Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del tejido adiposo, como cómo interactúan los diferentes componentes del tejido adiposo en un tejido completo. La principal ventaja de esta técnica es que elimina por completo el exceso de lípidos almacenados en el tejido adiposo manteniendo su arquitectura tridimensional. Si bien este método puede proporcionar información sobre la organización tridimensional del tejido adiposo, también se puede aplicar generalmente a otros tejidos con alto contenido de lípidos, como la glándula de la memoria y los ganglios linfáticos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de desinfección y limpieza requieren suficientes tiempos de incubación, que pueden ser difíciles de determinar. Comience usando pinzas de punta roma para diseccionar la almohadilla de grasa de interés de un modelo animal recién perfundido. Retire con cuidado toda la almohadilla de moda sin pellizcar ni apretar el tejido ni contaminar el tejido diseccionado con pelaje.

Coloque la almohadilla de grasa en aproximadamente 10 mililitros de solución de fijación en un tubo cónico de 15 mililitros y coloque la fijación a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente de lavar la muestra con PBS, retire suavemente cualquier residuo de la muestra bajo un microscopio de disección. El pelo, la pelusa u otros residuos adheridos a la muestra causarán sombras durante la toma de imágenes.

Transfiera la muestra limpia a un tubo de polipropileno que contenga un 20 por ciento de tampón de metanol B1N helado. Coloque el tubo que contiene la muestra horizontalmente en un agitador orbital, ajústelo a 100 RPM y agite durante 30 minutos a 1 hora, según el tamaño de la muestra. Asegúrese de que las muestras puedan moverse libremente dentro del tubo.

Continúe deshidratando las muestras a través de una serie graduada de metanol del 40 por ciento, 60 por ciento y 80 por ciento en tampón B1N seguido de metanol al 100 por ciento. Minimice la solución de arrastre. Después de la deshidratación, reemplace la solución de metanol al 100 por ciento con diclorometano al 100 por ciento o DCM para deshilojar la muestra.

Repita el lavado dos veces siguiendo los tiempos de incubación indicados en la tabla 2. La muestra debe hundirse hasta el fondo del tubo al final del segundo y tercer lavado de DCM. De lo contrario, extienda el tiempo de incubación para garantizar una delipidación completa.

Después de la delipidación, lavar dos veces con metanol al 100 por ciento durante el tiempo indicado en la tabla 2. Rehidratar la muestra en una serie tampón de metanol B1N invertido durante los tiempos indicados en la tabla 2. Después de la rehidratación, lave la muestra con tampón PTXWH durante 2 horas a temperatura ambiente.

La muestra ya está lista para la inmunotinción o podría almacenarse en un tampón PTXWH a 4 grados centígrados durante un máximo de 1 año. En primer lugar, diluya el anticuerpo primario en tampón PTXWH hasta la concentración recomendada. Luego, centrifugar la solución de anticuerpos diluida a 20 mil G durante 10 minutos para evitar la introducción de precipitados o agregaciones de anticuerpos.

Es importante elegir anticuerpos primarios adecuados que sean compatibles con el tratamiento con metanol y DCM. Los nuevos anticuerpos deben validarse con pequeños trozos de tejido o con secciones de tejido tratadas con metanol. Incubar la muestra deslipedida con la solución de anticuerpo primario durante 3 a 5 días, dependiendo del tamaño de la muestra.

Después de la incubación primaria, lave la muestra con varios cambios de tampón PTXWH. Al día siguiente, diluya el anticuerpo secundario en tampón PTXWH hasta la concentración recomendada. Centrifugar la solución de anticuerpos diluida como antes.

Incubar la muestra con la solución de anticuerpos secundarios durante 3 a 5 días, dependiendo del tamaño de la muestra. De nuevo, lave la muestra con tampón PTXWH en una serie de pasos de incubación como antes. Al día siguiente, lave la muestra con 1XPBS durante 5 minutos, 10 minutos y luego 30 minutos.

Incruste el tejido adiposo en agarosa para facilitar el montaje de la muestra para la microscopía de lámina ligera. En primer lugar, prepare la solución de incrustación con un 1 por ciento de agarosa en 1XPBS. Enfríe la solución de inclusión a unos 40 grados centígrados para evitar exponer la muestra a un calor excesivo.

Evitando el arrastre de líquidos, coloque la muestra de tejido limpia en un molde y colóquela en la posición deseada. A continuación, vierta suavemente la solución de inclusión sobre la muestra evitando las burbujas de aire. Las burbujas de aire deben moverse a la periferia antes de que la agarosa se solidifique.

Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, corte un bloque que contenga la muestra. Transfiera la muestra a metanol al 25 por ciento en agua, protéjala de la luz e incube agitándola durante el tiempo que se muestra en la tabla 2. Continúe deshidratando la muestra a través de un gradiente de metanol.

Incubar la muestra en DCM al 100 por ciento durante 1 hora con agitación. Las muestras lavadas DCM se secan fácilmente en el aire, lo que afectaría a la claridad de la muestra y daría lugar a imágenes borrosas. Es importante transferir las muestras rápidamente a una solución fresca para evitar la desecación.

La muestra debe hundirse hasta el fondo del tubo al final de cada lavado de DCM. Incubar la muestra en éter de dibencilo o DBE durante la noche con una leve agitación para lograr la coincidencia del índice de refracción. Con el tiempo, la muestra se convertirá en luz transparente e invisible.

Al día siguiente, después de incubar la muestra con DBE fresco con una leve agitación durante 2 horas, almacene la muestra a temperatura ambiente en la oscuridad o proceda directamente a la toma de imágenes. Para obtener imágenes de la muestra con un microscopio de lámina de luz que sea compatible con DBE, monte la muestra incrustada de agarosa en un soporte que pueda evitar el movimiento durante la obtención de imágenes. Para obtener imágenes de la muestra con un microscopio confocal invertido o de dos fotones, coloque la muestra incrustada en agarosa en un portaobjetos de cámara con fondo de vidrio.

El escaneo de una almohadilla de grasa subcutántica posterior con un microscopio de lámina óptica con bajo aumento muestra la organización lobulillar de los adipocitos. La información más detallada, como el tamaño de los adipocitos, se puede revelar haciendo zoom en las regiones de interés con mayor aumento. Se obtuvieron imágenes de una almohadilla de grasa subcutántica posterior teñida con tirosina hidroxilasa, un marcador del sistema nervioso simpático, mediante microscopía de florescencia en lámina de luz.

La tinción de TH reveló estructuras que aparecen como grandes haces de nervios, como lo indica la flecha aquí. La inervación de los vasos sanguíneos, así como la arborización terminal densa en el parénquima tisular, también se revelan mediante la tinción de TH. Utilizando la molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias o PCAM1, también conocida como CD31, como marcador para marcar los vasos sanguíneos, se observa que todos los adipocitos están en contacto con los capilares en todo el tejido, lo que respalda la alta demanda de un intercambio eficiente de nutrientes y oxígeno en el tejido adiposo.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología adiposa exploraran preguntas adicionales, como la morfogénesis temprana de los tejidos y el mapeo del destino de los progenitores de adipocitos. También se puede aplicar para estudiar la histología del tejido adiposo humano. No olvide que trabajar con paraformaldehído, metanol, diclorometano y éter de dibencilo puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de una campana extractora y equipo de protección personal al realizar este procedimiento.