Name: Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprende a diferenciar células madre epiteliales limbales de células madre pluripotentes humanas sin células alimentadoras. Este método eficiente produce células de calidad clínica para terapias de reemplazo corneal.

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El estudio fue apoyado por la Academia de Finlandia (número 297886), el programa de recambios humanos de Tekes, la Agencia de financiamiento finlandés para tecnología e innovación, el ojo finlandés y Fundación Banco de tejidos y la Finnish Cultural Foundation. Los autores agradecen a los técnicos de Laboratorio biomédico Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt y Outi Heikkilä excelente asistencia técnica y aporte a la cultura de célula. Profesor Katriina Aalto-Setälä es reconocida para proporcionar la línea hiPSC y BioMediTech Imaging Core para suministro de equipos para proyección de imagen de fluorescencia.

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<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El resultado esperado de este protocolo es la generación exitosa y sólida de LESCs de una suspensión unicelular de FF hPSC en aproximadamente 3,5 semanas. Como epitelio corneal se desarrolla del ectodermo superficial29, el primer paso del Protocolo tiene como objetivo hPSCs a este linaje de dirección. Una inducción corto 24 h con la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-β) antagonista SB-505124 y bFGF se utilizan para inducir la diferenciación ectodérmica, seguida por 48 h mesodérmico...

La córnea transparente en la superficie ocular permite que la luz entrar en la retina y proporciona la mayoría del poder refractivo del ojo. La capa más externa, el epitelio estratificado córneo, es continuamente regenerada por células epiteliales limbares (LESCs). Las LESCs residen en la capa basal de los nichos limbares en la ensambladura corneoscleral1,2. LESCs carecen de marcadores específicos y únicos, por lo que su identificación requiere un análisis más extenso de un conjunto de marcadores de supuesta. Epiteliales de transcripción factor p63 y sobre todo N-terminal transcripción truncada de la isoforma alfa de p63 (ΔNp63α), se ha propuesto como un relevante positivo centro marcador3,4. División asimétrica de LESCs les permite uno mismo-renovar, pero también producir progenie que migran centripetally y anterior. Como las células progresan hacia la superficie corneal gradualmente pierden su troncalidad y finalmente terminal diferenciarse a células escamosas superficiales que desaparecen continuamente de la superficie corneal.
Daño a ninguna de las capas de la córneas puede conducir a la debilitación visual severa, y defectos córneos son así una de las principales causas de pérdida de la visión en todo el mundo. En límbica (LSCD), el limbo es destruido por la enfermedad o trauma que conduce a conjunctivalization y opacificación de la superficie corneal y pérdida subsecuente de visión5,6. La terapia de reemplazo celular usando injertos limbares autólogos o alogénicos ofrece una estrategia de tratamiento para los pacientes con el LSCD4,7,8,9. Sin embargo, injertos autólogos de cosecha tiene un riesgo de complicaciones en el ojo sano y tejido del donante escasea. Células pluripotenciales humanas (hPSCs), específicamente células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs), puede servir como una fuente ilimitada de tipos células clínicamente relevantes, incluyendo células epiteliales corneales. Por lo tanto, derivado de hPSC LESCs (hPSC-LESCs) representan una atractiva fuente de células nuevas para la terapia de reemplazo celular ocular.
Tradicionalmente, los métodos de cultura hPSC indiferenciados y sus protocolos de diferenciación a LESCs han confiado en el uso de células de alimentador indefinido, sueros animales, media condicionada o membranas amnióticas10,11, 12 , 13 , 14 , 15. recientemente, esfuerzos hacia productos de terapia celular más seguros han llevado a la búsqueda de más protocolos estandarizados y xeno-libre cultura y diferenciación. Como resultado, varios métodos definidos y xeno-libre para la cultura a largo plazo de hPSCs indiferenciada están ahora disponibles en el mercado16,17,18. Como un continuum, diferenciación dirigida protocolos depender de señales moleculares para hPSCs destino epitelial corneal han sido recientemente introducidos19,20,21,22, 23. Sin embargo muchos de estos protocolos utilizan sea indefinido, hPSCs alimentador basado en como a partir de material, o un cóctel complejo, xenogeneicos factor de crecimiento para la diferenciación.
El propósito de este protocolo es proporcionar un robusto y optimizado, xeno- y método de cultivo libre de alimentador hPSC y posterior diferenciación a LESCs corneales. Cultura de monocapa de hPSCs pluripotentes en 521 laminina (LN-521) matriz en medio de hPSC definida, libre de albúmina (específicamente esenciales 8 Flex) permite la producción rápida de material homogéneo a partir de diferenciaciones. Después de eso una simple estrategia de diferenciación de dos pasos guías hPSCs hacia destino ectodérmica superficial en suspensión, seguida de diferenciación adherente al LESCs. Se obtiene una población de la célula donde > 65% express ΔNp63α dentro de 24 días. El protocolo de xeno-alimentador-libre y ha sido probado con varias líneas de hPSC (hESCs y hiPSCs), sin ningún requisito para optimización específico de línea celular. Los protocolos para fin de semana libre mantenimiento, pases, cryostoring y hPSC-centro phenotyping aquí descritos permiten la producción de grandes lotes de LESCs de alta calidad para clínicas o propósitos de investigación.

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Material/Reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS que contiene Ca2+ y Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td>Placa de</tr> cultivo celular de <tr><td>100 mm</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>Formato de recipiente de cultivo para hPSC-LESC adherente diferenciación</td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>Formato de recipiente de cultivo para muestras</td></tr><tr><td>de FI placa de 24 pocillos</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>Formato de recipiente de cultivo para muestras de FI</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos, accesorio ultrabajo</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>Formato de recipiente de cultivo para inducción en suspensión cultivo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>Anticuerpo secundario para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-conejo Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td><td>Anticuerpo secundario para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-cabra Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>Anticuerpo secundario para IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-ratón Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td>Anticuerpo secundario para el</td></tr><tr><td>factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF, humano)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>FGF humano recombinante sin animales-básico (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Solución de fijación/permeabilización BD</td><td>Biosciences</td><td>#554722</td><td>Solución de fijación y permeabilización para citometría de flujo</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Tampón de lavado para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td> Albúmina sérica bovina <td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de citoqueratina 12</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>Anticuerpo primario para el</td></tr><tr><td>anticuerpo de citoqueratina 14</td> IF <td>R& D Systems</td><td>#MAB3164</td><td>Anticuerpo primario para el</td></tr><tr><td>anticuerpo IF Citoqueratina 15</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td><td>Anticuerpo primario para IF</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30 Medio de</td><td>cultivo para la diferenciación adherente de hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Colágeno tipo IV (humano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>Colágeno placentario humano tipo IV</td></tr><tr><td>CoolCell LX Contenedor de congelación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Tubos CryoPure</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>1.6 mL criotubo para criopreservación hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Definido Inhibidor de tripsina</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Laminina 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>Laminina recombinante humana 521</td></tr><tr><td>&Delta; Np63 y alfa; anticuerpo</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>Anticuerpo primario para el</td></tr><tr><td>anticuerpo IF OCT3/4</td><td>R& D Systems</td><td>#AF1759</td><td>Anticuerpo primario para IF</td></tr><tr><td>p63 y alfa; anticuerpo</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#ACI3066A</td><td>Anticuerpo primario para IF</td></tr><tr><td>p63-&alpha; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugado)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#56687</td><td>p63-&alpha; Anticuerpo conjugado con PE para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Anticuerpo PAX6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>Anticuerpo primario para</td></tr><tr><td>IF Penicilina/Estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td>Fijador celular para IF</td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecolorante con DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>Mountant DAPI para montaje para kit</td></tr> de <tr><td>criopreservación IF PSC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' Águila modificada' s medio</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>Agente de permeabilización para IF</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>Montaje DAPI para montaje líquido para IF</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga, e.g. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo, p. ej. BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia, p. ej.Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico compatible córnea limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Células madre epiteliales limbares corneales (LESCs) es responsables de renovar continuamente el epitelio corneal y manteniendo así la homeostasis corneal y claridad visual. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-LESCs derivadas proporcionan una fuente prometedora de células para la terapia de reemplazo celular corneal. Indefinido, xenogeneicos condiciones de cultura y diferenciación causan variación en resultados de investigación e impiden la traducción clínica de terapias derivadas de hPSC. Este protocolo proporciona un método eficiente y reproducible para la diferenciación de hPSC-centro condiciones xeno - y alimentador sin células. En primer lugar, cultura de monocapa de hPSC indiferenciado recombinante laminin-521 (LN-521) y definido hPSC medio sirve como una base para la producción de robusta de alta calidad material de partida para la diferenciación. En segundo lugar, un método de diferenciación rápida y simple hPSC-centro produce poblaciones de centro en tan sólo 24 días. Este método incluye una inducción ectodérmica superficial de cuatro días de suspensión con moléculas pequeñas, seguido de fase de cultura adherente en matriz de combinación de LN-521/colágeno IV en medio de la diferenciación epitelial corneal definida. Cryostoring y extendida diferenciación además purifica la población celular y permite a Banca de las células en grandes cantidades de productos de terapia celular. Las calidad resultantes hPSC-LESCs ofrecen una potencial estrategia de tratamiento nuevo para la reconstrucción de la superficie corneal tratar límbica (LSCD).

De hPSCs a hPSC-LESCs
Todo el proceso de inducir la diferenciación de hPSCs FF a cryostoring hPSC-LESCs tarda alrededor de 3,5 semanas. Descripción esquemática del método de diferenciación, destacando sus principales pasos se presenta en la figura 1A. Figura 1B muestra morfologías típicas de poblaciones celulares en diferentes fases del protocolo. Los datos presentados se ...

Este Protocolo introduce un método de dos pasos simples para diferenciar células epiteliales limbares córneas de células de vástago pluripotent humana bajo condiciones de cultivo libre de xeno - y alimentador. Los métodos de cultivo celular presentados aquí permiten la producción a gran escala, costo-eficiente de células de calidad clínica aplicables al uso de terapia celular corneal.

Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Este protocolo introdujo un método definido libre de células alimentadoras para diferenciar las células madre epiteliales limbares corneales de las células madre pluripotentes humanas. Las células madre epiteliales limbales son responsables de renovar el epitelial corneal en el ojo sano. El daño a estas células conduce a una condición conocida como deficiencia de células madre limbares, y a la pérdida de claridad corneal.Los métodos de cultivo celular que se muestran aquí permiten la producción eficiente de células madre epiteliales limbales para futuras terapias de reemplazo de células corneales. Para comenzar, pasaje y mantenga el cultivo de células madre pluripotentes humanos libres de alimentador como se describe en el protocolo de texto. Asegúrese de utilizar sólo células madre pluripotentes humanas de alta calidad como material de partida para las diferenciaciones.Cuando esté listo para inducir la formación del cuerpo embrionario, caliente todos los materiales y reactivos necesarios a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar. Separe las células madre pluripotentes humanas libres de alimentador a la suspensión añadiendo 500 microlitros de trippsina EDTA libre de xe

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

Se presenta un ejemplo de terapia génica adenoviral en las córneas diabéticas humanas cultivadas con órganos para la normalización de la cicatrización tardía de heridas y la expresión marcadamente reducida de marcadores de células madre epiteliales en estas córneas. También se describe la optimización de este proceso en cultivos epiteliales limbales enriquecidos con células madre.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

Este protocolo describe cómo producir células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) de células madre pluripotentes. El método utiliza una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para dirigir la diferenciación de células madre en RPE inmaduro en catorce días y RPE madura y funcional después de tres meses.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

Este protocolo detalla un método monocapa y libre de suero para generar eficientemente células similares a hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en 18 días. Esto implica seis pasos a medida que los hPSCs se diferencian secuencialmente en tipos celulares intermedios como la raya primitiva, el endodermo definitivo, los progenitores posteriores del antebrazo y del brote hepático antes de formar células similares a los hepatocitos.

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.

Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.

Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas

Aquí, presentamos un protocolo para aislar e identificar las células del nicho limbal humano.

Aislamiento e identificación de células de nicho limbal

Aquí presentamos un protocolo para obtener suspensiones unicelulares de alta calidad de córneas completas de ratón mediante digestión secuencial con colagénasa A y tripsina. Este método produce células individuales viables con alta integridad de ARN, haciéndolas compatibles con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN unicelular y el citometradory de flujo.

Un protocolo para la extracción de suspensión de célula única de córneas de ratón

Aprende a diferenciar células madre epiteliales limbales de células madre pluripotentes humanas sin células alimentadoras. Este método eficiente produce células de calidad clínica para terapias de reemplazo corneal.

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Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

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