Pinza de fuerza espectrométricas para la caracterización de Hidrogeles basados en proteínas

Las principales ventajas de esta técnica son que utiliza un PID, que es un sistema derivado integral proporcional para aplicar protocolos de fuerza controlada a muestras de hidrogel de proteínas, y utiliza un volumen de muestra pequeño. Los protocolos para la fijación de fuerzas permiten una interpretación directa de los datos, mientras que los volúmenes bajos son críticos cuando se trabaja con proteínas difíciles de producir que solo están disponibles en pequeñas cantidades. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo y la caracterización de nuevos materiales biométricos con elasticidad duradera, utilizando la transición de plegamiento hacia abajo y repliegue característica de las proteínas.

Este método puede responder a preguntas sobre la mecánica de tejidos y biomateriales al permitir las mediciones de miles de millones de moléculas de proteínas de una sola vez y simular entornos abarrotados específicos de los tejidos biológicos. Comience este procedimiento con la preparación de soluciones de reactivos como se describe en el protocolo de texto. Para sintetizar el hidrogel a base de proteínas, primero fije una aguja de calibre 23 en una jeringa de un mililitro con un émbolo prensado.

Luego, corta un tubo de politetrafluoroetileno, o PTFE, de 10 centímetros con una cuchilla de afeitar. Coloque la aguja y la jeringa en un extremo del tubo de PTFE. Inserte el segundo extremo del tubo en una solución de silano y llene el tubo retrayendo el émbolo de la jeringa.

Deje el tubo durante aproximadamente 30 minutos. A continuación, retire la solución de silano y seque el tubo con aire comprimido. Ahora, mezcle la solución de proteína con APS y cloruro de tris (bipiridina) rutenio (II) en un tubo de 1,5 mililitros usando una proporción de volumen constante.

Agite la solución fotoactiva hasta que se mezcle por completo. Luego, centrifuga la mezcla a máxima velocidad para eliminar las burbujas de la solución. Pueden formarse burbujas al cargar la mezcla fotoactiva de hidrogel en el tubo de teflón, lo que provoca daños en la muestra.

Para evitar la formación de burbujas, mantenga el extremo del tubo de teflón en la mezcla de solución durante el proceso de carga y retraiga el émbolo de la jeringa lentamente. Inserte el extremo abierto del tubo de PTFE tratado en la mezcla fotoactiva y extraiga la solución en el tubo retrayendo el émbolo de la jeringa. Ahora, coloque el tubo cargado aproximadamente a 10 centímetros de distancia de una lámpara de mercurio de 100 vatios para evitar que se caliente y manténgalo allí hasta 30 minutos a temperatura ambiente.

Retira el tubo de la aguja y corta los bordes del tubo cerca de los extremos del hidrogel con una cuchilla de afeitar. Luego, use una aguja desafilada de calibre 24 para extruir el hidrogel en la solución de Tris. Inspeccione visualmente los geles en busca de cualquier defecto que pueda formarse durante la extrusión o debido a burbujas y deseche los geles defectuosos.

Inicie el programa de control de instrumentos y encienda el motor de la bobina móvil. A continuación, establezca la posición de la bobina en un valor hacia el final del rango. Desplaza los ganchos en la dirección Z y alinéalos en la curva en la dirección X.

A continuación, registre los valores de los tornillos del micrómetro para la dirección X. Ahora, haz un nudo doble suelto en el extremo de la hebra de sutura, de modo que el diámetro del bucle sea de unos cuatro milímetros. Luego, corta el lazo de la hebra.

Repita para formar un segundo bucle. Luego, coloque los dos bucles en el gancho conectado al sensor de fuerza. Llene la cámara experimental con tampón Tris y transfiera la muestra de hidrogel a la cámara llena con pinzas médicas.

Coloque la bobina móvil y los ganchos del sensor de fuerza cerca de la superficie de la solución y alinee los ganchos en todas las direcciones con los manipuladores de posicionamiento XYZ. Con pinzas médicas, cuelgue ambos lados de la muestra de hidrogel de proteína en los ganchos conectados a la bobina móvil y al sensor de fuerza. Un error típico es un apriete excesivo de los bucles de sutura alrededor de las muestras de hidrogel durante el proceso de fijación.

Esto puede conducir a la formación de una muesca y al corte de la muestra de hidrogel. Apriete con cuidado un bucle de sutura alrededor de la muestra de hidrogel en el gancho de la bobina móvil sujetando ambos extremos del bucle de sutura con pinzas médicas y tirando de ellos simultáneamente. Repita este paso para el bucle conectado al sensor de fuerza.

Apriete los bucles de sutura en las curvas de cada gancho para evitar cualquier deslizamiento. Utilice estas curvas como puntos de referencia para encontrar la separación por cero entre los ganchos. Corta el exceso de longitud de las suturas con unas tijeras médicas.

Mueva el hidrogel adjunto usando manipuladores Z a lo largo del eje Z hacia la cámara experimental para sumergir el hidrogel en la solución experimental. Alinee la muestra de hidrogel en YZ usando los manipuladores de manera que el gel no esté bajo ninguna tensión. Ponga a cero el sensor de fuerza y separe los dos ganchos usando las etapas del micrómetro X hasta que el gel comience a experimentar fuerza.

Una vez que esto suceda, gire ligeramente hacia atrás el tornillo del micrómetro en la dirección X. Registre la posición de ambos manipuladores para el motor de la bobina móvil y el sensor. A continuación, utiliza la diferencia entre estos valores y los medidos anteriormente para calcular la separación exacta entre los ganchos de anclaje al principio del experimento.

Para realizar un ciclo de fuerza-rampa aumentando la fuerza a la velocidad de carga deseada, introduzca los valores de fuerza inicial y final, así como la duración del protocolo, que aparece como una V invertida, seguida de una fuerza baja constante durante unos 200 segundos para permitir que los dominios de proteínas se replieguen antes del siguiente ciclo. Realice un protocolo de fuerza constante aplicando una fuerza baja durante 30 segundos. A continuación, aumente la fuerza a una fuerza constante durante un período de tiempo definido, seguido de un enfriamiento de la fuerza al mismo valor bajo durante más de 300 segundos para permitir que los dominios de la proteína se replieguen y la elasticidad del gel se recupere.

Por último, realice el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Cada medición comienza con una curva de holgura. Al colocar dos líneas, se determina la fuerza cero en el sensor y la longitud real del gel.

La longitud real del gel se calcula a partir de la intersección de los ajustes y la posición de los tornillos micrométricos. El sistema de reometría de fuerza y sujeción puede aplicar dos tipos diferentes de protocolos. En el modo de rampa de fuerza, la muestra de hidrogel experimenta un protocolo de cambio de fuerza con el tiempo que se asemeja a un modo de fuerza constante V.In invertido, la tensión aplicada cambia en un patrón escalonado.

Durante las mediciones, el sistema PID ajusta la extensión del hidrogel cambiando la posición de la bobina para seguir el punto de ajuste predefinido del protocolo de fuerza. A continuación, la deformación se calcula dividiendo la extensión medida por la longitud real del gel. La tensión se determina dividiendo la fuerza aplicada al área de la sección transversal de la muestra de hidrogel.

Las trazas de Force Ramp se representan mejor como tensión frente a deformación. El módulo de Young se puede calcular a partir de la medición de la pendiente durante la fase de carga. La histéresis proporciona la disipación de energía proveniente del despliegue y repliegue de la proteína.

Las trazas de fuerza constante se representan mejor en función del tiempo. El cambio en la deformación se puede utilizar para medir las tasas de despliegue y repliegue ajustando un exponencial doble. Al intentar este procedimiento, es importante recordar secar el silano del tubo antes de agregar la proteína, centrifugar la mezcla de proteínas para eliminar las burbujas, revisar las burbujas después de inyectar la mezcla de proteínas dentro del tubo y desechar cualquier hidrogel dañado mecánicamente después de la extrusión del tubo.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio para unir los geles a los ganchos utilizando las suturas quirúrgicas sin causar daños a la muestra de hidrogel. Extruir el gel del tubo también puede dañar el hidrogel. Este método permite la aplicación de protocolos de fuerza constante en muestras de hidrogel de bajo volumen.

Estos experimentos permiten el desacoplamiento de los comportamientos elástico y viscoelástico y el estudio de la mecánica de despliegue y plegamiento de proteínas en un enfoque masivo. Tras su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores en el campo de las ciencias de los materiales explorar nuevos biomateriales blandos, como los hidrogeles basados en poliproteínas de ingeniería, que tienen un excelente potencial para servir como andamios de ingeniería de tejidos, sistemas de administración de fármacos y tinta biológica para la impresión 3D. Este método no solo proporciona información sobre la mecánica de los hidrogeles a base de proteínas, sino que también se puede aplicar a otros sistemas, como la medición de la respuesta isométrica de las fibras musculares o la elasticidad de tejidos como la piel.