Name: Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a generar mutantes de deleción en Escherichia coli mediante transducción con bacteriófago P1 usando casetes de resistencia a antibióticos. Este protocolo rápido y confiable facilita el estudio de funciones génicas.

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Se obtuvieron cepas de colección de Keio del proyecto nacional de BioResource (NIG, Japón): e. coli. Agradecemos a Dirk Linke (Departamento de ciencias biológicas, Universidad de Oslo) por su continuo apoyo. Este trabajo fue financiado por el Consejo de investigación de Noruega joven investigador subsidio 249793 (Jack C. Leo).

1. las cepas y plásmidos
<ol><li>
Cepas bacterianas
	<ol>
<li>Uso de la e. coli cepas BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20y BL21ΔABCF21. Para más información ver la Tabla de materiales .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bacteriófagos
	<ol>
<li>Utilice el fago P1vir para la transducción general. Almacenar el phage como un líquido con unas gotas de cloroformo (ver paso 2.2). Para obtener más información, vea Tabla de materiales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plásmidos
	<ol>
<li>Utilice el siguiente plásmidos en este protocolo: pCP2022, pIBA2-YadA23y pEibD1024. Plásmidos de control, utilizar IBA2 pASK y pET22b (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condiciones de crecimiento
	<ol>
<li>Propagar las bacterias en un medio25 de lisogenia caldo (LB) con vigoroso (180 – 200 rpm) a 37 ° C o 30 ° C en el caso de las cepas que contienen pCP20 y BL21ΔABCF.</li>
		<li>Realizar plásmido curado a 43 ° C.</li>
		<li>De un medio sólido, suplemento LB con agar al 1% (p/v).</li>
		<li>Para top agar, suplemento LB con 0,7% de agar y 10 mM de CaCl2 y autoclave el medio. Medio SOC de uso para la recuperación después de la electroporación26.</li>
		<li>Utilizar las siguientes concentraciones de antibióticos: 100 μg/mL de Amp y 25 μg/mL para el Kan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de un lisado de fagos
<ol><li>
Infección de la cepa donante
	<ol>
<li>Crecer la cepa donante JW4197 en 5 mL de medio LB suplementada con 10 mM de CaCl2 y opcionalmente con Kan (25 μg/mL) a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Mide el valor de OD600 usando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Hacer una serie de diluciones de un stock de fagos P1 existente en el medio LB: recomienda diluciones son entre 10-3 a 10-7.</li>
		<li>Mezcla 200 μL de la suspensión bacteriana y 100 μL de una dilución de phage dado en un tubo de centrífuga de 15 mL o equivalente. Preparar tantos tubos como diluciones de fago. Incubar los tubos durante 20 min a 37 ° C sin agitación.</li>
		<li>Añadir 3 mL de agar superior fundida (~ 50 ° C) suplementado con 10 mM de CaCl2 en los tubos, homogeneizar el contenido con un vórtex los tubos poco y vierta la mezcla en placas LB precalentadas para hacer capas incluso.</li>
		<li>Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de lisado
	<ol>
<li>Al día siguiente elegir un plato con un semi-confluente crecimiento de placas de fagos. En un plato semi confluente, aproximadamente la mitad la superficie de la placa es evidente (figura 3).</li>
		<li>Raspar la capa de agar superior de dicha placa con un asa de inoculación o una herramienta similar y colocar el agar superior en un tubo de centrífuga. Añadir 1-2 mL de LB y una gota de cloroformo y agitar el tubo vigorosamente durante ~ 1 min agregar el cloroformo en una campana de humos.</li>
		<li>Centrifugar el tubo durante 15 min a 4.000 x g o más rápido para que sedimenten las células bacterianas y agar.</li>
		<li>Pasar el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco, evitando transportar cualquier residuo de la pastilla. Añadir 2 gotas de cloroformo y almacenar el lisado a 4 – 10 ° C. Añadir cloroformo en una campana de humos. No congele el phage lisado, esto resultará en una reducción significativa del número de partículas infecciosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar el título del lisado
	<ol>
<li>Crecer BW25113 en LB suplementado con 10 mM de CaCl2 a 37 ° C hasta que el cultivo alcanza un OD600 de ~ 1.0.</li>
		<li>Preparar una serie de diluciones de los fagos lisado en LB (p. ej., 10-6-10-9). Nota: Tenga cuidado al pipetear la muestra desde la parte superior del lisado para evitar transferencia de cloroformo a las diluciones.</li>
		<li>Mezcla 200 μL de la suspensión bacteriana y 100 μL de una dilución de phage dado en un tubo de centrífuga de 15 mL o equivalente. Preparar tantos tubos como diluciones de fago. Incubar los tubos durante 20 min a 37 ° C sin agitación.</li>
		<li>Añadir 3 mL de agar superior fundida (~ 50 ° C) suplementado con 10 mM de CaCl2 en los tubos, homogeneizar el contenido con un vórtex los tubos poco y vierta la mezcla en placas LB precalentadas para hacer capas incluso.</li>
		<li>Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.</li>
		<li>Al día siguiente cuenta el número de placas (regiones claras en la placa bacteriana) para cada placa y calcular el título del lisado mediante la fórmula siguiente: <img alt="Fórmula del título viral: Título (ufp/ml) = Σplacas/diluciones × factor de recubrimiento." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> Ejemplo: En las placas de las diluciones 10-710-8y 10-9, hay 231, 27 y 2 placas, respectivamente. 100 μL de cada dilución se utilizó para la infección, y porque el título se expresa como placa formando unidades (pfu) / mL, el factor de la galjanoplastia es 10. Estos números se introducen en la fórmula: <img alt="Cálculo del título viral utilizando unidades formadoras de placa (ufp), fórmula, gráfico de análisis de datos virológicos." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> Así, el título es aproximadamente 2 x 1010 infecciosas fagos partículas/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 transducción
<ol><li>
Preparación de las células del receptoras
	<ol>
<li>Crecer la cepa receptora BL21ΔABCF en LB complementado a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Use un espectrofotómetro para medir el valor de OD600 .</li>
		<li>Calcular el volumen del lisado de fagos para alcanzar una multiplicidad de valor de infección (MOI) de 0,5. Para calcular el MOI, estimar el número de bacterias basado en OD600 de la cultura. Asume que un valor de600 OD de 1.0 corresponde a ~ 109 UFC/mL. Calcular el volumen requerido basado en el conocido título del lisado. Ejemplo (basado en la concentración calculada en el ejemplo después paso 2.3.6): <img alt="Fórmula de cálculo del título de fagos V = (número de fagos) / (título de lisado) con conversión a μL." src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
		<li>Añadir CaCl2 a la cultura receptora cepa a 10 mM y mezclar. Tomar 1 mL del cultivo para la transducción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar la transducción de señales
	<ol>
<li>Añadir el volumen adecuado de lisado de fagos a 1 mL de la cultura receptora (incluyendo CaCl2 a 10 mM) calculado en el paso 3.1.2 y mezclar suavemente. Nota: Tenga cuidado al pipetear la muestra desde la parte superior del lisado para evitar transferencia de cloroformo a la mezcla.</li>
		<li>Estáticamente, incubar la mezcla por 20 min a 37 ° C.</li>
		<li>Detener la infección mediante la adición de citrato de sodio, pH 5.5, a 100 mM.</li>
		<li>Centrifugue las bacterias (5.000 x g durante 2 min) Quite el sobrenadante y resuspender en 1 mL de LB fresco suplementado con citrato de sodio 100 mM, pH 5,5.</li>
		<li>Lavan las células dos veces más que en el paso 3.2.4 para la eliminación de calcio y phages gratis.</li>
		<li>Resuspender las bacterias en 1 mL de LB fresco suplementado con citrato de sodio 100 mM, pH 5,5. Incubar las bacterias a 30 ° C por 1 h con agitación (&gt; 100 rpm).</li>
		<li>Recoger las bacterias por centrifugación (5.000 x g durante 2 min) y resuspender en ~ 100 μL de LB con citrato de sodio 100 mM, pH 5,5.</li>
		<li>Trasmitir las bacterias en una placa LB suplementado con Kan en 25 μg/mL y citrato de sodio 10 mM, pH 5,5 y crecer las bacterias a 30 ° C hasta que las colonias (~ 24 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selección de las transductants
	<ol>
<li>Una vez que las colonias han crecido en la placa de selección, les restreak LB + Kan solo colonias y crecen a 30 ° C hasta que las colonias solo aparecen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. suprimir el cassette de Kan
<ol><li>
La transformación con el plásmido de recombinación
	<ol>
<li>Realizar el espectro de tensión de BL21ΔABCF Kan-resistente.<ol>
<li>Crece la tensión de una sola Colonia en fresco LB (5 mL) complementado con Kan (25 μg/mL) a 30 ° C hasta que el OD600 ~0.5 – 0,7.</li>
			<li>De aquí en adelante, llevar a cabo los siguientes pasos a 4 ° C o en hielo. Centrifugue las bacterias (5.000 x g por 10 min) y eliminar el sobrenadante.</li>
			<li>Lavar el precipitado con agua destilada helada de células dos veces repitiendo el paso anterior de centrifugación y, finalmente, Resuspender el precipitado de células en 100 μl de helada glicerol al 10%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enfriar cubetas de electroporación de 1 mm en el hielo.</li>
		<li>Añadir 1 pg de ADN (pCP20) plásmido a la suspensión de células, mezclar suavemente la suspensión y transferir a una cubeta de electroporación refrescado.</li>
		<li>Establecer la electroporator a 1,8 kV y electroporate las células.</li>
		<li>Rescatar las células transformadas agregando 1 mL de medio SOC y creciendo por 1 h a 30 ° C.</li>
		<li>Placa de 100 μl de las células en LB + Amp placas y crecen las células en 30 ° C durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inducción de la recombinación
	<ol>
<li>Colonias solo Pick LB + amplificador de la placa e inoculan fresco LB omitiendo todos los antibióticos.</li>
		<li>Crecen las células a la temperatura no permisiva (43 ° C) durante la noche para inducir la expresión de recombinase FLP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selección de recombinantes
	<ol>
<li>Hacer diluciones seriadas y 50 μl de una dilución de6 5-10 10 en placas no selectivo de la placa y crecer durante la noche a 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. verificación de la canceladura del Gene
<ol><li>
Verificación de la pérdida del plásmido y recombinación exitosa
	<ol>
<li>Racha solo las colonias de las placas de preparado en el paso 4.3.1 en Kan, LB, LB + Amp y las placas LB sin antibióticos, en este orden. Para ayudar en las rayas, utilice una rejilla de Colonia (véase la archivo adicional 1). Crecen las placas a 30 ° C hasta que las colonias (~ 24 h).</li>
		<li>Recoger 10-20 clones que han crecido en la placa no selectivo pero no crecen en medios selectivos para mayor verificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificación adicional de colony PCR
	<ol>
<li>Realizar una colonia PCR con cebadores que flanquean el tamA secuencia de codificación (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Preparar una mezcla PCR master. La cantidad de mezcla necesitada depende del número de colonias a ser probado (ver ejemplo en tabla 1). Mezclar los reactivos en el hielo, añadir la polimerasa de la última.</li>
		<li>Homogeneizar la mezcla PCR master y dispensar 20 μl en tubos de una tira PCR. Recoger una pequeña cantidad de cada colonia para ser proyectada utilizando una pipeta estéril y añadir a un tubo. No olvide incluir la cepa receptora original para la comparación. Opcionalmente, también incluyen la cepa donante.</li>
		<li>Ejecutar una reacción de PCR (ver tabla 2 para el programa utilizado).</li>
		<li>Preparar un gel de agarosa al 1%.<ol>
<li>Para un gel de 50 mL, medir de 0.5 g de agarosa y añadir 50 mL de buffer TAE (40 mM Tris, ácido acético al 20 mM y 1 mM EDTA, pH 8.0). Calienta la mezcla en el microondas hasta que se disuelva la agarosa todos.</li>
			<li>Una vez que la agarosa se disuelva, enfriar la solución a aproximadamente 50 ° C y luego añadir 5 μL de ADN tinción colorante. Mezcle bien la solución y verterla en una bandeja de gel en una cámara de fundición. Introduzca una o más filas de peines bien hay pozos suficientes para todas las muestras, así como marcadores de tamaño molecular. Permita que el gel para 30 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Una vez finalizado el plazo de la polimerización en cadena, añadir 4 μL de 6 x tinte carga de ADN a cada muestra. Colocar el gel en la cámara de electroforesis y añadir Tampón TAE hasta que los pozos están cubiertos.</li>
		<li>Aplicar 10-15 μl de cada reacción de PCR a un pozo en el gel. También añadir 5 μl del marcador de tamaño molecular. A continuación, ejecute el gel durante 30 minutos a 75 V.</li>
		<li>Una vez finalizado el plazo, el gel utilizando a un sensor de luz azul de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. otras técnicas
<ol><li>
Expresión de la proteína Nota: La expresión de proteínas de la prueba (YadA y EibD) ha sido descrito en detalle en otra parte23,24. Este es un breve resumen de los pasos principales.<ol>
<li>Transformar BL21ΔABCF ΔtamA with la plásmidos necesaria (YadA pIBA2 y pEibD10 y la plásmidos de control correspondiente) y seleccione transformantes en LB + Amp.</li>
		<li>Para la expresión de la proteína, inocular 100 mL de medio LB + Amp con 1 mL de un cultivo durante la noche de bacterias transformadas y crecer a 30 ° C hasta la fase de registro medio, momento en el que, inducir la producción de proteína con cualquiera de los dos anhydrotetracycline (a 100 ng/mL) o thiogalactoside de isopropilo (a 0,5 mM).</li>
		<li>Después de 2 h de la inducción a 30 ° C, medir la turbidez de los cultivos y recolectar un número de células correspondientes a 50 mL en OD600 = 1.0 por centrifugación de los cultivos durante 15 min a 4.000 x g. Lavar el sedimento 1 x con 10 mM HEPES, pH 7,4 y luego o bien almacenarlo a-20 ° C o proceso adicional como en el paso 6.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extracción de la membrana externa Nota: La extracción de la membrana externa se realiza como se describe en detalle por León et al. 27. a continuación se resumen los pasos principales.<ol>
<li>Resuspender el precipitado de células en 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, complementado con 10 mM MgCl2 MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) y una pizca de ADNasa I.</li>
		<li>Lyse las células (e.g., usando un batidor de grano).</li>
		<li>Centrifugar las células poco (2 min a 15.600 x g) para eliminar restos celulares y trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo.</li>
		<li>Centrifugar las células durante 30 min a 16.000 x g, después de lo cual, Resuspender el pellet en 400 μL de 1% N-lauroil sarcosina en 10 mM HEPES, pH 7,4.</li>
		<li>Incubar las células con agitación durante 30 min a temperatura ambiente, después de lo cual, centrifugar por 30 min como el anterior.</li>
		<li>Lave el translúcido pellet 1 x con 200 μL de 10 mM HEPES, pH 7,4, resuspender en 30 μL de 10 mM HEPES y añade 10 μL de tampón de SDS-PAGE 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensayos de actividad Nota: Realizar los análisis de SDS-PAGE y actividad para YadA y EibD descrito28. A continuación se resumen los pasos principales.</li>
	<li>
SDS-PAGE
	<ol>
<li>Calentar las muestras a 50 ° C durante 5 minutos antes de cargar en un gel de poliacrilamida, para evitar la desnaturalización de las proteínas.</li>
		<li>Después de la separación en SDS-PAGE, transferir las proteínas a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno.</li>
		<li>Después de la transferencia, bloquear la membrana con 2% de polvo de leche desnatada en PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YadA-colágeno lejos-de western blot
	<ol>
<li>Después de los bloqueos, añadir colágeno bovino tipo que diluido en solución amortiguadora de bloqueo a una concentración de 10 μg/mL e incubar la membrana para 1 h.</li>
		<li>Lavar la membrana 2 x con PBS + 0.05% Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>Añadir el anticuerpo primario (monoclonal anti colágeno COL-1) a la membrana, 1:2,000 diluido en solución amortiguadora de bloqueo.</li>
		<li>Después de incubar la membrana durante 1 hora, lavar 2 x como se menciona en el paso 6.3.2.2 y luego añadir el anticuerpo secundario [cabra anti-ratón IgG conjugado-rábano peroxidasa (HRP)], diluido 1: 10,000 en solución amortiguadora de bloqueo.</li>
		<li>Incubar la membrana durante 1 hora, luego lavar x 2 con PBS-T. Añadir un sustrato quimioluminiscente mejorado a la membrana según las instrucciones del fabricante y detectar la banda usando una cámara CCD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
IgG por EibD ensayo obligatorio
	<ol>
<li>Después de los bloqueos, añadir un anticuerpo secundario (cabra anti-conejo HRP), diluido 1:2,000 en solución amortiguadora de bloqueo.</li>
		<li>Incubar la membrana durante 1 hora, luego lavar x 2 con PBS. Realizar la detección quimioluminiscente como se menciona en el paso 6.3.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Transducción de P1 es un método rápido, robusto y fiable para la generación de canceladuras del gene de e. coli. Esto se demuestra aquí por transducción de un mutante de eliminación de tamA de una cepa de Keio donante a un beneficiario derivado BL21. Las principales etapas en el proceso de transducción de señales son la producción de la transducción de lisado, la transducción de sí mismo, la supresión de los cassettes de resistencia de Kan y la verificación del knock-out por PCR. En total, el proceso to...

Una primera aproximación común para estudiar la función de un gen es realizar mutagénesis de knock-out y observar el fenotipo resultante. Esto también se llama genética reversa. La bacteria e. coli ha sido el caballo de batalla de la biología molecular durante los últimos años 70 o así, debido a la facilidad de su cultivo y su receptividad a la manipulación genética1. Varios métodos han sido desarrollados para producir deleciones del gen en e. coli, incluyendo marcador cambio mutagénesis2,3 y, más recientemente, recombineering usando la λ rojo o ET Rac sistemas4,5 , 6.
En un sistema ampliamente utilizado, secuencias de codificación de genes individuales se sustituyen por una cinta de resistencia a los antibióticos que más adelante puede ser suprimida del cromosoma5,7. Las secuencias de codificación son sustituidas, por ejemplo por una cinta de resistencia kanamicina (Kan), que es flanqueada por los sitios de destino (FRT) flippase (FLP) reconocimiento a ambos lados. Los sitios FRT son reconocidos por el recombinase FLP, que media específica recombinación entre los sitios FRT conduce a la supresión de la cassette de Kan. De esta manera, se logra un borrado completo de la secuencia de codificación de un gen determinado, dejando sólo una secuencia mínima cicatriz de aproximadamente 100 pares de bases (PB) (figura 1).
A poco más de una década atrás, se desarrolló la llamada colección de Keio. Se trata de una biblioteca bacteriana basada en un estándar de laboratorio cepa K12 de e. coli , donde casi todos los genes no esenciales fueron borrados individualmente por λ recombinación rojo7,8. Los clones dentro de cada colección tienen una secuencia de codificación substituida con una cinta de resistencia los Kan. La colección de Keio ha demostrado para ser una herramienta útil para muchas aplicaciones9. Un tal uso es la producción de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . El cassette de Kan de un clon de eliminación dada puede ser movilizado por transducción generalmente de bacteriófagos, como P110,11,12,13,14. Un stock de fagos preparado a partir de tal tensión puede utilizarse para infectar a un recipiente e. coli cepa de interés, donde en una frecuencia baja pero confiable el Kan región que contiene el cassette puede ser incorporado en el genoma receptor por recombinación homóloga (Figura 2). Transductants pueden ser seleccionados para el crecimiento en el medio que contiene Kan. Después de esto, si se desea el retiro de la cinta de resistencia a los antibióticos, el recombinase FLP se puede suministrar a la cepa transductant en trans. Después de curar el plásmido que contiene el FLP, que lleva un marcador de resistencia a ampicilina (Amp), clones de Kan y sensible a Amp son evaluados para, y la supresión correcta de la secuencia de codificación de tipo salvaje y el cassette de Kan son verificados por PCR de Colonia.
Aquí, se presenta un protocolo detallado, describiendo cada uno de los pasos en la producción de un knock-out cepa de e. coli , basado en la estrategia que se ha señalado anteriormente. Por ejemplo, se demostró una canceladura del gene del tamA . tamA codifica una proteína de β-barril de membrana externa que es una parte del transporte y montaje módulo (TAM), que participa en la biogénesis de ciertas proteínas autotransporter y pili15,16,17. Esta cepa knock-out entonces fue utilizada para examinar el efecto de la supresión de tamA en la biogénesis de dos autotransporter trímero adhesinas (TAAs), la adhesina de Yersinia YadA y la inmunoglobulina (Ig) de la e. coli -vinculante EibD TAA 18,19.

<table><tbody><tr><td><Cepas > fuertes</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Cepa salvaje de Keio collection</td></tr><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Cepa de expresión</td></tr><tr><td>E. coli BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derivado de BL21(DE3)</td></tr><tr><td>E. coli JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><<td>em>tamA mutante</td></tr><tr><td>P1 vir</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Bacteriófagos generalmente transductores</td></tr><tr><td><fuertes>plásmidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>plásmido de replicación condicional con FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>vector de expresión</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>para la producción de EibD; plásmido disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>vector de expresión</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>para la producción de YadA; plásmido disponible bajo pedido</td></tr> <tr><td>Chemicals</ácido</td> acético fuerte><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhidrotetraciclina</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anticolágeno tipo I COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno bovino tipo I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato disódico</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de ADN</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de tamaño molecular de ADN</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP sustrato</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-ratón IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-conejo IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Tiogalactósido de isopropilo</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Liquem</td> de<td>kanamicina</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Liquem de lisozima</td><td></td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>N- lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>tamA imprimación directa</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Secuencia 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'</td></tr><tr><td>tamA imprimación inversa</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Secuencia 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq</td></tr> <tr><td>ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>Agarose gel cámara de electroforesis Hoefer SUB13 Batidor de perlas Thermo FP120A-115 Cámara CCD Kodak 4000R Cubetas de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td>Generador de</tr><tr><td></td><td></td><td></td> imágenes en gel <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubación</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Horno microondas</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>Máquina</td><td></td><td></td> de PCR Biometra Tpersonal <td></td></tr><tr><td></td><td>Medidor</td><td>de pH Axygen PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG cámara de electroforesis</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de transferencia húmeda</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

producción de canceladuras del gene en escherichia coli por transducción de p1 con casetes de resistencia a los antibióticos

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Una primera aproximación al estudio de la función de un gen desconocido en bacterias es crear un knock-out de este gen. Aquí, describimos un protocolo robusto y rápido para la transferencia de mutaciones de la canceladura de genes de una cepa de Escherichia coli a otra mediante la transducción generalizada con el bacteriófago P1. Este método requiere que la mutación sea seleccionable (p. ej., basado en interrupciones del gen mediante inserciones de cassette antibiótico). Tales cintas antibióticas pueden movilizar de una cepa donante e introducen en una cepa receptora de interés rápidamente y generan fácilmente un mutante de canceladura del gene. El cassette de antibiótico puede diseñarse incluir flippase sitios de reconocimiento que permiten la supresión de la cinta por un recombinase específico para producir un knock-out limpiado con sólo una secuencia de ~ 100-base-par-larga cicatriz en el genoma. Demostrar el Protocolo por la anulación del factor conjunto implicado en la biogénesis autotransporter la codificación del gene de tamA y probar el efecto de esta eliminatoria en la biogénesis y la función de dos autotransporter trímero adhesinas. Aunque la canceladura del gene por transducción P1 tiene sus limitaciones, la facilidad y rapidez de su aplicación hacen una alternativa atractiva a otros métodos de canceladura del gene.

Generación de un tamA Knock-out de BL21ΔABCF:
La estrategia mencionada anteriormente se ha utilizado para producir una cepa derivada de BL21(DE3), una cepa de laboratorio estándar utilizada para la producción de la proteína, que es optimizada para producción de proteínas de membrana externa y llamada BL21ΔABCF21. Esta cepa carece de cuatro genes que codifican para proteínas de membrana externa abund...

Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Este método es útil en el campo de la Microbiología, como averiguar las funciones de genes específicos. La principal ventaja de este método es que es una forma rápida y fiable de generar mutantes knockout de E. Coli. Para demostrar este procedimiento estará Thomas Trunk, un estudiante graduado de mi laboratorio.Para infectar una cepa donante que contiene una deleción génica basada en un casete de antibióticos sujetos a impuestos especiales, primero se deben cultivar las bacterias en cinco mililitros de caldo de lisogén, o LB, con diez milimolares de cloruro de calcio y, opcionalmente, con 25 microgramos por mililitro de kanamicina, hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de aproximadamente 1,0. Realice una serie de diluciones de un stock de fagos P1 existente en el medio LB y mezcle 200 microlitros de la suspensión bacteriana con 100 microlitros de cada dilución de fagos en tubos de centrífuga individuales de 15 mililitros. Incubar los tubos estáticamente durante 20 minutos a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, agregue aproximadamente tres mililitros de agar superior fundido, suplementado con diez milimolares de cloruro de calcio a los tubos. Mezcle el contenido por vórtice y vierta las mezclas en placas LB precalentadas para hacer capas uniformes. Luego, incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados.A la mañana siguiente, seleccione una placa con un crecimiento semiconfluente de placas de fagos y use un asa de inoculación para raspar la capa superior de agar en un tubo de centrífuga. Debajo de la campana extractora, agregue uno o dos mililitros de LB y una gota de cloroformo al tubo, y agite el tubo vigorosamente durante un minuto. Granular el agar y las células bacterianas por centrifugación y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga, evitando los residuos del pellet.Luego, agregue dos gotas de cloroformo y almacene el lisado a cuatro a diez grados centígrados. Para la transducción P1, cultive la cepa receptora en LB a una densidad óptica de uno a 600 nanómetros y agregue cloruro de calcio al cultivo de la cepa receptora a diez milimolares con mezcla. A continuación, agregue el volumen adecuado de lisado de fagos desde la parte superior de la muestra para evitar transferir el cloroformo a un mililitro de cultivo receptor para lograr una multiplicidad de infección de 0,5, e incube estáticamente la mezcla durante 20 minutos a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, detenga la infección agregando citrato de sodio a 100 milimoles por litro y centrifuga las bacterias transducidas. La adición de citrato de sodio después de la transducción es un paso esencial, ya que evita una mayor infección por fagos de bacterias de tipo salvaje. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de LB fresco suplementado con citrato de sodio 100 milimolares y lave las células dos veces más para asegurar la eliminación de los fagos libres y el calcio.Después del último lavado, vuelva a suspender las bacterias en un mililitro de LB fresco, suplementado con citrato de sodio 100 milimolar. para una incubación de una hora a 30 grados centígrados a 100 RPM. Al final de la incubación, recoja las bacterias por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en unos 100 microlitros de LB suplementado con citrato de sodio de 100 milimolares.Luego, esparce las bacterias en una placa LB suplementada con 25 microgramos por mililitro de kanamicina y citrato de sodio diez milimolares, y cultiva las bacterias a 30 grados centígrados hasta que aparezcan las colonias. Para seleccionar los transductores, vuelva a colocar las colonias en nuevas placas de LB más kanamicina para el crecimiento de una sola colonia a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias individuales. Para extirpar el casete de kanamicina, haga que la cepa receptora resistente a la kanamicina sea electrocompetente.Agregue un picogramo del ADN plasmático pCP20 que codifica la recombinasa a la suspensión celular. Mezcle la suspensión suavemente y transfiérala a una cubeta de electroporación enfriada de un milímetro. Ajuste el electroporador a 1,8 kilovoltios para la electroporación de las celdas y rescate las celdas transformadas con un mililitro de medio SOC durante una hora a 30 grados centígrados.A continuación, coloque 100 microlitros de las células en placas LB más ampicilina para el cultivo nocturno a 30 grados centígrados. A la mañana siguiente, elija colonias individuales para la inoculación en LB fresco sin antibióticos y cultive las células durante la noche a la temperatura no permisiva de 43 grados Celsius para inducir la expresión de flippasa recombinasa. A continuación, se colocan diluciones seriadas de 50 microlitros en placas no selectivas para el cultivo nocturno a 30 grados centígrados, y se examinan los clones que han perdido su casete de resistencia a los antibióticos.Después de la transducción de P1 y la escisión del casete de kanamicina, como se acaba de demostrar, se pueden obtener varios clones sensibles tanto a la ampicilina como a la kanamicina, y la deleción exitosa del gen tamA dentro de los clones se puede verificar mediante PCR de colonias. Después de inducir la producción de proteínas, las fracciones de la membrana externa de los cultivos de expresión pueden aislarse y analizarse mediante SDS-PAGE. No se observan diferencias importantes entre los niveles de expresión en las cepas madre y receptoras de tamA knockout, aunque YadA parece producirse a niveles algo más bajos en la cepa knockout.Lo contrario parece ser cierto para EibD. Para examinar si la falta de tamA podría influir en el correcto plegamiento o transporte de las proteínas, la capacidad de las proteínas para unirse a los liganos se puede probar mediante una transferencia de colágeno del lejano oeste. En este experimento representativo, se detectó colágeno unido a YadA a un nivel similar tanto en la cepa madre como en la cepa knockout, lo que demuestra que la proteína está correctamente plegada y es funcional.De manera similar, las actividades de unión a IgG de EibD en las dos cepas se correlacionaron con la expresión de la proteína, lo que demuestra que la deleción de tamA no tiene un efecto significativo en la biogénesis de la adhesina del autotransportador trimérico. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una buena técnica aséptica y recordar cultivar bacterias que contengan pCP20 a 30 grados o menos. No olvide que trabajar con cloroformo puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana extractora y garantizar la protección personal mediante el uso de guantes resistentes a los productos químicos y una bata de laboratorio, mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Un genoma único método eficaz mutación del gen se ha establecido...

Genoma escala supresiones de genes en<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de alto rendimiento

Fuente: Valentine, M. E., et al. Generación de mutantes de deleción génica en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020).Este video demuestra la generación de recombinantes de doble cruce en Pseudomonas aeruginosa utilizando una estrategia de deleción de genes basada en plásmidos. El proceso implica seleccionar bacterias que albergan un plásmido no replicativo integrado en el genoma a través de un solo...

Generación de recombinantes de doble cruce de Pseudomonas aeruginosa para la deleción de genes dirigidos

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Enterobacter sp. YSU crece en glucosa medio mínimo de sales. Auxótrofos se generan mediante la transformación con un transposome que se inserta aleatoriamente en el genoma huésped. Los mutantes se encuentran por réplica en placas de medio complejo a medio mínimo. Genes interrumpidos se identifican por el rescate y la secuenciación de genes.

Generación de Enterobacter Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Aquí presentamos un método experimental para probar el papel de multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos.

Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

Aquí, describimos un protocolo simple y reproducible del modelo de ratón de infección para evaluar la atenuación de las cepas modificadas genéticamente de Pseudomonas aeruginosa en comparación con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobada por escherichia coli para aplicaciones comerciales.

Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Aquí se describe un método para la eliminación de genes dirigida y sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed, FLAEM.

Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Aprende a generar mutantes de deleción en Escherichia coli mediante transducción con bacteriófago P1 usando casetes de resistencia a antibióticos. Este protocolo rápido y confiable facilita el estudio de funciones génicas.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

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