Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica de PCSK9, como qué fármacos o cambios genéticos afectan a la función proteolítica de PCSK9. La principal ventaja de esta técnica es que permite una lectura rápida y amplificable de un evento bioquímico de baja frecuencia intrínseca. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la cardiopatía aterosclerótica porque la función proteolítica de PCSK9 es necesaria para su efecto final sobre los niveles de colesterol sérico.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la PCSK9 en sí, también se puede aplicar a otros sistemas bioquímicos, como otras proteasas con una actividad proteolítica intrínsecamente baja. Para comenzar, aspire el medio de cada célula T HEK293. Lavar con PBS y tratar con el volumen mínimo de 0,5% de tripsina-EDTA.

E incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos para disociar las células del matraz principal. Añadir dos volúmenes de DMEM suplementado con 10%FBS para inactivar la tripsina-EDTA. A continuación, pipetear el líquido del matraz hacia arriba y hacia abajo varias veces, desalojando las células adherentes y transfiriendo las células a un tubo estéril.

A continuación, retire una pequeña alícuota de celdas. Tiña con un volumen igual de azul de tripán y transfiere las células teñidas a un portaobjetos, y utiliza un contador de células automatizado para contar las células. Centrifugar el tubo a 500 veces G durante cinco minutos para recuperar las células.

Después de esto, aspire el medio y reconstituya las células y el medio de cultivo a la concentración deseada. Con una pipeta multicanal y un canal estéril, transfiera 100 micrómetros de las células de cada pocillo a una placa blanca de 96 pocillos. A continuación, incube las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.

A continuación, prepare la placa de plásmidos a la concentración deseada para la transfección, incluidos cuatro pocillos para el plásmido de control positivo, el plásmido de control negativo y el tampón sin plásmido. Primero, prepare una mezcla maestra de reactivo de transfección de lípidos diluidos y una mezcla maestra de reactivo de precomplejación de ADN. A continuación, utilizando una pipeta multicanal y un canal estéril, alícuota 16,8 microlitros del reactivo de precomplejación de ADN diluido en cada pocillo de una placa de pocillo profundo.

Después de esto, use la pipeta multicanal para transferir 3,2 microlitros de cada plásmido de la placa maestra a cada pocillo de la placa de pozo profundo. A continuación, utilice la pipeta para añadir 20 microlitros de la mezcla de reactivos de transfección de lípidos diluidos a cada pocillo de la placa y mezcle bien. Cubra las placas y déjelas reposar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos para formar complejos de ADN lipídico.

Después de esto, use la pipeta multicanal para eliminar suavemente el medio de las 293 células T en la placa de 96 pocillos. A continuación, sustituya el medio por 95 microlitros de DMEM suplementado con 10% de FBS. A continuación, utilice la pipeta multicanal para añadir 10 microlitros de la mezcla de transfección a cada pocillo adecuado.

A continuación, incube las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Primero, prepare las soluciones madre necesarias para hacer el reactivo de ensayo de celenterazina de doble potencia, que incluye tres molares de ascorbato de sodio en PBS, cinco molares de cloruro de sodio en agua destilada, 10 miligramos por mililitro de BSA en PBS y dos milimolares de celenterazina en metanol acidificado. A continuación, prepare suficientes reactivos de celenterazina para la lectura de luciferasa.

Con un reactivo separado para cada una de las células en el medio. A continuación, mezcle todos los reactivos que se esperan para la celenterazina. Filtre la mezcla a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.

Y luego, después de la filtración, agregue la celenterazina. Retire las células de la incubadora 24 horas después de la transfección. A continuación, utilice la pipeta multicanal para transferir 50 microlitros de medio acondicionado de cada pocillo a una placa blanca y fresca de 96 pocillos.

Utilice la pipeta multicanal para añadir 50 microlitros de reactivo de celenterazina no lítica de doble potencia a la placa que contiene únicamente medio acondicionado. Luego, agite suavemente el plato en la oscuridad durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, repita este paso añadiendo el reactivo de celenterazina lítica de doble potencia a la placa que contiene las células.

Después de las incubaciones, mida la luminiscencia de la placa de solo medio y la placa que contiene células en un lector de placas. Finalmente, deseche las placas y guarde los archivos para un análisis posterior de los datos. Es importante incubar el reactivo de luciferasa con la placa de solo medio y la placa que contiene células durante la misma cantidad de tiempo porque los datos de estas placas se comparan directamente.

En este protocolo, se evaluó la especificidad de la secuencia de escisión de la proteasa PCSK9 en los sitios de sustrato P6 a P6 Prime mediante un ensayo de luciferasa. Los cambios en la secuencia de escisión en las posiciones P6 y P4 a P1 Prime son mal tolerados por la proteasa. Pero las posiciones P5 y P2 Prime a P6 Prime son más flexibles para cambiar.

Además, los resultados muestran que las secuencias de escisión óptimas son esencialmente las mismas que las secuencias de tipo salvaje. Se comparó la actividad de escisión relativa de una biblioteca de recortes erróneos encontrados en la clínica con la proteasa de tipo salvaje. De los 84 cortes evaluados, más de la mitad mostraron cambios significativos en la actividad en comparación con la proteasa de tipo salvaje, lo que sugiere que las alteraciones en la actividad de la proteasa se observan con frecuencia en la población clínica.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo o los ensayos de captación de colesterol en hepatocitos para evaluar las alteraciones en la capacidad proteolítica de PCSK9 sobre el efecto de PCSK9 sobre el receptor de LDL.