La detección de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en desarrollo y en la Retina de ratón Postmitotic

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la metilación del ADN, como los cambios en la cromatina durante el desarrollo de la retina en la retina postmitótica. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar de forma robusta en cualquier sección de todos los tejidos de la retina de ratón que llevan una distribución de 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina que se procesan con un enfoque similar. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación y tinción del tejido son difíciles de aprender, ya que si se utilizan preparaciones histológicas congeladas, se puede perder tejido valioso y original de la organización.

El resto del procedimiento será el encargado de demostrar el resto del procedimiento, investigador asociado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, use una aguja de media pulgada de calibre 29 para perforar los ojos de un ratón eutanasiado decapitado en el lado dorsal de los ojos. Para obtener copas oculares, enuclee inmediatamente los ojos cortando alrededor de la esclerótica con unas tijeras oftálmicas finas para extraer la córnea y el cristalino.

Fije las copas oculares y los ojos enteros E16 en paraformaldehído al 4% o PFA en 1xPBS pH 8.0 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lávelos dos veces en un mililitro de 1xPBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para crioproteger las copas oculares y los ojos completos, incubarlos en 1xPBS pH 8.0 con 10% de sacarosa a temperatura ambiente durante una hora.

Luego en sacarosa al 20% en 1xPBS durante una hora. Y finalmente en 30% sacarosa en 1xPBS a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, incruste las copas oculares y los ojos en un compuesto de temperatura de corte óptima, o OCT, en criomoldes.

Luego congélelos en un baño de etanol de hielo seco y manténgalos a 80 grados centígrados. Antes de comenzar la criosección, retire los moldes con oculares incrustados y los ojos a 80 grados centígrados. Colóquelos en un soporte de criostato y deje que se equilibren a 20 grados centígrados durante una hora.

Usando un criostato a 20 grados Celsius, corte secciones transversales de retina de 12 micrómetros de espesor paralelas al eje temporonasal a través de la cabeza del nervio óptico. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio y guárdelas a 80 grados centígrados. Para comenzar la inmunotinción, use una pluma de barrera hidrofóbica para rodear las secciones de la retina montadas en portaobjetos.

Lave las secciones una vez con 200 microlitros de 1xPBS durante 10 minutos. Permeabilizar las secciones con 200 microlitros de PBST durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, desnaturalícelos con 200 microlitros de ácido clorhídrico 2 normal recién hecho cuidadosamente valorado en 1xPBS durante 45 minutos a 37 grados centígrados para optimizar la señal de 5 mC.

Después de la desnaturalización, añadir 100 microlitros de Tris-HCl 0,1 pH 8,3 en las secciones de la retina, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para neutralizarlas. Luego, agregue 500 microlitros de solución de bloqueo. E incubar las secciones en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante una hora.

Añadir los anticuerpos adecuados, diluidos de uno a 500 en solución bloqueante, a las secciones e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las secciones tres veces durante 10 a 15 minutos, cada una con 0.1% PBST. Añadir anticuerpos secundarios apropiados diluidos de uno a 1000 en una solución bloqueante que contenga solución de DAPI a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, lave los portaobjetos tres veces con un mililitro de 0,1%PBST durante 10 minutos cada uno. Después del último lavado, agregue medio de montaje acuoso. Cubra con un cubreobjetos.

Y luego proceder con la microscopía confocal. Después de la inmunotinción de retina en E16, la señal de 5mC fue fuerte en los cromocentros de los núcleos celulares y estuvo presente a un nivel mucho más bajo en todos los núcleos celulares. La tinción de 5hmC se encontró exclusivamente en los núcleos celulares y ausente de los cromocentros.

En la retina P0, las señales de 5mC y 5hmC estaban presentes en la capa externa del neuroblasto y en la capa interna del neuroblasto. La señal de 5mC era fuerte en los cromocentros y la periferia nuclear de los núcleos celulares, y más débil entre los cromocentros de los núcleos celulares. La tinción con 5hmC se restringió al núcleo celular.

En la retina P15, en la capa nuclear externa, se detectó la señal de 5mC en los cromocentros de los núcleos celulares y la periferia nuclear. Mientras que la señal de 5hmC estaba en todos los núcleos celulares a excepción de los cromocentros. En el núcleo interno y en la capa de células ganglionares, la señal de 5mC era fuerte en los cromocentros de los núcleos celulares y débil en los núcleos de células completas.

Mientras que la señal 5hmC se encontró en todos los núcleos celulares a excepción de los cromocentros. En los fotorreceptores de bastones adultos, la señal de 5mC se limitó al cromocentro y la periferia nuclear, mientras que la señal de 5hmC se restringió a la periferia nuclear. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tratar las secciones histológicas con la exposición óptima de HCl, que es de 30 minutos.

Si la exposición es menor o mayor, los resultados óptimos no pueden ser reproducibles. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cromatografía líquida de alta presión, la espectrometría de masas para responder a preguntas adicionales como la cuantificación de los cambios en la medición de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo neuronal exploraran los cambios epigenéticos en la cromatina.

No olvide que trabajar con HCl y PFA puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como la eliminación adecuada, al realizar este procedimiento.