Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

Este protocolo describe un método novedoso y fácil basado en moldes para la creación de tejido cardíaco tridimensional, que utiliza esferoides como herramienta para la creación de tejido cardíaco sin andamios. En nuestros experimentos, se aislaron tres tipos de células, cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas, fibroblastos cardíacos humanos y células endoteliales de la vena umbilical humana y se utilizaron para generar una suspensión celular. Con un 70% de cardiomiocitos, un 15% de fibroblastos y un 15% de células endoteliales, en un tubo cónico de 50 ml.

A continuación, dispensamos la suspensión de la célula en cada pocillo de un sistema de caída colgante de fijación ultra baja, lo que dará lugar a la formación espontánea de cientos de esferoides batientes después de tres días. A continuación, los esferoides se cosechan y se depositan en una nueva cavidad de molde. A continuación, el tejido se mantiene en un recipiente estéril con medio, en un agitador de la incubadora durante varios días.

Posteriormente, el molde se elimina, lo que da como resultado un parche de tejido libre de andamios con integridad mecánica. El dispositivo de caída colgante es un pozo de fijación ultra baja reutilizable con 850 microporos, cada uno con un diámetro de 350 micras. La caída colgante es compatible con placas estándar de seis pocillos.

Después de hacer la suspensión celular dispensamos cuatro mililitros de suspensión celular que contiene 10 millones de células, a cada pocillo del sistema de gotas colgantes. Los dispositivos se cultivan a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Después de 72 horas se observa la formación espontánea de esferoides batientes, con un diámetro promedio de 350 micras.

Los esferoides se cosechan colocando el dispositivo de caída colgante en otro plato con medio y girando suavemente para liberar los esferoides y permitir que se desplacen a través de los poros en la parte inferior del sistema de gota colgante. Este es un esquema del nuevo molde para la creación de tejido cardíaco tridimensional, sin andamios. Incluye la esterilla de manipulación, la base de llenado y el novedoso molde.

El novedoso molde se compone de una base, una placa cuadrada inferior, una red inferior, 10 capas de redes laterales hechas con finas puntas de acero inoxidable. Una red superior, una placa cuadrada superior, los tubos de sujeción y los pasadores de tapón. El sistema Novel Mold puede crear diferentes tamaños de tejidos, incluidos dos por dos milímetros, cuatro por cuatro milímetros y seis por seis milímetros.

La placa cuadrada inferior de la base y la red inferior se apilan y alinean con los postes de las esquinas. A continuación, se apilan 10 capas de redes laterales en direcciones alternas para crear una red de finas púas de acero inoxidable, con la ayuda de un par de pinzas estériles. A continuación, la base de llenado se lava con una solución tampón de fosfato 1X, o PBS, para reducir la tensión superficial antes de asentar los esferoides en el nuevo molde.

Después de humedecer la nueva cavidad del molde en el mismo metano, los esferoides se asientan en la cavidad supuesta del tamaño deseado. Al sentarse, el exceso de medio se drena a través del molde de red, permitiendo que los esferoides se llenen y asuman la forma de la cavidad predefinida. A continuación, la red superior y la placa cuadrada superior se ensamblan en los postes de las esquinas y se fijan los pasadores de tope y los tubos de sujeción, para evitar el lavado de los esferoides.

El novedoso sistema de molde lleno se transfiere a una placa de seis pocillos, con seis milímetros de medio suplementado B-27, y luego se mantiene en la incubadora en un agitador oscilante durante siete a diez días, a 30 a 40 RPM. La duración de la incubación puede verse alterada, dependiendo del tamaño del parche cardíaco. Después de la incubación, se retira el sistema y se retiran el tubo de sujeción, los tapones, la placa cuadrada superior y la red superior.

A continuación, las redes laterales en capas se deslizan cuidadosamente una por una, teniendo cuidado de no dañar el tejido. Después de retirar todas las redes laterales, se obtiene un parche cardíaco intacto en la parte superior de la red inferior. El latido sincrónico funcional se observa dentro de las 24 horas.

Este novedoso método basado en moldes es un método eficiente y fácil de crear tejidos cardíacos tridimensionales sin andamios, con un mínimo esfuerzo manual. Los tejidos multicapa resultantes consisten en esferoides fusionados con una integridad estructural satisfactoria y un comportamiento de batido sincrónico. Este novedoso método basado en moldes presenta una alternativa rentable y escalable a los métodos actuales de biofabricación de tejidos de ingeniería.