Name: Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a crear tejidos cardiacos tridimensionales sin andamio utilizando esferoides y un método basado en moldes. Esta técnica eficiente genera tejidos con integridad estructural y latido sincrónico para investigación en medicina regenerativa.

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Los autores reconocen la siguiente fuente de financiamiento: la magia que cuestiones de fondo para la Investigación Cardiovascular.

1. preparación de cardiomiocitos
<ol><li>Placas de 6 pocillos capa con membrana del sótano matriz y cultura humanas pluripotentes células (hiPSCs) como describieron anteriormente17.</li>
	<li>Se diferencian hiPSCs en hiPSC-CMs usando métodos previamente descritos18.</li>
	<li>En la diferenciación posterior de 16-18 d, suspender los cardiomiocitos aclarando cada pocillo con 2 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) sin calcio ni magnesio, seguido por la incubación con 1 mL/pozo de tripsina o celular reactivo de disociación (ver tabla de Materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de los medios de comunicación celular de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complementado con B-27 (media de células RPMI/B-27). Pipetee hacia arriba y hacia abajo para aflojar las células adheridas.</li>
	<li>Recoger los cardiomiocitos suspendidos con una pipeta serológica de 10 mL y transferir a un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un precipitado de células.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de RPMI/B-27 celular medio.</li>
	<li>20 μl de la suspensión celular se combinan con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.</li>
	<li>Usar un hemocitómetro manual para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células.</li>
</ol>2. preparación de los fibroblastos
<ol><li>Iniciar una cultura de una línea de células del fibroblasto cardiaco humano (HCF) (tipo ventricular adulto) como se describe anteriormente16.</li>
	<li>Suspender el HCF por incubación con una cantidad apropiada del reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) durante 5 minutos a temperatura ambiente16. Para un frasco T175, 10 mL de reactivo de disociación tripsina o célula se utilizó.</li>
	<li>Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de medio, luego transferir la muestra a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pelotilla.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de crecimiento del fibroblasto (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>20 μl de la suspensión de células HCF se combinan con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.</li>
	<li>Usar un contador de células automatizado o manual hemocitómetro para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células nuevas.</li>
</ol>3. preparación de células endoteliales
<ol><li>Iniciar una cultura de una línea de células endoteliales (HUVEC) de la vena umbilical humana tal como se describe anteriormente17. Suspender las HUVECs por incubación con una cantidad apropiada del reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) por 3 min a temperatura ambiente17. Neutralizar el reactivo de disociación tripsina o celular (véase Tabla de materiales) con un volumen igual de medio, luego se transfieren a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un pellet. Nota: Para un matraz T175, 10 mL de reactivo de disociación tripsina o célula se utilizó.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de cultivo de células endoteliales (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>20 μl de la suspensión HUVEC se combinan y la mancha con una cantidad igual de solución de azul de tripano 0.4% y mezclar suavemente.</li>
	<li>Usar un contador de células automatizado o un hemocitómetro manual para contar y obtener la viabilidad concentración y celular de la suspensión de células.</li>
</ol>4. creación de colgante gota esferoides
<ol><li>Colocar el colgante gota dispositivo que contiene 850 microporos (cada uno con un diámetro de 350 μm) en placas de 6 pocillos estériles.</li>
	<li>Aislar los tres tipos de células como se describe anteriormente: hiPSC CMs, HCF y HUVECs. Combinar en una proporción de 70% iPSC-CMs, 15% de HCF y HUVECs 15% en un tubo cónico de 50 mL con RPMI/B-27 los medios de comunicación de la célula a una concentración de 2.475.000 células por mL.</li>
	<li>Pipetear 4 mL de la suspensión celular (2.475.000 células por mL) a cada pocillo de un accesorio ultra bajo colgante sistema (con un diámetro del microporo de 350 μm) en una placa de 6 pozos.</li>
	<li>Esferoides se forman espontáneamente dentro de 12 h de dispensar la suspensión de células en el colgante gota dispositivo. Continuar a la cultura para un total de 72 h (3 d) a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad para la maduración de los esferoides.</li>
	<li>Después de 72 h de cultivo, cosecha de los esferoides a través de los poros en la parte inferior de las que cuelgan gota sistema colocando el dispositivo en un plato con medio y girando suavemente para soltar los esferoides de colgar dispositivo gotas.</li>
</ol>5. creación de parche 3D utilizando el nuevo molde neto
<ol><li>La base, plato cuadrado inferior, red de fondo y 10 capas lado redes se ensamblan para crear el molde de la novela con la ayuda de un par de pinzas estériles. En primer lugar, pila de alinear la base, plato cuadrado inferior y fondo net usando los postes esquineros. Luego, la pila y las redes 10 lado alternando direcciones para crear una red de finas patas de acero inoxidable de la capa.</li>
	<li>Eliminar el relleno base con PBS o medio para reducir la tensión superficial y, a continuación, transferir el molde montado en la base del relleno.</li>
	<li>Húmeda la cavidad del molde neto con PBS o medio en el mismo método. Llenar lentamente los esferoides en la cavidad presupuesta del tamaño deseado (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 m, o 6 x 6 x 1 mm). Nota: Asegúrese de que el 120% del volumen esperado de esferoides se alimenta en la cavidad para que los agregados de la célula están en estrecha conexión y permanecer estáticos.</li>
	<li>Montar el top red placa superior y cuadrada en los postes esquineros y asegure los tapones y tubos de retención para prevenir el lavado de los esferoides.</li>
	<li>Transferir el sistema de llenado de molde neta a una placa de la pozo de 6 con 6 mL de RPMI/B-27 medios de célula o en un recipiente estéril con suficiente medio para cubrir el molde montado todo.</li>
	<li>Incubar la placa de la pozo de 6 con el sistema de llenado del molde en un agitador oscilante durante 7-10 días a 3.000-4.000 x g. Nota: La duración de la incubación se decide por el tamaño de los parches cardíacos. Con los parches más grandes, el tiempo de incubación deberá aumentarse para maduración de parche cardiaco.</li>
</ol>6. eliminación de la versión de la novela neta molde
<ol><li>Desmontar el molde de los medios de comunicación y colóquelo en la estera de esterilizados manejo en un recipiente estéril de 10 cm.</li>
	<li>Retire el tubo, tapones, la placa superior del cuadrado y la red superior. Cuidadosamente Deslice el lado capas redes uno por uno con un par de pinzas estériles. Después de la decanulación, se obtiene un parche cardiaco intacto encima de la red de fondo.</li>
	<li>Coge la red de fondo con el parche utilizando pinzas estériles y transferir la red de fondo en una placa de 35 mm con 5 mL de Medio RPMI/B27. Aflojar el parche de la red de fondo suavemente agitando lentamente la red en el plato, o con un raspador estéril de la célula. Después de la separación de la red de fondo, el tejido cardiaco puede ser cultivado con medios RPMI/B27.</li>
	<li>Seguir a incubar el parche cardiaco 3D flotan libremente en el plato de 35 mm. Paliza sincrónica funcional puede observarse tan pronto como 24 horas después del retiro del molde.</li>
	<li>Después de quitar el parche del molde de red, tenga en cuenta que su forma se mantiene con la integridad y la intensidad del latido sincrónico aumenta con el tiempo. Nota: Los parches cardiacos basados en molde red 3D exhibieron la integración eléctrica de componente cardiospheres después del decannulation. Se observó una frecuencia de golpeo que van de 60 a 80 pulsaciones por minuto que persistió por más de 60 días.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
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<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
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<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
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<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La importancia de este método radica en su reproducibilidad y la eficacia del tejido cardiaco resultante de varias capas. En el campo de la ingeniería de tejido cardiaco, uno de los objetivos actuales es identificar un método para crear parches cardíacos 3D golpes, varias capas y funcionales. Divulgamos un método eficiente y reproducible de la creación de varias capas de tejidos cardiacos por siembra manual directa de esferoides compuestos de cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en un nuevo molde neto. El ...

El objetivo de la actual ingeniería de tejido cardiaco es desarrollar una terapia para reemplazar o reparar la estructura y función del tejido miocárdico lesionado1. Métodos para crear modelos 3D tejido cardiaco exhibe las propiedades importantes de contráctiles y electrofisiológicas del tejido cardiaco nativa han estado ampliando rápidamente2,3. Una variedad de estrategias han sido exploradas y utilizadas en los estudios4,5. Estos métodos entre el uso de específicos hidrogeles bioactivos naturales y sintéticos, tales como gelatina, colágeno, fibrina y péptidos6, y deposición del bio-tinta tecnologías tecnologías2 y bioprinting7.
Se ha demostrado que métodos libres de andamio pueden producir tejidos comparables como métodos basados en el biomaterial, sin los inconvenientes de la incorporación de material de andamio exterior8. Oren Caspi et al demostraron que la incorporación de varios tipos de células permite la generación de tejido cardiaco ingeniería humana altamente vascularizado9. Chin et al. desarrolló un método de impresión 3-d para la creación del parche cardiaco de esferoides. Parches que se componen de cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales en un cociente de 70:15:1510. Esferoides han demostrado ser eficaces "building blocks" de la creación de tejido cardíaco libre de andamios, ya que son resistentes contra la hipoxia y poseen suficiente integridad mecánica para la implantación de11,12. Estudios anteriores han demostrado varios métodos de fabricación para la creación de esferoide, incluyendo el uso de las que cuelgan de la gota método, spinner frascos13, sistemas de microfluidos14y cultura no adherente superficies sin revestir o revestidos con micro-moldes de agarosa15. En este protocolo, se utiliza el colgante gota dispositivo, que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez.
Este estudio presenta un novedoso y eficaz método de andamio-libre para la creación de tejido cardíaco, que incluye siembra manualmente los esferoides en la cavidad de un molde cuadrado y el tejido en un agitador de incubación para la maduración. Bajo condiciones de cultivo estático habitual, difusión de oxígeno está limitada a los aspectos exteriores de la construcción de tejido, resultando en necrosis central. Sin embargo, con el molde de red, todos los esferoides sembradas en el molde están inmersos en los medios de comunicación con un constante movimiento fluídico, permitiendo para la mayor difusión de nutrientes y oxígeno. Además, este método basado en el molde permite la creación simultánea de parches de tejido de diferentes tamaños con el mínimo esfuerzo manual y el tejido resultante se puede quitar fácilmente del molde. Este novedoso método permite la creación eficiente y reproducible de parches cardíacos libre de andamio, de varias capas.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos cardíacos humanos (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 consta de medio basal</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF medio de cultivo</td></tr><tr><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC medio de cultivo</td></tr><tr><td>E8 media&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>medio de cultivo HiPSC</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Reactivo de tripsina y disociación celular</td></tr><tr><td>Medios RPMI</td><td>Los medios Invitrogen</td><td>11875093</td><td>RPMI con el suplemento B-27 son medios de cultivo hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Suplemento B-27 (50x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>Los medios RPMI con suplemento B-27 son medios de cultivo hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Azul Trypan Solución, 0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nuevo molde de red&nbsp;</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa colgante</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6 placas de pocillos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Este protocolo describe un novedoso y fácil método neto basado en el molde para crear tejidos cardiacos de tridimensional (3D) sin material de andamio adicional. Cardiomiocitos de derivados de células madre humanas pluripotentes (iPSC-CMs), fibroblastos cardiacos humanos (HCF) y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) son aisladas y utilizadas para generar una suspensión con 70% iPSC-CMs, HCF de 15% y 15% HUVECs. Son cultivadas conjuntamente en un sistema de fijación ultra baja "gota colgante", que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez. Las células agregan y espontáneamente forman esferoides paliza después de 3 días de cocultivo. Los esferoides son cosechadas, sembrados en una cavidad de molde novela y cultivadas en un agitador en la incubadora. Los esferoides se convierten en un tejido funcional maduro aproximadamente 7 días después de la siembra. Los tejidos resultantes de varias capas consisten en esferoides fusionadas con satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza. Este nuevo método tiene potencial prometedor como un método reproducible y rentable para crear tejidos diseñados para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca en el futuro.

En nuestros experimentos, se utilizó una suspensión de iPSC-CMs 70%, 15% HCF y HUVECs 15% en medios de comunicación de células RPMI/B-27 a una concentración de 2.475.000 células por mL. Después de crear la suspensión de células, nos dispensa 4 mL de la suspensión celular en cada pocillo de un accesorio ultra bajo suspensión sistema, tal como se describe en el paso 4.3 del protocolo. El uso de colgar sistema dio lugar a la formación espontánea de cientos de vencer a esferoides después de 3...

Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Este protocolo describe un método novedoso y fácil basado en moldes para la creación de tejido cardíaco tridimensional, que utiliza esferoides como herramienta para la creación de tejido cardíaco sin andamios. En nuestros experimentos, se aislaron tres tipos de células, cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas, fibroblastos cardíacos humanos y células endoteliales de la vena umbilical humana y se utilizaron para generar una suspensión celular. Con un 70% de cardiomiocitos, un 15% de fibroblastos y un 15% de células endoteliales, en un tubo cónico de 50 ml.A continuación, dispensamos la suspensión de la célula en cada pocillo de un sistema de caída colgante de fijación ultra baja, lo que dará lugar a la formación espontánea de cientos de esferoides batientes después de tres días. A continuación, los esferoides se cosechan y se depositan en una nueva cavidad de molde. A continuación, el tejido se mantiene en un recipiente estéril con medio, en un agitador de la incubadora durante varios días.Posteriormente, el molde se elimina, lo que da como resultado un parche de tejido libre de andamios con integridad mecánica. El dispositivo de caída colgante es un pozo de fijación ultra baja reutilizable con 850 microporos, cada uno con un diámetro de 350 micras. La caída colgante es compatible con placas estándar de seis pocillos.Después de hacer la suspensión celular dispensamos cuatro mililitros de suspensión celular que contiene 10 millones de células, a cada pocillo del sistema de gotas colgantes. Los dispositivos se cultivan a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Después de 72 horas se observa la formación espontánea de esferoides batientes, con un diámetro promedio de 350 micras.Los esferoides se cosechan colocando el dispositivo de caída colgante en otro plato con medio y girando suavemente para liberar los esferoides y permitir que se desplacen a través de los poros en la parte inferior del sistema de gota colgante. Este es un esquema del nuevo molde para la creación de tejido cardíaco tridimensional, sin andamios. Incluye la esterilla de manipulación, la base de llenado y el novedoso molde.El novedoso molde se compone de una base, una placa cuadrada inferior, una red inferior, 10 capas de redes laterales hechas con finas puntas de acero inoxidable. Una red superior, una placa cuadrada superior, los tubos de sujeción y los pasadores de tapón. El sistema Novel Mold puede crear diferentes tamaños de tejidos, incluidos dos por dos milímetros, cuatro por cuatro milímetros y seis por seis milímetros.La placa cuadrada inferior de la base y la red inferior se apilan y alinean con los postes de las esquinas. A continuación, se apilan 10 capas de redes laterales en direcciones alternas para crear una red de finas púas de acero inoxidable, con la ayuda de un par de pinzas estériles. A continuación, la base de llenado se lava con una solución tampón de fosfato 1X, o PBS, para reducir la tensión superficial antes de asentar los esferoides en el nuevo molde.Después de humedecer la nueva cavidad del molde en el mismo metano, los esferoides se asientan en la cavidad supuesta del tamaño deseado. Al sentarse, el exceso de medio se drena a través del molde de red, permitiendo que los esferoides se llenen y asuman la forma de la cavidad predefinida. A continuación, la red superior y la placa cuadrada superior se ensamblan en los postes de las esquinas y se fijan los pasadores de tope y los tubos de sujeción, para evitar el lavado de los esferoides.El novedoso sistema de molde lleno se transfiere a una placa de seis pocillos, con seis milímetros de medio suplementado B-27, y luego se mantiene en la incubadora en un agitador oscilante durante siete a diez días, a 30 a 40 RPM. La duración de la incubación puede verse alterada, dependiendo del tamaño del parche cardíaco. Después de la incubación, se retira el sistema y se retiran el tubo de sujeción, los tapones, la placa cuadrada superior y la red superior.A continuación, las redes laterales en capas se deslizan cuidadosamente una por una, teniendo cuidado de no dañar el tejido. Después de retirar todas las redes laterales, se obtiene un parche cardíaco intacto en la parte superior de la red inferior. El latido sincrónico funcional se observa dentro de las 24 horas.Este novedoso método basado en moldes es un método eficiente y fácil de crear tejidos cardíacos tridimensionales sin andamios, con un mínimo esfuerzo manual. Los tejidos multicapa resultantes consisten en esferoides fusionados con una integridad estructural satisfactoria y un comportamiento de batido sincrónico. Este novedoso método basado en moldes presenta una alternativa rentable y escalable a los métodos actuales de biofabricación de tejidos de ingeniería.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

En estos estudios, se entrega metodología para la novela, andamios cardiacos neonatales, murinos para su uso en estudios de regeneración.

Los andamios neonatal cardíaca: Matrices novedosos para Estudios regenerativos

Este protocolo describe bioprinting 3D de tejido cardíaco sin el uso de biomateriales. Los parches cardiacos bioprinted 3D exhiben la integración mecánica de esferoides componentes y son altamente prometedores en regeneración del tejido cardíaco y como modelos 3D de la enfermedad cardíaca.

Creación de tejido cardiaco que exhibe la integración mecánica de esferoides usando bioprinting 3D

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Los tejidos diseñados dependen en gran medida de las redes vasculares adecuadas para proporcionar nutrientes y gases vitales y eliminar los desechos metabólicos. En este trabajo, un protocolo de siembra escalonada de células endoteliales y células de apoyo crea redes vasculares altamente organizadas en una plataforma de alto rendimiento para estudiar el comportamiento de los vasos en desarrollo en un entorno 3D controlado.

Siembra celular escalonada en andamios teselados para estudiar la brotación de los vasos sanguíneos

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Los modelos específicos del paciente mejoran la confianza del cirujano y de los compañeros al desarrollar o aprender planes quirúrgicos. Las impresoras tridimensionales (3D) generan detalles adecuados para la preparación quirúrgica, pero no logran replicar la fidelidad háptica del tejido. Se presenta un protocolo que detalla la creación de modelos cardíacos de silicona específicos del paciente, combinando la precisión de la impresión 3D con tejido de silicona simulado.

Creación de modelos cardíacos de silicona específicos del paciente con aplicaciones en planes prequirúrgicos y capacitación práctica

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprende a crear tejidos cardiacos tridimensionales sin andamio utilizando esferoides y un método basado en moldes. Esta técnica eficiente genera tejidos con integridad estructural y latido sincrónico para investigación en medicina regenerativa.

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

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