li>
		<li>Desactivación de las cuentas a 2000 x g durante 5 min y añadir 10 mL de solución de lavado 25 mM Tris base, pH 7.5, 500 mM NaCl y 5 mM (TDT) a los granos. Incubar los granos en 700 μl de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 8.8, 20 mM reducida glutatión y 5 mM DTT) con rotación de 4 ° c. Recoge una alícuota de la elución con un volumen de 50 μl.</li>
		<li>Medir la concentración de proteína recogida al ejecutar una de gel azul de Coomassie28.</li>
		<li>Eluir las proteínas utilizando PD-10 columnas con 3 mL de buffer de almacenamiento (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10% glicerol, pH 7.7) a través del intercambio de búfer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de ciclismo Xenopus extractos
Nota: El procedimiento general de preparación de los extractos se ilustra en la figura 1A. Adaptado de Murray 19911.
<ol><li>Se inyectan tres mujer madura Xenopus laevis con IU 66 gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) 10 días antes de la puesta de huevos.</li>
	<li>Se inyectan estas ranas Xenopus con 500 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG) para inducir la ponedora 18 horas antes de la preparación de extractos de ciclismo.</li>
	<li>Descarte de huevos durante la noche. Basado en experimentos (datos no mostrados), extractos preparados a partir de los huevos recién exprimidos generan actividades de mayor duración que extractos preparados a partir de huevos puestos desde la misma rana hembra. Apriete los huevos de cada hembra rana en platos de Petri de 100 mm que contiene 10 mL de tampón de x MMR 0,2 y examinar bajo un microscopio estéreo.</li>
	<li>Deshágase de las tandas de huevos que tienen límites confusos entre animal y vegetal postes o tienen manchas blancas irregulares sobre postes de animal.</li>
	<li>Elegir el lote de huevos de una rana hembra que presenta una población homogénea de huevos con polos de vegetal y animal claramente diferenciada y transferir los huevos en un vaso de precipitados de 600 mL.</li>
	<li>Vaciar el exceso de tampón de x MMR 0,2 y suavemente Agregar 250 mL de 2 g por 100 mL extracto de cisteína (pH 7.7) en 1 x buffer (100 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, sacarosa de 50 mM, pH 7.7) a los huevos.</li>
	<li>Agitar enérgicamente los huevos con la mano y quitar las capas de gelatina de huevos en tres lavados con un volumen total de 800 mL de cisteína de búfer durante 3 minutos o hasta que el agregado de huevos y colocan en el fondo del vaso, indicando que el retiro de capa de la jalea es exitosa.</li>
	<li>Lavado de huevos con 1 L de solución de x MMR 0.2 más de cuatro veces.</li>
	<li>Recoger y desechar huevos que utilice una pipeta de vidrio blancos.</li>
	<li>Vaciar el búfer MMR y huevos con 200 mL de ionóforo de calcio de 0.1 μg/mL solución A23187 en buffer de x MMR 0,2 para la activación de la fuente.</li>
	<li>Use el lado de la abertura de una pipeta de cristal para revolver los huevos suavemente hasta que los huevos se activan y retire la solución de ionóforo de calcio.</li>
	<li>Comprobar la eficacia de la activación después de huevos colocan abajo en la parte inferior del vaso. Huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal.</li>
	<li>Lavar los huevos activados dos veces con 50 mL de 1 x extracto buffer suplementado con los inhibidores de proteasa (10 μg/mL cada leupeptin, pepstatin y chymostatin).</li>
	<li>Transferir cuidadosamente huevos a un microtubo de casquillo rápido de 0,4 mL y luego empacar huevos mediante centrifugación a 200 x g durante 60 segundos y luego 600 x g durante 30 segundos.</li>
	<li>Quitar extra amortiguación en la parte superior de huevos usando un pipeta Pasteur de vidrio para reducir la dilución de los extractos.</li>
	<li>Aplastar huevos a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Cortar los tubos con una cuchilla de afeitar para separar las tres capas de huevos machacadas y mantener el citoplasma crudo en la capa media.</li>
	<li>Transferir el citoplasma crudo a nuevos tubos de la ultracentrífuga y complementar con inhibidores de la proteasa y citocalasina B en 10 μg/mL de cada una.</li>
	<li>Centrifugue el citoplasma crudo otra vez a 15.000 x g a 4° C durante 5 minutos para purificar más citoplasma mediante la eliminación de la yema y el exceso de lípidos.</li>
	<li>Mantener extractos recién preparados en el hielo.</li>
</ol>3. gota generación
<ol><li>
Preparación de la cámara de cristal 2D Nota: Los tubos de vidrio de rectángulo sirven como cámaras que confinan las gotitas en un solo plano de 2 dimensiones, lo que permite más fácil observación y recopilación de datos.<ol>
<li>Cortar tubos de vidrio rectangular con una dimensión interna del μm 2 mm x 100 mm 4 piezas largas. Utilice el borde afilado de una piedra de afilar, marcar los límites deseados en la superficie externa del tubo de vidrio con grabados de luz y suavemente aplique presión en ambos lados de los grabados a romper pedazos de tubos de vidrio.</li>
		<li>Precalentar una incubadora de baño seco a 95 ° C. Sacar el bloque de calefacción y colóquelo en un desecador de vacío de policarbonato.</li>
		<li>Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo 30 μl de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano en el bloque calefactor. Montar los tubos de vidrio de corte dentro del desecador de vacío aproximadamente a 5 cm para el bloque de calefacción.</li>
		<li>Conecte el desecador a una bomba de vacío. Encienda la bomba durante 1 minuto para alcanzar el nivel de vacío deseado, luego cierre la válvula de 3 vías para sellar el desecador y dejar que el vapor de silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) recubrir la pared interna de los tubos de vidrio. Esto creará un ambiente hidrofóbico para estabilizar las gotitas.</li>
		<li>Dejar los tubos de vidrio dentro del desecador para la capa durante la noche. Los tubos estarán listos para usar al día siguiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La proyección de imagen y la generación de gotas Nota: Los procedimientos de generación de gotas y la proyección de imagen se ilustran en las figuras 1B y 1C.<ol>
<li>Suministro de extractos preparados en el paso 2 con 10 ng/μl mCherry securin mRNA para los experimentos simples sólo citoplasmática de ciclo celular. Por otra parte, fuente de extractos con cromatina de esperma demembranated (250 μl de extracto), proteína de GFP-NLS de 10 μm y 10 ng/μl mCherry securin mRNA para crear gotas que morfología de núcleos periódica cambia.</li>
		<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, mezcla 20 μl del extracto había provisto de proteína recombinante o ARNm con 200 μL de perfluoropoliéter 2%-polietilenglicol (PFPE-PEG) fluorosurfactant en HFE7500 fluorados aceite.</li>
		<li>Generar gotitas usando un mezclador de tipo vórtex. La gama de tamaños de gota puede ser modulada por la duración y la velocidad del vórtice. Para crear las gotas con radios que van desde 50 a 200 μm, ajustar la velocidad del vórtice a 56 x g (3.200 rpm con un radio de 4,9 mm) y presione suavemente el tubo de microcentrífuga con el extracto y la mezcla de surfactante en el mezclador durante 3,5 segundos. Inspeccione visualmente si las gotitas son uniformes en tamaño.</li>
		<li>Use una pipeta de 20 μl para transferir las gotitas flotando en la parte superior y un volumen igual de PFPE PEG surfactante en un tubo PCR. Sumergir el tubo de cristal preparado en el paso en la capa de gotas en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y esperar hasta que las gotas han llenado aproximadamente el 75% del tubo, luego empuje el tubo hacia abajo en la capa de surfactante hasta que el tubo esté lleno. Esto baja la densidad de la gota y permitir que las gotitas formar una sola capa dentro de la cámara sin superposición o forma de distorsión causado por el hacinamiento.</li>
		<li>Llenar un plato de fondo de cristal con un diámetro de 40 mm con aceite mineral. Sumerja los tubos llenos de gotas en aceite empujándolas suavemente hacia abajo usando una pinza fina.</li>
		<li>Después de cargar todas las muestras, uso un vaso pipeta para remover cualquier suciedad visible o gotas de filtrado. Añadir más aceite mineral si los tubos no son o no estar completamente inmerso en el proceso de proyección de imagen.</li>
		<li>Realizar la proyección de imagen de gotas en un microscopio de epifluorescencia equipado con una platina x-y motorizado (véase Tabla de materiales). Utilice un objetivo de aire X 4 para la proyección de imagen de todos. Para imágenes de fluorescencia, utilice 130 W vapor corto arco lámpara de mercurio como fuente de luz de fluorescencia para la iluminación y un filtro GFP (excitación 482/35 nm y emisión 514/LP nm) y un filtro mCherry (excitación 562/40 nm y emisión 641/75 nm) para la proyección de imagen Señales NLS GFP y mCherry securin.</li>
		<li>Grabar vídeos Time-lapse en el campo luminoso y múltiples canales de fluorescencia cada 6 a 9 minutos hasta que las gotas pierden su actividad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. tratamiento y análisis de datos de imágenes
<ol><li>
Segmentación y seguimiento de las gotas
	<ol>
<li>Importar datos en formato ".tif" o ".oif" en software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Segmento de gotitas individuales utilizando el canal de campo brillante. La imagen de campo claro mostrará gotitas como círculos brillantes con límites oscuros. Aplicar el umbral a la imagen. Añadir una superficie de seguimiento a cada gotita templando el umbral entre los píxeles oscuros y brillantes, para que cada superficie cubre toda el área de la gota correspondiente.</li>
		<li>Seguir automáticamente los segmentos entre fotogramas adyacentes utilizando el algoritmo de movimiento autorregresivo. Ajustar la distancia máxima aceptable de una gota entre dos marcos adyacentes sea menor que el radio de gotas más para un seguimiento preciso de pequeñas gotitas.</li>
		<li>Revise visualmente todas las pistas en todo el video entero para detectar segmentaciones incorrecto ese segmento el espacio vacío entre las gotas en lugar de gotitas reales. Elimine manualmente las pistas incorrectas.</li>
		<li>Segmento y área de fondo sin cualquier gotas para obtener la intensidad de la fluorescencia de fondo de pista. Para mejorar la señal a ruido, restar intensidad de fondo de la intensidad de fluorescencia de gotitas en cada marco de tiempo.</li>
		<li>Exportación de parámetros medidos para cada pista con el tiempo, incluyendo la media y desviación estándar de la intensidad de fluorescencia y de la zona de gota en archivos ".csv".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de datos de gota tamaño y oscilación período
	<ol>
<li>Cargar los archivos ".csv" en R para crear parcelas de intensidad de fluorescencia con el tiempo de cada gotita. ID. gotita de registro en un archivo ".csv".</li>
		<li>Importar los archivos de ".csv" exportados desde el software de análisis y el archivo ".csv" con una lista de ID de gota en Matlab y guardar como archivos de "MAT" para su posterior análisis de datos.</li>
		<li>Calcular el volumen de una gota comprimido basado en la información de zona de gota exportados después de segmentación y la altura de vidrio cámara de19. Utilizar el volumen para calcular el radio de la gota como una esfera.</li>
		<li>Extracto de los puntos de picos y valles utilizando el algoritmo de detección de pico a través del tiempo. Realizar correcciones manuales en la posición de los picos y valles para asegurar que se detectan con precisión.</li>
		<li>Para calcular el período del ciclo celular, calcular el intervalo de tiempo entre dos picos adyacentes. Tomar el promedio de todos los intervalos para cada gotita como su período del ciclo celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Hemos presentado un nuevo método para el desarrollo de un sistema celular artificial de alto rendimiento permite vitro en reconstitución y seguimiento a largo plazo de las oscilaciones de ciclo celular autosuficiente a nivel unicelular. Hay varios pasos fundamentales que hacen que este método exitoso. Huevos de Xenopus de primera, recién exprimidos con una buena calidad, en comparación con huevos establecidas, tienden a producir extractos con actividad de oscilación de mayor duración. En segundo lugar, ...

Citoplásmicos extractos preparados a partir de huevos de Xenopus laevis representan uno de los modelos más predominantes para el estudio bioquímico de los ciclos celulares, dado el gran volumen de ovocitos, la progresión del ciclo celular rápida y la capacidad de reconstituir eventos mitóticos en vitro1,2. Este sistema ha permitido el descubrimiento inicial y caracterización mecanicista de los reguladores de ciclo celular esencial como factor promotor de maduración (MPF) así como procesos mitotic posteriores incluyendo huso Asamblea y cromosoma segregación1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Los extractos de huevos de Xenopus también se han utilizado para la disección detallada de las redes reguladoras del ciclo celular reloj8,12,13,14 y para los estudios de los daños en el ADN /Replication de control15 y huso mitotic Asamblea checkpoint16,17,18.
Estos estudios de los ciclos celulares utilizando los extractos de huevos de Xenopus se han basado principalmente en mediciones masivas. Sin embargo, ensayos de reacción a granel convencional no pueden mímico comportamientos de celular real, dados una discrepancia importante en sus dimensiones y compartimentación subcelular espacial de las moléculas de reacción. Por otra parte, mediciones masivas de actividades mitotic son propensas a dar un número limitado de ciclos antes de amortiguación rápida8. Estas desventajas de reacciones a granel han impedido que el extracto de sistema para proporcionar más comprensión de funciones y propiedades dinámicas complejas de reloj. Estudios recientes han encapsulado citostáticos sin células factor detenido (CFS) Xenopus extractos19,20 en compartimentos de celular-como definido por el tamaño, que han ayudado a dilucidar cómo tamaño de husillo es modulada por el volumen citoplásmico. Sin embargo, este sistema in vitro es detenido en metafase de meiosis II por la acción del factor citostático1, y un sistema capaz de oscilaciones sostenidas a largo plazo en el nivel unicelular es necesaria investigación adicional del ciclo celular oscilador.
Para estudiar las oscilaciones del ciclo celular con una sola célula resolución, hemos desarrollado una escala celular, sistema de alto rendimiento para la reconstitución y la medida simultánea de múltiples procesos oscilatorios mitotic autosostenidos en microemulsión individual gotas. En este detallado video protocolo, demostramos la creación del sistema de oscilación mitotic artificial encapsulando ciclismo citoplasma de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones de tamaños que van desde 10 a 300 μm. En este sistema, fueron mitotic oscilaciones como condensación del cromosoma y la condensación, ruptura de la envoltura nuclear y reforma y la degradación y síntesis de sustratos de la anafase (p. ej., securin-mCherry en este protocolo) reconstituido con éxito.

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis ranas</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de giro QIAprep</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificación de PCR (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 célula competente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>Ionóforo de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Tricloro</td></tr> tóxico <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>tóxico</td></tr> <tr><td>(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG surfactante</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactante-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare Glutatión Sepharose 4B perlas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Columna PD-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>VitroCom tubo de vidrio hueco en miniatura</td><td>VitroCom</td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Olympus SZ61 Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83 Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1200 Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mL Microtubos con tapa a presión</td><td>E& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit ThermoFisher</td><td>(Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mezclador de vórtice analógico</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>versión 7.3</td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr></tbody></table>

reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de xenopus

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Medición en tiempo real de las oscilaciones en el nivel unicelular es importante descubrir los mecanismos de los relojes biológicos. Aunque extractos bulto preparados de huevos de Xenopus laevis han sido poderosos en disección redes bioquímicas subyacentes a la progresión del ciclo celular, su medición promedio del conjunto por lo general conduce a una oscilación amortiguada, a pesar de cada uno cada oscilador está sostenida. Esto es debido a la dificultad de sincronización perfecta entre osciladores individuales en los sistemas biológicos ruidosos. Para recuperar la dinámica unicelular del oscilador, hemos desarrollado un sistema de célula artificial basada en gotas que puede reconstituir ciclos mitóticos en compartimentos de la célula-como encapsular ciclismo extractos citoplásmicos de los huevos de Xenopus laevis . Estas células sólo citoplasmáticas simples exhiben oscilaciones sostenidas durante más de 30 ciclos. Para construir más complicadas las células con los núcleos, agregamos demembranated la cromatina espermática para activar núcleos uno mismo-montaje en el sistema. Observamos una progresión periódica de cromosoma condensación/decondensation y núcleos envuelven descomposición/reforma, como en las células reales. Esto indica que el oscilador mitotic funcione fielmente para conducir varios eventos mitóticos aguas abajo. Simultáneamente realiza un seguimiento la dinámica del oscilador mitotic y procesos posteriores en gotas individuales utilizando microscopía de fluorescencia Time-lapse de multicanal. El sistema de ciclo celular artificial proporciona un marco de alto rendimiento para la manipulación cuantitativa y análisis de oscilaciones mitóticas con resolución unicelular, que probablemente proporciona penetraciones importantes en la maquinaria reguladora y las funciones de el reloj.

En la figura 2, mostramos que este protocolo produce oscilaciones mitóticas en células simples, libre de nucleares así como complicadas células con núcleo, donde el oscilador conduce la alternancia cíclica de la formación de núcleos y deformación. Las gotas libres de núcleos generan oscilaciones mitóticas hasta a 30 ciclos undamped sobre la duración de 92 horas, según lo indicado por el periódico síntesis y la degradación de una fluorescencia reportero securi...

Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del sistema, como el mecanismo de regulación detrás de la red mitótica y las propiedades y funciones dinámicas del reloj del ciclo celular. La principal ventaja de esta técnica es que generará una gran cantidad de gotas con múltiples ciclos celulares en cada una, proporcionándonos un marco de alto rendimiento para la manipulación y análisis cuantitativo. Para empezar, deseche lotes de huevos que tengan límites poco claros entre los polos animales y vegetales o manchas blancas irregulares en la parte superior de los postes de animales.A continuación, seleccione un lote apropiado de huevos de una rana hembra y transfiera los huevos a un vaso de precipitados de 600 mililitros. Vierta un exceso de tampón MMR 0.2x, y agregue suavemente cisteína en tampón de extracto 1x a los huevos. Después de esto, agitar el vaso vigorosamente a mano para eliminar las capas de gelatina de los huevos.Repita este lavado tres veces con un total de 800 mililitros de tampones de cisteína o hasta que los huevos se agreguen y se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados. Después de retirar la capa de jalea, lave los huevos cuatro veces en un litro de solución 0.2x MMR. Use una pipeta de vidrio para recoger y desechar los huevos que se vuelven blancos.Vierta el tampón MMR fuera del vaso de precipitados y agregue 200 mililitros de solución de ionóforo de calcio en los huevos. Use una pipeta de vidrio para agitar los huevos suavemente hasta que se activen y retire la solución de ionóforo de calcio. Dejar los huevos en solución de ionóforo de calcio durante demasiado tiempo iniciará la apoptosis.Remuevemos los huevos durante 1,5 minutos y comprobamos la eficiencia de activación. Si no están activados, reanude la agitación y compruebe con más frecuencia hasta que se logre una activación del 90%. Después de que los huevos se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados, compruebe la eficiencia de activación.Los huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal. A continuación, lavar los huevos dos veces con un volumen total de 50 mililitros de tampón de extracto complementado con inhibidores de la proteasa. Luego, transfiera cuidadosamente los huevos a un microtubo de tapa de presión de 0,4 mililitros.Centrifugar el microtubo durante 60 segundos a 200 g y luego a 600 g durante 30 segundos para empacar los huevos. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para eliminar el exceso de tampón en la parte superior de los huevos después de cada paso. Después de esto, tritura los huevos a 15.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Usa una cuchilla de afeitar para cortar los tubos para separar las tres capas de huevos triturados y mantener el citoplasma crudo en la capa media. A continuación, transfiera el citoplasma crudo para limpiar los tubos de ultracentrífuga. Complementar el citoplasma con inhibidores de la proteasa y citocaplasina B a 10 microgramos por mililitro cada uno.Centrifugar el citoplasma crudo a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, usa una cuchilla de afeitar para cortar el tubo y mantener el citoplasma en la capa media. Coloque los extractos recién preparados sobre hielo.En primer lugar, agregue el ARNm securin-mCherry a los extractos preparados. A continuación, añada 200 microlitros de 2%fluorosurfactante PFPE-PEG a la mezcla de ARNm de extracto. Utilice un mezclador de vórtice para generar gotas, ajustando la velocidad del vórtice y la duración según sea necesario.A continuación, inspeccione visualmente las gotas para asegurarse de que son uniformes en tamaño. Usando una pipeta de 200 microlitros, transfiera las gotas flotando en la parte superior y un volumen igual de surfactante a un tubo pcR. Sumerja un tubo de vidrio en la capa de gotas y espere hasta que las gotas llenen aproximadamente el 75% del tubo.A continuación, empuje el tubo en la capa de surfactante, y llene el tubo por completo. A continuación, llene un plato con fondo de cristal con aceite mineral. Luego, usa pinzas finas para sumergir el tubo lleno de gotas en el aceite.Utilice una pipeta de vidrio para eliminar los restos visibles o las gotas con fugas. Para evitar el movimiento y la fuga de gotas, el tubo de vidrio lleno de gotas debe sumergirse debajo del aceite mineral con cuidado. Podemos empujar el tubo en ambos extremos con equilibrio o añadir unas gotas de aceite mineral en los extremos del tubo simultáneamente primero.Después de esto, utilice un microscopio de epifluorescencia equipado con una etapa xy motorizada para tomar imágenes de las gotas. Graba vídeos de lapso de tiempo en el campo brillante y múltiples canales de fluorescencia cada seis a nueve minutos hasta que las gotas pierdan su actividad. Usando este protocolo, se produjo una oscilación mitótica tanto en células simples y libres de energía nuclear como en células complicadas con núcleos.Las gotas libres de núcleos generaron oscilación mitótica de hasta 30 ciclos sin amortiguar durante 92 horas. También se examinó la capacidad del oscilador mitótico para conducir eventos mitóticos aguas abajo. El oscilador mitótico autosostenido impulsó los cambios de morfología nuclear observados a través de la alteración autónoma de distintas fases del ciclo celular.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener en cuenta el momento en que se hace el extracto, ya que es sensible al tiempo, y siempre mantener los huevos y extraer en hielo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del sistema exploraran los principios fundamentales de las propiedades complejas del reloj, como la tunabilidad y la estocástica en Xenopus laevis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Extractos de Xenopus huevo crudo y fraccionado se puede utilizar para proporcionar ingredientes para la reconstitución de los procesos celulares de análisis morfológicos y bioquímicos. Lisis de huevo y centrifugación diferencial se utilizan para preparar el extracto crudo que a su vez en utilizarse para preparar extractos fraccionados y preparados ligeros membrana.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

Se describe un método para el análisis de la degradación de proteínas usando radiomarcado y proteínas de fusión luciferasa-en extracto de huevo de Xenopus y su adaptación para la selección de alto rendimiento para moduladores de moléculas pequeñas de la degradación de proteínas.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Describimos métodos de manipulación de ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, maduración in vitro de ovocitos a óvulos e inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite la degradación de algunas proteínas maternas y la sobreexpresión de genes de interés en la fertilización, por lo que es valioso para estudiar el papel de factores específicos en el desarrollo embrionario temprano.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Los mecanismos moleculares de la descondensación de la cromatina mitótica altamente compactada están mal definidos. Presentamos un ensayo libre de células basado en clústeres de cromatina mitótica aislados de células HeLa y extracto de huevo de Xenopus laevis que reconstituye fielmente el proceso de descondensación in vitro.

Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Los mecanismos de escalamiento celular e intracelular siguen siendo esquivos. El uso de extractos de embriones de Xenopus se ha vuelto cada vez más común para dilucidar los mecanismos de regulación del tamaño de los orgánulos. Este método describe la preparación de extractos embrionarios y un nuevo ensayo de escalamiento nuclear a través del cual se pueden identificar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.

Un ensayo libre de células Utilizando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear

El ensamblaje y posicionamiento del huso mitótico dependen de las fuerzas combinadas generadas por la dinámica de los microtúbulos, las proteínas motoras y los reticulantes. Aquí presentamos nuestros métodos recientemente desarrollados en los que el confinamiento geométrico de gotas de emulsión esférica se utiliza para la reconstitución ascendente de husos mitóticos básicos.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Presentamos dos protocolos de sincronización celular que proporcionan un contexto para el estudio de eventos relacionados con fases específicas del ciclo celular. Mostramos que este enfoque es útil para analizar la regulación de genes específicos en un ciclo celular no perturbado o en la exposición a agentes que afectan el ciclo celular.

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Se proporciona un protocolo para el cultivo y manipulación de tejido embrionario de ratón en un chip microfluídico. Mediante la aplicación de pulsos de moduladores de vía, este sistema se puede utilizar para controlar externamente las oscilaciones de señalización para la investigación funcional de la somitogénesis del ratón.

Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

Aprende a reconstituir oscilaciones mitóticas en microemulsiones de extractos de huevo de Xenopus laevis. Este método permite el análisis de alta capacidad de la dinámica del ciclo celular y las propiedades del reloj mitótico.

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

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