Name: Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a generar sistemas de transcripción binaria específicos de tejido en Drosophila mediante edición CRISPR/Cas9. Este método reemplaza el primer exón codificante con activadores de transcripción para expresión génica espaciotemporal precisa.

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Agradecemos Dr. F. Port, Dr. K. o ' Connor-Giles y el Dr. S. Feng debates sobre estrategia CRISPR; Dr. T.B. Kornberg y el centro de Stock de Bloomington de reactivos; Instalaciones de centrales de UMD; y el financiamiento de NIH: R00HL114867 y R35GM124878 al SR.

1. diseñar y construir el gRNA Vector de expresión
<ol><li>Para sustituir precisamente una región larga definida de un exón, utilice un gRNA doble enfoque6, en el cual cada gRNA puede apuntar específicamente a dos extremos de la región seleccionada de interés. Para obtener la precisa expresión espaciotemporal gene-específica del controlador, seleccione dos sitios de destino de gRNA dentro del primer exón de la codificación del gene.</li>
	<li>
Para Drosophila melanogaster, seleccionar los sitios de destino de gRNA utilizando la herramienta de buscador de objetivo óptimo de flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Otras herramientas de diseño disponibles CRISPR se pueden utilizar, incluyendo la herramienta de diseño optimizado de CRISPR (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) y E-(www.e-crisp.org/E-CRISP). Nota: Los siguientes protocolos de gRNA diseño y clonación fue adoptado de los métodos previamente descritos6,7.<ol>
<li>Copie la secuencia real en la caja proporcionada en la herramienta en línea. Seleccione el más recientemente publicado Drosophila melanogaster genoma anotación versión, "r_6," en el menú desplegable de "Seleccione genoma." En el campo "Guía seleccione longitud (nt)," entrada "20." Seleccione para encontrar "Todos los objetivos CRISPR" y haga clic en «Buscar CRISPR objetivos».</li>
		<li>Evaluar todos los objetivos de la gRNA candidato poniendo "Máximo" por "Rigor" y "NGG sólo" para "PAM". Trate de seleccionar los sitios de gRNA sin ningún objetivo de potencial o un número mínimo de posibles fuera de objetivos. Uso la herramienta web descrito en Doench et al 2014 8 para seleccionar gRNAs con una puntuación de "bueno" de la actividad potencial.</li>
		<li>Al mismo tiempo, no Asegúrese de que polimorfismo de nucleótido único en los objetivos de gRNA en el genoma de la línea de mosca de padres seleccionado para la inyección (Por ejemplo, nos Cas9 en cromosoma X, BL # 54591). Seguir el protocolo descrito en Gratz et al 20157 para extraer el ADN genómico de la línea de mosca de los padres. Amplificación de PCR, aproximadamente, las regiones nt 500 – 1.000 utilizando cebadores que flanquean la secuencia de interés y una ADN polimerasa de alta fidelidad; secuencia-verificar los productos PCR amplificado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para generar un vector de expresión de gRNA tándem, siga una ligadura independiente clonación protocolo6 para introducir dos secuencias protospacer en un vector de expresión de RNA de pCFD4. Tenga en cuenta que un vector de expresión multi-gRNA mejorada (pCFD5) ya está disponible donde se expresan tanto el sgRNAs de la U6:3 fuertes promotores9 (https://www.crisprflydesign.org). Use un método de ensamblaje de ADN a clonar los gRNAs en el vector de pCFD4.
	<ol>
<li>Diseñar y ordenar los iniciadores hacia adelantados y hacia atrás para introducir dos secuencias protospacer en el pCFD4 de vector de expresión de RNA (tabla 1A). Como se describió anteriormente6, el primer avance contiene la primera secuencia de protospacer flanqueada por las regiones correspondientes al promotor U6-1 y base del gRNA en pCFD4; el primer reverso contiene la secuencia del complemento reverso de la segunda protospacer flanqueado por las regiones correspondientes al gRNA core y el promotor U6-3 en pCDF4.</li>
		<li>Resuspender cartillas a 100 μM con agua destilada doble libre de RNasa y DNasa (ddH2O). Hacer una cartilla de concentración 10 μM trabajo. Utilice pCFD4 plásmido como plantilla y configurar la reacción de PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad y recomendados para PCR la reacción6.</li>
		<li>Para clonar el producto amplificado en pCFD4, digerir pCFD4 plásmido con enzimas de BbsI estableciendo la siguiente reacción: 2 – 5 μg de plásmido pCFD4, 5 μL de 10 x buffer de digestión, 1 μL de enzima de BbsI y ddH2O para hacer el volumen final de 50 μL. Mezcle el contenido de reacción suavemente golpeando ligeramente el tubo y recogiendo todas las gotitas dispersas de la pared del tubo a la parte inferior por un centrifugado breve. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C por 2 h.</li>
		<li>Ejecutar el producto PCR de paso 2 y el producto digerido desde el paso 3 en un gel de agarosa al 1%. Realizar la electroforesis para el tiempo suficiente para separar completamente las bandas de ADN. Corte el correcto tamaño de bandas de ADN en un trans-iluminador UV antes de purificar los productos esperados utilizando columna de elución de gel siguiendo las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales). El producto PCR debe ser 600 bp y el plásmido linearizado pCFD4 debe ser ~6.4 kb 6.</li>
		<li>Configurar la reacción de la Asamblea de ADN en un tubo PCR, por las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Transformar 2 μL del producto conjunto de bacterias competentes (DH5α o variedades similares con ΔrecA1, ΔendA1), placa de ampicilina (100 μg/mL) que contiene las placas de agar LB (LB/Amp) e incube a 37 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que la mezcla de Asamblea de ADN podría ser tóxica para ciertas cepas de bacterias, pero diluyendo la mezcla de montaje puede reducir la toxicidad.</li>
		<li>Escoger 3-4 colonias resistentes a la ampicilina de la placa se incubó durante la noche, inocular la colonia de 3 mL LB con ampicilina μg/mL 100 y crecen las bacterias inoculadas en una coctelera de 37 ° C durante la noche. Extraiga el plásmido de las bacterias cultivadas durante la noche utilizando el kit de preparación para el mini plásmido siguiendo las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>La plásmidos con el imprimador universal T3 pantalla para los clones correcto que contiene la inserción de gRNA tándem de la secuencia. Establecer un stock de glicerol de bacterias transformadas con un gRNA pCFD4 de secuencia verificada en glicerol al 20% y almacenar en un congelador de-80 ° C para su uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. diseñar y construir al donante HDR
<ol><li>
Para genómica knock-in de una secuencia Gal4 o LexA , diseño de un donante HDR de doble cadena que contiene la secuencia del transactivator flanqueada por dos brazos de homología.
	<ol>
<li>Uso > 1,5 kb a la izquierda y brazos de homología derecha flanqueando el gRNA dirigidos a sitios. Brazos extendidos homología aumentan la eficiencia de HDR durante el proceso de reparación de 10.</li>
		<li>PCR amplifica los brazos de la homología de la DNA genómico (gDNA) extraído de la línea de mosca de padres seleccionada para la inyección (Por ejemplo, nos Cas9 (en el cromosoma X), BL # 54591). Utiliza una enzima de hot-start Taq-DNA polimerasa de revisión adecuada para la larga extensión PCR (véase Tabla de materiales). Verificar la secuencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar el retargeting de gRNA al lugar geométrico ingeniería, diseño al donante de recambio de tal manera que los sitios de reconocimiento de gRNA se interrumpen por la secuencia exógena introducida. Nota: para evitar alterar el elementos cis-reguladores putativos, siempre seleccionar los sitios de reconocimiento de gRNA dentro de la región codificante del exón.</li>
	<li>
Para la generación de un cassette de recambio, plan de la estrategia de la Asamblea de ADN para unir cuatro segmentos: los brazos de homología 5' y 3' la secuencia de ADN del medio transactivator exógena y la clonación lineal vector columna vertebral (por ejemplo, pUC19 u otro utilizan vectores de clonación). Siguiendo la pauta del fabricante para el montaje de la DNA (véase tabla de materiales), diseño de los cebadores adecuados para la amplificación por PCR y montaje de cada segmento. Resuspender cartillas a 100 μM con ddH2O. hacer una cartilla de concentración 10 μM trabajo. Usar la polimerasa de alta fidelidad para todas las reacciones de PCR. Siga el siguiente protocolo:
	<ol>
<li>PCR amplifica un cassette de expresión de Gal4 o LexA de un vector disponible (por ejemplo, nls-LexA:p65; la plásmidos de expresión de Gal4/LexA/QF2 ideal se pueden encontrar y obtenida de recursos comunes como Addgene) utilizando el cartillas enumeradas en la Tabla 1B.<ol>
<li>Para conservar todas las regulaciones originales transcripcionales y postranscripcional del exón sustituyó en la expresión de la secuencia de ADN del transactivator, diseño de la cinta de tal manera que el alelo genómico editado expresaría un mRNA quimérico de la transactivator y el gen. Preservar el extremo 5' y 3' del exón dirigido a retener cualquier señal que empalma.</li>
			<li>Incorporar una T2A auto Hendedoras secuencia del péptido entre el residuo 5' codificación exón y la secuencia del transactivator para evitar la traducción a una proteína quimérica. Añadir un codón de parada de traducción después de la secuencia del transactivator exógeno (figura 5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR amplifica los brazos de la homología de la DNA genómico (gDNA) extraído de la línea de mosca de padres seleccionada para la inyección (Por ejemplo, nos Cas9 (en el cromosoma X), BL # 54591) usando los cebadores enumerados en la Tabla 1B. Usar la polimerasa de alta fidelidad para todas las reacciones de PCR utilizando los sistemas como sigue: 5 μL de 5 x Buffer de reacción, 0.5 μL de 10 mM de dNTPs, 1.25 μL de 10 μM adelante cartilla, 1.25 μL de 10 μM cartilla reversa, 0.5 μL de DNA de la plantilla, 0,25 μL de polimerasa de la DNA alta fidelidad , 16,25 μL de ddH2O.</li>
		<li>Utilice el vector linearizado clonación como pUC19. Ahora hay un número de vectores de donantes. Ver una lista completa en el siguiente sitio web-http://flycrispr.molbio.wisc.edu.</li>
		<li>Ejecutar los productos PCR en un gel de agarosa al 1%. Realizar la electroforesis durante suficiente tiempo asegurar una clara separación de la banda deseada de las bandas de no específicos no deseadas (si existe). Gel-purificar los fragmentos de ADN esperados. Medir la concentración de cada fragmento de ADN purificado usando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Configurar la reacción de la Asamblea de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. Mezclar los fragmentos lineal de vectores y destino clonación del paso 3 y paso 4 en la siguiente reacción: 1 μL de linear vector (50 ng/μL), 2 – 3 veces exceso de cada fragmento de destino, 10 μL de 2 x mezcla principal de la Asamblea de ADN, la clonación llevar el volumen final de reacción de 20 μL con ddH < C21 > 2O. Incubar la mezcla de reacción durante 1 hora a 50 ° C.</li>
		<li>Transformar 2 μL del producto de la Asamblea en bacterias competentes, placa en placas de agar LB/Amp con 100 ampicilina μg/mL. También, Añadir X-Gal + IPTG en la placa para azul/blanco cribado.</li>
		<li>Tomar 3-4 colonias blancas de la placa se incubó durante la noche, inocular la colonia de 3 mL LB con ampicilina μg/mL 100 y crecen a 37 ° C durante la noche en una coctelera Boston. Manual del extracto de plásmido de las bacterias cultivadas durante la noche utilizando el kit de preparación para el mini plásmido siguiendo el fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Pantalla de la Colonia positivo por PCR o restricción de la digestión.</li>
		<li>Secuencia de verificar la región donante HDR del plásmido final. Guardar una acción bacteriana transformada con los clones correcto en 20% de glicerol a-80 ° C para inoculación de futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. embrión inyección, mosca genética y proyección para la edición del genoma
<ol><li>Preparar el gran vector de expresión de pureza gRNA libre de endotoxinas, así como el plásmido donante HDR usando un plásmido maxiprep kit (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Conjuntamente inyectar el plásmido de expresión de gRNA (100 ng/μL) y el donante de recambio (500 ng/μL) en la línea germinal de Enmiendas Cas9 embriones6. Nota: utilizamos un servicio comercial para la inyección, pero este procedimiento puede realizarse en el laboratorio también.</li>
	<li>
La mosca genética y proyección (figura 2 y figura 3):
	<ol>
<li>Cuando los embriones inyectados se convierten en adultos, cruzado cada solo G0 vuela Vuela balanceador. Seleccione el adecuado balanceador para el cromosoma con el alelo específico.</li>
		<li>Anestesiar la F1 prole de G0 cada cruz en una almohadilla de CO2 y elegir al azar los machos de 10-20 bajo un estereomicroscopio. Cruzarlos individualmente a las hembras de balanceador como se muestra en la figura 3.</li>
		<li>Cuando la escotilla de larvas de F2, recoger el padre de F1 único de cada cruz y extraer gDNA usando el única mosca genomic ADN preparación protocolo:<ol>
<li>Preparar el tampón de extracción gDNA: 10 mM Tris-Cl de pH 8.2, EDTA 1 mM, 25 mM NaCl, almacenar a temperatura ambiente. Prepare 20 mg/mL de proteinasa K solución y almacenar en el congelador.</li>
			<li>Colocar cada mosca en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y etiquetar el tubo. Mantener en el congelador de-80 ° C durante la noche.</li>
			<li>Preparar un volumen de trabajo fresca del gDNA tampón de extracción que contiene la concentración final de 200 μg/mL de proteinasa K. Nota: No use un tampón antiguo para este paso.</li>
			<li>Aplastar cada mosca para 10 – 15 s con una punta de pipeta con 50 μL de aplastar las buffer sin suministro del líquido. Dispensar buffer restante en el tubo y mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante 20-30 min.</li>
			<li>Poner tubos en el bloque de calor de 95 ° C durante 1 – 2 minutos inactivar la proteinasa K.</li>
			<li>Desactivación por 5 min a 10.000 x g. Guarde la preparación en 4 ° C para su posterior análisis de la polimerización en cadena.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar el mismo método para preparar gDNA de una mosca nos Cas9 , que sirve como control negativo. Realizar pantallas PCR basado en tres pasos para identificar el correcto extremos del"hacia fuera" HDR (figura 2, figura 5) usando gDNA de cada macho F1 como una plantilla de5. Use 1 μL de la preparación de ADN en el sistema siguiente de la reacción de PCR: 10 μL de 2 x PCR Master Mix con tinte, 1 μL de cada cebador (10 μM), 1 μL de plantilla de la DNA y 7 μL de ddH2O.</li>
	<li>Como se muestra en la figura 5A, realizar PCR utilizando primers fwd1 y rev1 a pantalla la existencia de la inserción o reemplazo; realizar PCR utilizando primers fwd2 y rev2 para verificar la inserción o reemplazo de 3' región; realizar PCR utilizando primers M13F y rev3 para revisar los "extremos en" HDR (tabla 1).</li>
	<li>Mantener las líneas de mosca con el HDR extremos de salida confirmada y establecer acciones equilibradas de la generación F2. Outcross a las moscas balanceador otra vez para quitar cualquier mutaciones no deseadas en otros cromosomas.</li>
	<li>
Preparar gDNA de alta calidad de las acciones establecidas para la amplificación de la polimerización en cadena larga (> 800 – 1.000 nt) amplicones con Taq polimerasa de alta fidelidad y secuencia verificar los amplicones obtenidos de las regiones genómicas ingeniería. Alternativamente, utilice extracto crudo gDNA como se describe anteriormente para amplificar más corta (< 800 nt), superposición de productos de la PCR para validar de secuencia el genoma editado. Utilizar el siguiente protocolo para preparar el ADN genómico de la Drosophila de buena calidad:
	<ol>
<li>Poner sobre 25 moscas adultas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y congelar en el congelador de-20 ° C o -80 ° C durante al menos 1 hora.</li>
		<li>Añadir 250 μL de solución A (pH 9.0 Tris HCl 0.1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).</li>
		<li>Homogeneizar las moscas mediante las homogeneización majas en tubos de microcentrífuga y poner el tubo en hielo.</li>
		<li>Incubar a 70 ° C por 30 minutos.</li>
		<li>Añadir 35 μL de KOAc (5 M), agitar y mezclar bien, pero hacer no agitar con vortex.</li>
		<li>Incubar en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Vuelta a 12.000 x g durante 15 minutos.</li>
		<li>Con una micropipeta de 1 mL, cuidadosamente transferir sólo el sobrenadante a un tubo nuevo, dejando atrás cualquier precipitado o interfase.</li>
		<li>Añadir 150 μL de isopropanol para el sobrenadante. Mezclar suavemente por inversión.</li>
		<li>Centrifugado a 10.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y dejar el sedimento en el tubo.</li>
		<li>Lavar el pellet con 1 mL 70% EtOH.</li>
		<li>Vuelta a 12.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante. Secar el pellet por 15 a 20 min. No secar sobre el sedimento.</li>
		<li>Disolver el sedimento en 100 μL de ddH2O.</li>
		<li>Uso de alta fidelidad de la polimerasa de la DNA conveniente para productos largos (> 800 bp) para amplificar la región editada completa. Lo ideal es tomar dos cartillas fuera el cassette insertado para amplificar la región genomic. Gel de purificar el producto PCR, y como se describió anteriormente, la secuencia de verificar el producto con múltiples cebadores superpuestos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Validar los patrones de expresión espaciotemporal correcta de tejidos o embriones disecados de las líneas de mosca dirigidos:
	<ol>
<li>Realizar RT-PCR del ARN total para verificar la expresión del producto de mRNA híbrido (tabla 1).</li>
		<li>Llevar a cabo un hibridación en situ del producto de interés en los tejidos larval/embrión para validar la expresión mRNA.</li>
		<li>Pantalla para los patrones de expresión espacio-temporal específica de tejido precisa entre las líneas de salida de extremos secuencia verificada, cruzar las líneas editadas obtenidos para el conductor de la expresión binaria con el LexO- GFP o LexO- RFP (para LexA driver) line (disponible en los centros de población de Bloomington) y observe la LexA o Gal4 impulsado por la expresión del gen reportero en los tejidos de larvas y adultos de embrión, bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Tradicionalmente, las trampas de potenciador de Drosophila fueron generadas por dos métodos diferentes. Una de las formas incluye inserción al azar de un conductor (ej., Gal4) secuencia en el genoma por transposición (e.g., transposición de elemento P)1 . Por otra parte, las secuencias de controlador pueden colocarse bajo el control transcripcional de una región enhancer putativos/promotor en una construcción del plásmido, que luego se integrarían en un sitio ectópico de...

La caja de herramientas genética para genes específicos se ha desarrollado bien en Drosophila, convirtiéndolo en uno de los mejores sistemas de modelo para investigar la función de genes implicados en una amplia variedad de procesos celulares. Sistemas de expresión binaria, como levadura Gal4/UAS (secuencia de activación upstream), primero fue adoptada para regiones reventado y gen potenciador de tejidos específicos en el modelo genético de Drosophila 1 (figura 1). Este sistema facilita el desarrollo de un gran número de técnicas tales como la regulación espacio-temporal de sobreexpresión de genes, regiones, golpe de gracia en determinados grupos de células, así como en la ablación de la célula, marca de celular, en rastreo de celulares y moleculares procesos en el embrión y los tejidos, rastreo de linaje y mosaico análisis durante el desarrollo. Un número del sistema binario de la transcripción, como la bacteriana LexALexAop (figura 1) y Q-sistema de Neurospora , son poderosas herramientas genéticas que son ampliamente utilizados en Drosophila, además el original sistema de Gal4/UAS dirigida gene expresión1,2,3.
Aquí, presentamos un método para generar sistema fiable expresión binaria de tejidos específicos mediante el empleo de una técnica de edición del genoma. Los recientes avances en la tecnología de edición CRISPR/Cas9 genoma han permitido oportunidades sin precedentes hacer cambios de genoma dirigido en una amplia gama de organismos. En comparación con las otras técnicas de edición de genoma disponible, el sistema CRISPR/Cas9 es barato, eficiente y confiable. Esta tecnología utiliza componentes del sistema inmune adaptativo bacteriano: una endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes que crea una rotura de doble cadena (DSB) y un ARN quimérico guía (gRNA), que guía la Cas9 a un sitio particular del genoma para específicas OSD4. Las células contienen la maquinaria para reparar el OSD mediante diferentes vías. No homólogos se terminan uniendo (NHEJ) lleva a pequeñas inserciones o eliminaciones interrumpir funciones de los genes, mientras que la reparación dirigida de homología (HDR) presenta un definida dirigida/deseable genómico knock-en/knock-out mediante un donador exógeno de HDR como una plantilla. La estrategia de reemplazo basada en HDR puede utilizarse eficientemente para generar un sistema altamente confiable expresión binaria de tejidos específicos, que puede superar todas las limitaciones de los métodos de trampa tradicional potenciador. Describimos un procedimiento paso a paso para la utilización de reparación HDR CRISPR/Cas9-basado en la generación de una línea de controlador binario de transcripción que se expresa bajo el control de la regulación transcripcional y postranscripcional endógena de un Drosophila gen. En este protocolo, se demuestra la generación de una línea de controlador específica para servicios (bnl) gen codificando una proteína familia FGF que regula la morfogénesis ramificación de la vía aérea traqueal epitelio5. En este ejemplo, el primer exón de la codificación del gene del bnl fue substituido por la secuencia de una secuencia de transactivator bacteriana LexA sin alterar cualquier endógeno cis-secuencias reguladoras del gene del bnl . Nos muestran que la estrategia genera una línea de conductor de bnl-LexA que spatiotemporally controla la expresión de un gen reportero colocado aguas abajo de LexAoperator (LexAop o LexO) exclusivamente en bnl- expresando las células epiteliales/mesenquimales/neuronal.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>clonación</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp; 244520</td><td>clonación</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>Aldrich T3253</td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Biología</td></tr><tr><td>Molecular Agua UltraPura DNasa/Libre de ARNasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71736</td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Biología</td></tr><tr><td>Molecular GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Miniprep</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción Primers</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Plantilla de ADN y vector para gRNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5 de alta fidelidad Taq</td><td>NEB</td><td>NEB #M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB NEB</td><td>#E2611</td><td>Ensamblaje de ADN</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA:p65Uw</td><td>Plantilla</td> de ADN Addgene <td></td><td>para la amplificación de LexA</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>2x PCR PreMix, con colorante (rojo)</td><td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td>Biología molecular</td></tr><tr><td>Kit de elución en gel</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-300</td><td>Reactivo</td></tr> <tr><td></td><td>TRI de biología molecularSigma-Aldrich</td><td></td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>Kits de purificación de ARN de zol directo</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-330</td><td>Biología Molecular</td></tr><tr><td>OneTaq Kit de RT-PCR de un solo paso</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>Biología molecular</td></tr><tr><td>lexO-CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab Línea</td><td></td> de <td>mosca</td></tr><tr><td>UAS-CD8:GFP</td><td>Laboratorio</td><td></td> de Kornberg<td>Línea de mosca</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg lab</td><td></td><td>Línea de mosca</td></tr><tr><td>MKRS/TB6B</td><td>Laboratorio</td><td></td> Kornberg <td>Línea de mosca</td></tr><tr><td>Microscopio confocal SP5X</td><td>Patrón de expresión</td><td>de imágenes Leica</td><td></td></tr><tr><td>Estación CO2</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td>Empuje de moscas</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>Empuje de moscas</td></tr><tr><td>Majas homogeneizadoras de microtubos</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217 aislamiento de</td><td>ADN genómico</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Cuantificación de ADN</td></tr></tbody></table>

una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en drosophila genoma editando

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Sistemas de transcripción binario son poderosas herramientas genéticas utilizadas para visualizar y manipular el celular destino y expresión genética en grupos específicos de células o tejidos en organismos modelo. Estos sistemas contienen dos componentes como líneas transgénicas. Una línea de conductor expresa un activador transcripcional bajo el control de promotores específicos de tejido/potenciadores y un puertos de línea de reportero/efector un gene de la blanco se coloca aguas abajo para el sitio de unión del activador de transcripción. Animales que ambos componentes inducen la transactivación específica de tejido de una expresión del gen objetivo. Precisa expresión espaciotemporal del gen en tejidos específicos es fundamental para la interpretación objetiva de la actividad del gene de la célula. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de un método para generar líneas exclusivo controlador de células/tejidos específicos. Aquí presentamos un método para generar sistema de expresión específicos altamente específica de tejido mediante el empleo de un "cluster regularmente Interspaced corto palindrómico Repeat/CRISPR-asociados" (CRISPR/Cas)-basado en genoma edición técnica. En este método, la endonucleasa Cas9 está dirigido por dos quimérica guía RNAs (gRNA) a sitios específicos en el primer exón de la codificación de un gen en el genoma de Drosophila para crear roturas de doble cadena (DSB). Posteriormente, usando un plásmido donante exógeno que contenga la secuencia del transactivator, la maquinaria de reparación celular autónoma permite reparación dirigida de homología (HDR) del OSD, dando por resultado la eliminación precisa y reemplazo del exón con el transactivator secuencia. El transactivator noqueó en se expresa exclusivamente en las células donde el cis-elementos regulatorios del gen sustituyó son funcionales. El protocolo paso a paso detallado presentado aquí para generar un controlador transcripcional binario expresado en Drosophila fgf/servicios-produciendo células epiteliales/neuronales puede adoptarse para cualquier expresión del gene o tejido específico.

Este protocolo fue utilizado con éxito para generar una expresión binaria específica reportero sistema específica para bnl expresando células5. El cis-elementos reguladores (CREs) que controlan la expresión espaciotemporal complejo bnl no caracterizan. Por lo tanto, para lograr expresión espacio-temporal bajo el control de la secuencia de regulación endógena bnl , solamente el primer exón codificación de bnl fue diseñado...

Aquí, presentamos un método para generar sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila sustituyendo el primer exón de la codificación de los genes con los conductores de la transcripción. El método basado en el CRISPR/Cas9 coloca una secuencia de transactivator bajo la regulación endógena de un gen sustituyó y en consecuencia facilita la expresión de transctivator exclusivamente en los patrones espacio-temporales de gene-específico.

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

El objetivo general de este método es generar un sistema de expresión dirigida altamente específico para tejidos. En este método, demostramos la generación de un controlador de transcripción binaria específico para nuestro homólogo Drosophila FGF, sin ramificaciones. La expresión dinámica y espaciotemporal de branchless regula la hemogénesis de ramas del epitelio de las vías respiratorias traqueales.Aunque este método puede proporcionar información sobre la expresión espaciotemporal y la migración de células productoras sin ramas, se puede aplicar fácilmente a otros genes y tejidos en Drosophila o en otros organismos modelo, como C.Elegans y peces cebra. La principal ventaja de esta técnica es que genera sistemas de expresión altamente confiables, específicos de tejidos y genes, y activos exclusivamente en células donde los elementos reguladores cis del gen reemplazado son funcionales. Los sistemas de transcripción binaria son herramientas esenciales para la expresión y manipulación génica dirigida.Un activador trans, como GAL4 o LexA, expresado bajo el control de los elementos reguladores cis de un gen, impulsa un gen trans efector que se coloca aguas abajo de sitios específicos d

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video describe un método de cribado para identificar moscas Drosophila transgénicas, cuyo genoma fue modificado usando CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 es una poderosa herramienta de edición del genoma que revolucionó la forma en que los científicos pueden manipular el genoma de un organismo. En el protocolo de ejemplo, veremos cómo identificar mutantes generados por CRISPR, en los que una inserción de una secuencia de transactivación reemplaza el primer exón del gen sin ramas (bnl), creando así...

Cribado de modificaciones genómicas: un método para identificar mutantes generados por CRISPR en Drosophila

Técnicas de recombinación homóloga en gran medida...

Recombinería homólogos Construcciones recombinación en<em&gt; Drosophila</em

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Este artículo describe un protocolo detallado para el uso de la enzima Cas13D dirigida al ARN (RfxCas13D) en moscas.

Orientación de ARN ubicuo y específico del tejido en Drosophila Melanogaster utilizando CRISPR / CasRx

Este artículo presenta los protocolos paso a paso para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis. Los pasos detallados proporcionados por este protocolo estandarizado servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Aprende a generar sistemas de transcripción binaria específicos de tejido en Drosophila mediante edición CRISPR/Cas9. Este método reemplaza el primer exón codificante con activadores de transcripción para expresión génica espaciotemporal precisa.

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando (Video) | JoVE Journal

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

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