Name: Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a evaluar la actividad proteolítica de PCSK9 mediante un ensayo de luciferasa de alto rendimiento en células HEK293 T. Esta técnica permite detectar eventos bioquímicos de baja frecuencia con lecturas amplificables y rápidas.

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Los autores agradecen el apoyo financiero generoso del NHLBI/NIH (HL124068 K08 y LRP HMOT1243), NCATS/NIH a través de la UCSF clínica y traslacional Instituto catalizador programa de ciencia (UL1 TR000004), el Senado académico de la UCSF, la Fundación Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un premio Cardiovascular Pfizer ASPIRE (todos John S. Chorba) y el Howard Hughes Medical Institute (a Adri M. Galván y Kevan M. Shokat).

1. dirigida mutagénesis del Vector de la proteasa
<ol><li>Diseño y orden de oligonucleótidos sintetizados de costumbre instalar una mutación de interés utilizando una modificación de protocolos de mutagénesis sitio-dirigida estándar12. Cartillas desaladas estándar (sin purificación adicional) son perfectamente aceptables. Nota: Un enfoque general a los diseños del primer implica crear cartillas parcialmente superpuestos como se indica en la tabla 1, usando una calculadora de temperatura (Tm) fusión específica a la polimerasa de interés.</li>
	<li>Establecer reacciones en cadena de polimerasa (PCR) para la mutagénesis sitio-dirigida en el hielo, como se indica en la tabla 2.</li>
	<li>Ciclo de la PCR como se indica en la tabla 3.</li>
	<li>2-5 μl de cada PCR en un gel de agarosa al 1% y visualizar los productos para confirmar una amplificación exitosa. Nota: Una polimerización en cadena acertada mostrará una banda de DNA única y prominente en el marcador del tamaño aproximado de la plantilla (~7.8 kB).</li>
	<li>Añadir 0,5 μl (por reacción de 25 μl) de DpnI e incubar las muestras a 37 ° C durante 1 h.</li>
	<li>Transformar 2 μl de la reacción en químicamente competentes de Escherichia coli. Nota: Una cepa de e. coli rápido crecimiento reducirá tiempos de incubación, pero cualquier cepa clonación será aceptable.</li>
	<li>Las transformaciones en agar Luria-Bertani (LB) con carbenicilina de 50-100 μg/mL de la placa. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Seleccione colonias de 2-4 para crecer en un cultivo en pequeña escala (2-5 mL de medio LB con carbenicilina de 50-100 μg/mL). Incubar el cultivo a 37 ° C a 220 rpm hasta que es turbia.</li>
	<li>Aislar el plásmido de DNA de las células utilizando un kit de purificación (es decir, "miniprep") de DNA de plásmido según las instrucciones del fabricante. Cuantificar la concentración de ADN eluída usando un espectrofotómetro microvolume.</li>
	<li>La secuencia del plásmido ADN utilizando extensivamente un servicio de secuenciación de Sanger (como un núcleo o centro comercial). Preparar las muestras de ADN según las especificaciones del servicio. Cebadores utilizados con éxito en reacciones de secuenciación previa se observan en la tabla 4. Nota: Debido a la amplificación por PCR del plásmido toda, la secuenciación de la región entera de la codificación PCSK9 se recomienda para cada mutante.</li>
</ol>2. alto rendimiento base de Luciferase proteólisis ensayo
<ol><li>
Galjanoplastia de la célula (día 0)
	<ol>
<li>Utilizar células HEK293T de paso bajo para experimentos y una cultura de Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS). Realizar todo la célula de trabajo en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos hasta el momento de analizar la actividad de luciferasa. Estimar el número de pozos y las placas necesarias para el experimento, anticipando que transfecciones se realizará por triplicado para cada condición de prueba.</li>
		<li>Disociar las células HEK293T un frasco de padres tratándolos con un volumen mínimo de 0.05% tripsina-dihidratada del ácido (EDTA) para cubrir las células. Inactivación del tripsina-EDTA con 2 volúmenes de DMEM suplementado con 10% FBS y la transferencia de las células a un tubo estéril. Contar las células usando un contador de células automatizado (y la coloración con trypan azul). Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 minutos recuperar las células.</li>
		<li>Aspire el medio que contiene tripsina y reconstituir las células del medio de cultivo a una concentración de 2 x 105 células/mL. Usando una pipeta multicanal, transferir 100 μl de las células a cada pozo de una placa de 96 pocillos de blanco (opaco-abajo), que da una concentración final de siembra de 2 x 104 células/pozo. Nota: Para los experimentos iniciales, puede ser útil además de semilla de una hermana, placa de 96 pocillos de fondo claro, con el fin de controlar el crecimiento celular y la adhesión durante el protocolo y la guía solución de problemas futuros.</li>
		<li>Incube las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Preparar un plato principal de plásmidos en un formato de 96 pozos. Diluir cada plásmido en tampón de elución (Tris-HCl, pH 8,5) a 50 ng/μL en un pozo individual de una placa de 96 pocillos.<ol>
<li>Preparar 4 pozos para el control positivo (WT) plásmido8de plásmido de control negativo (S386A)8y buffer libre de plásmido (para simulacros transfecciones). Si drogas u otros tratamientos a base de celular están siendo planeadas, preparan la placa principal con el plásmido de control positivo (WT) en cada pocillo, junto con 4 pozos de cada uno de los plásmidos de control negativo (S386A) y el tampón libre de plásmido.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfección (día 1)
	<ol>
<li>Preparar la mezcla de transfección en un formato de placa de 96 pozos utilizando placas de deep-well de 96 pocillos. Realizar las transfecciones en triplicado, asegurándose de preparar los suficientes reactivos para tener en cuenta pérdidas de pipeteo y transferencia. Nota: Los cálculos siguientes preparan suficiente reactivo para correr una placa de 96 pocillos en triplicado (Estimado conservador para 420 pozos).<ol>
<li>Hacer una mezcla maestra de un reactivo de transfección de lípidos diluido, agregar 50,4 μL del reactivo a 2050 μl de suero reducido medio. Hacer una mezcla maestra de un reactivo de precomplexation de ADN, añadiendo 33,6 μl del reactivo en 1730 μl de suero reducido medio.</li>
			<li>Utilizando una pipeta multicanal, alícuota 16,8 μl de la mezcla de reactivo de precomplexation de ADN diluida en cada pocillo de la placa de la pozo profundo.</li>
			<li>Utilizando una pipeta multicanal, alícuota 3,2 μl (160 ng) de cada plásmido de la placa principal en cada pocillo de la placa de la pozo profundo.</li>
			<li>Usando una pipeta multicanal, alícuotas de 20 μl de la mezcla de reactivo de transfección lípidos diluido a cada bien de la placa y mezclar el contenido de cada pocillo utilizando la pipeta multicanal. Cubrir las placas y los deje reposar a temperatura ambiente (RT) por 10-15 min a formar complejos de lípidos: ADN. Nota: En la transfección, los componentes finales por pocillo será como sigue: 40 ng de ADN, 0.12 μl de reactivo de transfección y 0.08 μl del ADN pre-complejación reactivo y el contenido de cada bien será 10 μl volumen total (suero reducido medio).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Suavemente cambiar el medio en las células 293T en placas de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no para romper las células. Reemplazar el medio aspirado con 95 μl de DMEM suplementado con 10% FBS. Nota: Este sería un momento adecuado para tratar las células con cualquier fármaco de interés.</li>
		<li>Añadir 10 μl de la mezcla de transfección a cada correspondiente bien mediante una pipeta multicanal. Agitar suavemente la placa para mezclar el contenido en los pozos. Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO2 durante 24 h. Nota: El volumen final de los pozos llega a 105 μl, para tener en cuenta para la evaporación más de 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensayo (día 2)
	<ol>
<li>Preparar una solución stock de reactivos coelenterazine: ascorbato de sodio de 3 M [disuelto en tampón fosfato salino (PBS), preparado fresco] 5 M NaCl, 10 mg/mL de seroalbúmina bovina (BSA, disuelta en PBS, preparado fresco) y coelenterazine de 2 mM (disuelto en metanol acidificado con 200 μL de 3 HCl N / 10 mL). Nota: El coelenterazine de 2 mM se puede almacenar por 2 semanas cuando se guarda a-80 ° C y en ausencia de luz.</li>
		<li>Preparar los reactivos de x coelenterazine 2 para la lectura de la luciferasa, con un reactivo independiente de cada de las células y el medio, según la tabla 5. Primero se mezclan todos los reactivos excepto la coelenterazine, filtrar la mezcla a través de un filtro de jeringa 0,22 μm y agregue el coelenterazine. Proteger los reactivos de la luz hasta que están listos para añadirse a las placas. Nota: Debido a la pérdida de la solución de filtración, hacer suficiente reactivo para tener en cuenta tanto la pérdida de filtración, así como de las transferencias. Tabla 5 muestra la concentración final de los reactivos 2 x (así como la cantidad de solución madre a añadir para leer una placa de 96 pocillos con un reactivo).</li>
		<li>Eliminar las células de la incubadora 24 horas después de la transfección. Usando una pipeta multicanal, transfiera 50 μl de medio condicionado de cada pozo a una placa de 96 pocillos (opaca) fresca, con fondo blanco.<ol>
<li>Etiqueta de las placas en cuanto a si contienen células o medio. Si más de una placa de 96 pocillos se transfected, etiquete las placas para garantizar que cada placa de medio que contiene se empareja con su placa de la matriz de las células.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de 2 x coelenterazine no lítico reactivo a la placa que contiene sólo medio condicionado. Suavemente balancee o agitar la placa en la ausencia de luz durante 5-10 min a TA.</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl del reactivo de coelenterazine lítica de 2 x a la placa que contiene las células. Suavemente balancee o agitar la placa en la ausencia de luz durante 5-10 min a TA.</li>
		<li>Después de la incubación, lectura a la luminiscencia de la placa sólo por medio de un lector de placas. Luego, lee la luminiscencia de la placa que contiene la celda en el mismo lector de placas.</li>
		<li>Deseche las placas y guardar los archivos de análisis de datos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de los datos
<ol><li>Realizar un análisis de los datos iniciales utilizando el software de hoja de cálculo. Crear una hoja de cálculo que contiene los resultados de la célula y las placas de medio.</li>
	<li>Inspeccione manualmente los datos de las placas de la célula para identificar pozos mal transfected. Pozos que muestran &lt; 5% - 10% de la lectura del plásmido de control negativo (S386A) se debe considerar como mal transfected, haciendo la interpretación de los datos sospechosos.</li>
	<li>Calcular la luminiscencia del fondo promedio de cada plato de los pozos transfected mock. Restar el fondo de cada plato de los valores de esa placa. Nota: Este valor puede ser despreciable dependiendo del lector de placa utilizado.</li>
	<li>Proceso de los datos mediante el cálculo de la proporción de actividad de luciferasa en el medio en comparación con el conjunto de la actividad luciferasa para cada pozo. Porque la placa de la célula contiene ambos medio condicionado además de las células, y la placa sólo medio contiene la misma cantidad de medio condicionado como la placa de la célula, es conveniente utilizar la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> Aquí, RLU = unidades de luminiscencia relativa, la lectura resta de fondo desde el lector de la placa.</li>
	<li>Calcular la media luciferase secretado del control positivo (WT) y los pocillos de control negativo (S386A).</li>
	<li>Evaluar la calidad general del experimento mediante el cálculo de un factor Z de13: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> Nota: Los valores activos provienen del control positivo (WT) y los valores inactivos vienen de los pozos de control negativo (S386A). Valores más cercanos a 1 indican una mayor calidad de experimental. Considere repetir el experimento u optimizar el flujo de trabajo si el valor es inferior a 0.</li>
	<li>Transferir los datos desde el programa de hoja de cálculo en software de análisis de datos científicos.</li>
	<li>Normalizar la actividad de luciferasa secretada a los valores promedio de control positivo (WT) y el control negativo (S386A), ajuste el control positivo como 1 y el control negativo como 0.</li>
	<li>Limpiar los datos de outliers mediante el método de eliminación (derrota) de regresión y aislados, establecer la tasa máxima falso descubrimiento al 1%.</li>
	<li>Evaluar las diferencias estadísticamente significativas comparando los datos para cada condición mutante (o mutante) a la media de la actividad de la WT (normalizada a un valor de 1). Realizar múltiples desapareado t-tests, corrección de comparaciones múltiples con el método de Holm-Sidak y α = 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li>
<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los procedimientos experimentales descritos presentan un método para superar la actividad intrínsecamente baja de la facturación única proteasa PCSK9 y evaluar su función proteolítica de forma robusta. El concepto clave del análisis se basa en convertir un evento de facturación solo en una lectura enzimático amplificado. Las fortalezas del análisis incluyen el relativamente poco tiempo y facilidad de uso del reportero de luciferasa, así como su escalabilidad a los enfoques de alto rendimiento. Además, el ensayo evalúa la...

PCSK9 apunta el receptor de LDL (LDL-R) para la degradación, elevar el colesterol LDL (LDL-C) y conducir a enfermedad aterosclerótica del corazón1,2. Terapéutica dirigida a PCSK9 robusta reducir C-LDL y mejorar los resultados cardiovasculares de los pacientes, incluso cuando se añade a una agresiva terapia hipolipemiante con estatinas3,4. Sin embargo, las terapias actualmente aprobadas se limitan a enfoques basados en anticuerpos y sufren de falta de rentabilidad de5,6. Para resolver este problema, se necesitan alternativas terapéuticas menos costosos, a fin de identificar a los pacientes capaces de obtener mayores beneficios, o ambos.
Enfoques de molécula pequeña podrían objetivo intracelular PCSK9, proporcionan una mejor vía de administración y reducir los costos, haciendo que el "Santo Grial" en esta zona7. Sin embargo, PCSK9 ha probado difícil de droga por pequeñas moléculas. Como una proteasa, dirigida a la función proteolítica de PCSK9 es una estrategia atractiva, como uno mismo-proteólisis es el paso tarifa-limitador de PCSK9 maduración8 y se requiere para su máximo efecto sobre el LDL-R9. Hasta la fecha, sin embargo, esta estrategia no ha tenido éxito, probablemente debido a la bioquímica única de PCSK9: PCSK9 solamente sí mismo segmenta10, realizando una reacción single-facturación y después uno mismo-escote, la PCSK9 prodomain sigue siendo límite en el sitio activo como una auto-inhibidor11, impidiendo la lectura de cualquier otra actividad de proteasa.
Este artículo presenta un método para evaluar la función proteolítica PCSK9 en moda alto rendimiento8. Mediante mutagénesis sitio-dirigida, los investigadores pueden utilizar este análisis para los efectos de la codificación de SNPs encontradas la clínica para evaluar efectos sobre la proteólisis, el paso de limitación de velocidad de maduración PCSK9. Además, este método será útil en el diseño de pantallas de alto rendimiento para identificar moduladores de proteólisis PCSK9, que se prevén que, en definitiva, alterar la presentación de PCSK9 en el LDL-R (y modulan efectos hipercolesterolémicos de PCSK9) . Por último, este protocolo puede ser adaptado a otras proteasas con actividad intrínsecamente baja, siempre que i) un par de sustrato-proteasa específica puede encontrarse, y ii) un anclaje intracelular adecuado puede establecerse para el substrato.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR EE</td><td>. UU. Scientific</td><td>1402-2900</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Q5 Inicio en caliente</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td> Mezcla de solución de desoxinucleótidos de <td>ADN polimerasa de alta fidelidad</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTP (para PCR)</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Autores</td><td>n/a</td><td>Disponible de los autores</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Autores</td><td>n/a</td><td>Disponible de los autores</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>Para geles de ADN</td></tr><tr><td>E-Gel Imager System with Blue</td> Light <td>Base ThermoFisher Scientific</td><td>4466612</td><td>Para la obtención de imágenes de geles de ADN</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel</td><td>Stain ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Para geles de ADN</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Para tampón de rodadura de gel de ADN</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Para tampón de rodadura de gel de ADN</td></tr><tr><td>Solución de ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, para tampón de rodadura de gel de ADN</td></tr><tr><td>1 kb Escalera de ADN</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D010</td><td>Escalera de ADN</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Enzima de restricción</td></tr><tr><td>Placas de agar LB con 100 &micro; g/mL de carbenicillina</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Placas de carburador One</td></tr><tr><td>Shot Mach1 T Resistente a los fagos Químicamente competente E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>Células químicamente competentes</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-5</td><td>Antibiótico</td></tr> <tr>selectivo<td>E.Z.N.A. Mini Kit de plásmido I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>Purificación de ADN Miniprep</td></tr> kit <tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotómero</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>Espectrofotómetro</td></tr><tr><td>293T Cells</td><td>Colección Americana de Cultivos de Tejidos (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>Células HEK 293T</td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, célula de mamífero medios</td></tr><tr><td>de comunicación Suero fetal bovino</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>25300062 Trypsin, para la disociación celular</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Recuento de células automatizado</td></tr><tr><td>Portaobjetos para cámara de recuento de células Countess</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Portaobjetos para el recuento de células</td></tr><tr><td>CELLSTAR Placas de cultivo de tejidos, blancas, de fondo blanco, con tapa</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>Blanco, de fondo blanco Placa de 96 pocillos</td></tr><tr><td>TempPlate sin faldón Placa de PCR de 96 pocillos, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596 Placa de</td><td>96 pocillos para placa de plásmido maestro</td></tr><tr><td>Nunc 2.0mL DeepWell Placas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>278743</td><td>96 pocillos placa de pocillo profundo</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Reactivo de transfección de lípidos, Lf3K</td></tr><tr><td>Reactivo P3000 Reactivo</td> de precomplejación de ADN <td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>, provisto de Lf3K</td></tr><tr><td>OptiMEM I Medio de suero reducido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Medio de suero reducido para transfección</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4034</td><td>Ascorbato</td></tr><tr><td>de sodio Cloruro de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albúmina, Suero bovino, Fracción V, Bajo contenido de metales pesados</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>HCl Concentrado</td></tr><tr><td>Celenterazina Oro</td><td>Biotechnology</td><td>CZ2.5</td><td>Sustrato de luciferasa</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, estéril</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Filtro estéril, PVDF, 0.22 y micro; m poro</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipeta L12-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013810</td><td>Pipeta multicanal</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipeta L12-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013808</td><td>Pipeta multicanal</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipeta L12-10XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013807</td><td>Pipeta multicanal</td></tr><tr><td>Depósito de reactivos</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Comedero para reactivos</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12 Tubos de</td><td>15</td></tr><tr><td>mL Tubos de centrífuga, 50 mL</td><td>Tubos de Corning</td><td>430829</td><td>50 mL Lector de</td></tr><tr><td>microplacas Spark Tecan</td><td></td><td>N/A</td><td>Lector de placas</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016 para Mac</td><td>Software de hoja de cálculo</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v7</td><td>Software de análisis de datos científicos</td></tr></tbody></table>

un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa pcsk9

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Cualquiera convertasa subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de facturación solo que regula los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y, en consecuencia, las enfermedades cardiovasculares. Aunque PCSK9 proteólisis se requiere para su efecto completo hipercolesterolémicos, la evaluación de su función proteolítica es un reto: PCSK9 sólo es conocido por sí mismo allegarse se somete sólo un volumen único y después de la proteólisis, conserva su sustrato en su sitio activo como inhibidor de auto. Los métodos presentados aquí describen un ensayo que supera estos desafíos. El análisis se centra en la proteólisis intermolecular en un contexto basado en la célula y escote acertado enlaces a la actividad de luciferasa secretada, que puede ser fácilmente leída hacia fuera en el medio condicionado. Mediante pasos secuenciales de mutagénesis, transitorios de la transfección y una lectura de luciferasa, el ensayo puede probar PCSK9 proteólisis en condiciones de perturbación ya sea genética o molecular de un modo de alto rendimiento. Este sistema es idóneo para ambos la evaluación bioquímica de clínicamente descubierto sin sentido solo polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), así en cuanto a la proyección de los inhibidores de molécula pequeña de proteólisis PCSK9.

El ensayo de proteólisis de alto rendimiento se basa en superar tres grandes retos. En primer lugar, para superar la salida intrínsecamente baja de una proteasa PCSK9 de solo volumen, una proteasa PCSK9 carecer la inhibitoria prodomain se utiliza, con la secuencia de escote en la cola de la prodomain vinculada a una luciferasa que puede ser secretada14. En segundo lugar, para satisfacer la necesidad de que la proteasa doblar en complejo con su inhibitoria prodomain...

Este protocolo presenta un método para evaluar la actividad proteolítica de una proteasa de rotación intrínseca baja actividad, solo en un contexto celular. Específicamente, este método se aplica para evaluar la actividad proteolítica de PCSK9, un factor clave del metabolismo de los lípidos cuya actividad proteolítica se requiere para su última función hipercolesterolémicos.

Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica de PCSK9, como qué fármacos o cambios genéticos afectan a la función proteolítica de PCSK9. La principal ventaja de esta técnica es que permite una lectura rápida y amplificable de un evento bioquímico de baja frecuencia intrínseca. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la cardiopatía aterosclerótica porque la función proteolítica de PCSK9 es necesaria para su efecto final sobre los niveles de colesterol sérico.Aunque este método puede proporcionar información sobre la PCSK9 en sí, también se puede aplicar a otros sistemas bioquímicos, como otras proteasas con una actividad proteolítica intrínsecamente baja. Para comenzar, aspire el medio de cada célula T HEK293. Lavar con PBS y tratar con el volumen mínimo de 0,5% de tripsina-EDTA.E incubar a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos para disociar las células del matraz principal. Añadir dos volúmenes de DMEM suplementado con 10%FBS para inactivar la tripsina-EDTA. A continuación, pipetear el líquido del matraz hacia arriba y hacia abajo varias veces, desalojando las células adherentes y transfiriendo las células a un tubo esté

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Investigación

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Bioquímica

El video muestra el ensayo de luciferasa utilizado para cuantificar proteínas marcadas con luciferasa. El ensayo utiliza una enzima luciferasa modificada genéticamente compuesta por un fragmento grande que se une con el fragmento pequeño, que se conjuga con una proteína de interés. Las subunidades unidas forman una enzima activa que, en presencia del sustrato, libera una señal luminiscente. A continuación, esta señal se cuantifica mediante un luminómetro.

El ensayo de luciferasa: un ensayo de alto rendimiento para medir señales luminiscentes utilizando bioreporteros basados en sistemas de nanoluciferasa de ingeniería

Este video muestra un ensayo para detectar la actividad proteolítica de las proteasas utilizando péptidos fluorogénicos. La proteasa reconoce su sitio de escisión en el péptido, escindiéndolo y separando el extinguidor del fluoróforo, lo que permite su emisión de fluorescencia. La señal de fluorescencia se detecta y analiza para comprobar la eficiencia de escisión de diferentes variantes de péptidos.

Un ensayo de escisión de péptidos fluorogénicos para detectar la actividad proteolítica de las proteasas

Este video muestra el procedimiento de medición de la actividad de la γ-secretasa en células humanas modificadas genéticamente utilizando un sistema inducible por tetraciclina. El proceso consiste en inducir la expresión génica de APP con tetraciclina, generar péptidos β amiloide y activar la producción de luciferasa. A continuación, se mide la bioluminiscencia resultante de la reacción luciferasa-sustrato, reflejando la actividad de la γ-secretasa.

Ensayo de luciferasa para medir la actividad de la γ-secretasa en células humanas

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Este informe describe protocolos para medir las tasas de degradación de proteínas mal plegadas mediante Western blot o ensayos basados en fluorescencia. Los métodos se pueden aplicar al análisis de otras proteínas mal plegadas y para el cribado de alto rendimiento.

Los ensayos para la degradación de proteínas en células de mal plegadas

Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.

Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

Aquí presentamos un biosensor basado en luciferase para cuantificar la actividad quinasa de supresor de tumor grande (LATS)-una quinasa central en la vía de señalización de hipopótamo. Este biosensor tiene diversas aplicaciones en investigación básica y traslacional destinada a investigar Hippo vía reguladores en vitro e in vivo.

Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)

Aquí, presentamos el procedimiento detallado de una plataforma de ensayo de proteasa recientemente desarrollado utilizando N-terminal hexahistidine/maltosa-proteína y sustratos recombinantes fusionado a la proteína fluorescentes Unidos a la superficie de níquel nitrilotriacético perlas de agarosa magnética ácido. Un posterior análisis en gel de las muestras de ensayo separados por electroforesis dodecyl del gel del sulfato-poliacrilamida del sodio también se presenta.

Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Aprende a evaluar la actividad proteolítica de PCSK9 mediante un ensayo de luciferasa de alto rendimiento en células HEK293 T. Esta técnica permite detectar eventos bioquímicos de baja frecuencia con lecturas amplificables y rápidas.

Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

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