Name: Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a modificar vectores de expresión de baculovirus para producir proteínas vegetales secretadas en células de insectos. Este método de bajo costo facilita la cristalización y el estudio de estructuras proteicas.

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Este trabajo fue apoyado por los nuevos fondos de inicio de la Facultad de la Universidad Estatal de Carolina del norte para Guozhou Xu.

Nota: Se utiliza un sistema de células de insecto/baculovirus con vectores de expresión modificada de expresión de la proteína secretora de la planta y la cristalización.
1. modificación de un Vector de expresión de Baculovirus con el péptido de señal GP67 para la expresión de la secreción de la proteína de planta
<ol><li>Sintetizar un fragmento de ADN que contiene una 5' BglII corte sitio13, la secuencia de señal GP67 secreción y un sitio de clonación múltiple con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI y XhoI (figura 1A). Nota: Puesto que BglII y BamHI digestión DNA dio lugar a los mismos fines de adhesivo, el vector linearizado puede ligar al fragmento de ADN digerido mientras la BglII y BamHI sitios en la secuencia de ligadura recocido se mutó a una secuencia que no es divisible por BglII o BamHI14.</li>
	<li>Resumen 4 μg del ADN con BglII y XhoI y 4 μg de un vector de expresión ADN con BamHI y XhoI14. Mezclar 10 unidades de cada enzima de restricción con el ADN en un 1 x de tampón de reacción concentración (acetato de potasio de 50 mM, 20 mM Tris acetato, acetato de magnesio de 10 m m y 100 μg/mL de BSA, pH 7.9 a 25 ° C) e incubar la mezcla a 37 ° C durante 4 horas.<ol>
<li>Purificar el fragmento de ADN suprimido y el vector linearizado ADN por un kit de la extracción del gel de ADN15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezcla 100 ng lineal del vector de la DNA con 400 ng de ADN digerido del fragmento en una mezcla de reacción de la ligadura de 10 μl que contiene 1 x buffer de reacción T4 ADN ligasa (50 mM Tris HCl, 10 mM MgCl2, ATP de 1 mM y 10 mM DTT, pH 7.5 a 25 ° C) y 5 unidades de la DNA de T4 ligasa. Incubar la mezcla de reacción a 16 ° C por 16 h.</li>
	<li>Transformar 5 μl de la mezcla de ligadura en 100 μl de células competentes DH5α siguiendo un protocolo de transformación estándar y seleccione las colonias resultantes en una ampicilina-LB agar placa16. Recoger 5-10 colonias y crecimiento de cada colonia en 2 mL de medio LB con ampicilina de μg/mL 100 a 220 rpm y 37 ° C en un incubador de agitación por 16 h.</li>
	<li>Extraer cada ADN plásmido con una DNA miniprep kit17 y confirmar los clones por la secuencia de la DNA con una cartilla de AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>Amplificar por PCR el gen de a. thaliana TDR fragmento codificación residuos 30-642 de un gen sintético de TDR construir (hacia delante la cartilla: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, primer revés: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplificar el ADN de 30 ciclos en un tampón de reacción de polimerasa de la DNA que contiene una mezcla de dNTP de 0,5 mM, cebadores de μm 0,2, 0,1 μg de plantilla de ADN, 0,4 mM MgCl2y 1 unidad de reacción de polimerasa de la DNA.<ol>
<li>Para los pasos del ciclo de PCR, establecer la desnaturalización inicial a 95 ° C por 30 s y luego de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C por 30 s, recocido a 55 ° C para 30 s y extensión a 72 ° C por 1 min, con una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digerir el fragmento de la polimerización en cadena y el vector modificado con enzimas de restricción endonucleasa NotI y BamHI. Ligar el fragmento del gen con el vector linearizado. Mezcla 100 ng lineal del vector de la DNA con 400 ng de ADN digerido del fragmento en una mezcla de reacción de la ligadura de 10 μl con T4 ADN ligasa reacción tampón y 5 unidades de ligase de la DNA de T4. Incubar la mezcla de reacción a 16 ° C por 16 h.</li>
	<li>Transformar 5 μl de la mezcla de ligadura en 100 μl de células competentes DH5α siguiendo un protocolo de transformación estándar y seleccione las colonias resultantes en una ampicilina-LB agar placa16. Para confirmar los clones correcta secuencia de la DNA.</li>
</ol>2. modificación de un Vector de expresión de Baculovirus con el péptido de señal Hemolin insectos para la expresión de la secreción de la proteína de planta
<ol><li>Sintetizar un fragmento de ADN que contiene una 5' BglII corte sitio13, la secuencia de la señal de secreción de insectos hemolin y un sitio de clonación múltiple con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI y XhoI (figura 1B).</li>
	<li>Resumen 4 μg del ADN con BglII y XhoI y 4 μg de un vector de expresión ADN con BamHI y XhoI14. Mezclar 10 unidades de cada enzima de restricción con el ADN en un 1 x de tampón de reacción concentración (acetato de potasio de 50 mM, 20 mM Tris acetato, acetato de magnesio de 10 m m y 100 μg/mL de BSA, pH 7.9 a 25 ° C) e incubar la mezcla a 37 ° C durante 4 horas.<ol>
<li>Purificar el fragmento de ADN suprimido y el vector linearizado ADN por un kit de la extracción del gel de ADN15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezcla 100 ng lineal del vector de la DNA con 400 ng de ADN digerido del fragmento en una mezcla de reacción de la ligadura de 10 μl que contiene 1 x buffer de reacción T4 ADN ligasa (50 mM Tris HCl, 10 mM MgCl2, ATP de 1 mM y 10 mM DTT, pH 7.5 a 25 ° C) y 5 unidades de la DNA de T4 ligasa. Incubar la mezcla de reacción a 16 ° C por 16 h.</li>
	<li>Transformar 5 μl de la mezcla de ligadura en 100 μl de células competentes DH5α y seleccione las colonias en una placa de agar LB ampicilina. Recoger 5-10 colonias y crecimiento de cada colonia en un medio LB de 2 mL conteniendo 100 μg/mL de ampicilina a 37 ° C en un incubador de agitación por 16 h y 220 rpm.</li>
	<li>Extraer ADN de plásmido con una DNA miniprep kit17 y confirmar los clones por la secuencia de la DNA con una cartilla de AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>Amplificar por PCR a. thaliana polen del Receptor quinasa 3 (PRK3) fragmento genético codificación de residuos 20-237 de una construcción de genes sintética PRK3 (hacia delante la cartilla: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, primer revés: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplificar el ADN de 30 ciclos en un tampón de reacción de polimerasa de la DNA que contiene una mezcla de dNTP de 0,5 mM, cebadores de μm 0,2, 0,1 μg de plantilla de ADN, 0,4 mM MgCl2y 1 unidad de reacción de polimerasa de la DNA.<ol>
<li>Para los pasos del ciclo de PCR, establecer la desnaturalización inicial a 95 ° C por 30 s y luego de 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C por 30 s, recocido a 55 ° C para 30 s y extensión a 72 ° C por 30 s cada ciclo y la extensión final a 72 ° C durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digerir el fragmento de la polimerización en cadena y el vector modificado con enzimas de restricción endonucleasa NotI y BamHI. Ligar el fragmento del gen con el vector linearizado. Mezcla 100 ng lineal del vector de la DNA con 400 ng de ADN digerido del fragmento en una mezcla de reacción de la ligadura de 10 μl con T4 ADN ligasa reacción tampón y 5 unidades de ligase de la DNA de T4. Incubar la mezcla de reacción a 16 ° C por 16 h.</li>
	<li>Transformar 5 μl de la mezcla de ligadura en 100 μl de células competentes DH5α siguiendo un protocolo de transformación estándar y seleccione las colonias resultantes en una ampicilina-LB agar placa16. Para confirmar los clones correcta secuencia de la DNA.</li>
</ol>3. producción y amplificación de Baculovirus construye albergando el casete de expresión de proteínas recombinantes
<ol><li>Uso 100 ng de plásmido construir transformar 40 μl de células competentes DH10Bac siguiendo el protocolo del sistema de expresión de baculovirus1. Incubar las placas a 37 ° C durante 48 h de transformación.</li>
	<li>Recoger dos colonias blancas de cada placa de transformación, inocular cada colonia en 2 mL de medio LB con kanamicina 50 de μg/mL, 7 gentamicina μg/mL y 10 μg/mL tetraciclina. Seguir el protocolo de los baculovirus expression sistema1 para extraer y verificar la bacmid de ADN. Alícuota cada DNA en dos tubos con 20 μl cada una y almacenar los tubos a-20 ° C. Nota: Los pasos siguientes requieren una operación aséptica.</li>
	<li>Crecer una monocapa de células Sf9 en los antibióticos de penicilina-estreptomicina de medios de cultivo con 10% suero bovino fetal (FBS) y 100 μg/mL (o 100 I.U./mL) a 27 ° C a 80% de confluencia en una placa de 6 pozos. Estimar el porcentaje de confluencia basado en el porcentaje de área cubierta en la placa de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Preparar las siguientes soluciones en dos tubos de centrífuga de 1,5 mL estéril.<ol>
<li>Tubo 1: Para cada transfección, diluir 20 μl de ADN bacmid en 100 μl de medio sin suplemento de cultivo de celular Sf9 sin antibióticos. Mezclar suavemente la dilución por sacudiendo el lado del tubo.</li>
		<li>Tubo 2: Para cada transfección, diluir 8 μl de reactivo de transfección de lípidos en 100 μl de medio sin suplemento de cultivo de celular Sf9 sin antibióticos. Homogeneizar la dilución transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para x 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinar las dos soluciones, mezclar suavemente transfiriendo lentamente hacia arriba y hacia abajo para x 3 e incubar por 20-40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave cada pocillo de la monocapa Sf9 células x 2 con 3 mL de medio sin suplemento de cultivo de celular Sf9 sin antibióticos. Para cada transfección, agregar 0,8 mL de medio sin suplemento de cultivo de celular Sf9 sin antibióticos a cada tubo que contiene la mezcla de lípidos-DNA. Mezclar suavemente el contenido de los tubos mediante pipeteo lentamente hacia arriba y hacia abajo para x 3. Aspire los medios de lavado de las placas y las muestras con la mezcla de la transfección del recubrimiento.</li>
	<li>Después de la adición de la mezcla de transfección, Incube la placa transfected de 5 horas a 27 ° C. Sustituir los medios de comunicación de la transfección con el completo Sf9 medio de cultivo celular que contenga 10% FBS y 100 μg/mL (o 100 I.U./mL) antibióticos de penicilina-estreptomicina. Incube la placa transfected a 27 ° C por 4 d.</li>
	<li>Cosecha y amplificar el baculovirus recombinante.<ol>
<li>Recoger el sobrenadante de la placa infectada en un tubo cónico de 15 mL estéril después de 4 d de incubación. Girar el sobrenadante a 1010 x g durante 5 min eliminar los restos celulares. Descarte el precipitado y decantar el sobrenadante a un tubo limpio y almacenar a 4 ° C hasta por 1 año. Nota: Este es el virus de P0. Puede ser alícuotas y almacenados a-80 ° C durante un tiempo.</li>
		<li>Para amplificar cada virus recombinante, crecer una monocapa de células Sf9 en una placa de 150 mm a 80% de confluencia. Aspire los medios de comunicación de la placa, añadir 2 mL del virus P0 el adherente de las células a la placa e Incube la placa durante 1 hora en un incubador de 27 ° C. Roca de la placa cada 15 minutos para mezclar el medio con las células.<ol>
<li>Añadir 25 mL de medios de la gracia completa que contiene 10% FBS y 100 μg/mL (o 100 I.U./mL) antibióticos de penicilina-estreptomicina. Incube la placa para 3 d en un incubador de 27 ° C para obtener el virus paso de P1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recoger el sobrenadante de la placa infectada en un tubo cónico estéril de 50 mL y centrifugado a 1010 x g durante 5 min eliminar los restos celulares. Decantar el sobrenadante a un tubo limpio y almacenar a 4 ° C hasta por 1 año. Nota: El virus P1 puede alícuotas y almacenados a-80 ° C durante un tiempo.</li>
		<li>Para amplificar el virus desde P1 a P2 paso, crecer una monocapa de células Sf9 en una placa de 150 mm a 90% de confluencia, aspirar los medios de comunicación de la placa, agregar 2 mL del virus P1 a la placa e incubar durante 1 h en un incubador de 27 ° C.</li>
		<li>Repita los pasos 3.8.2 y 3.8.3 para obtener los pasajes P2 y P3 de los virus. No guarde el virus P3 por más de 2 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. proteína expresión, purificación y NiNTA, cristalización
<ol><li>1 L de Hi5 células de los insectos en los antibióticos de penicilina-estreptomicina de medios de cultivo con 100 μg/mL (o 100 I.U./mL) a una densidad de 2 x 106 a 100 rpm en un agitador incubador de 27 ° C de la cultura. Desactivación de las células a 570 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante, resuspender las células en 20 mL de los virus recién producidos de P3 y mantenerlo a temperatura ambiente por 1 h. Agite suavemente la botella de vuelta para resuspender las células 1 x cada 15 min.</li>
	<li>Transferir las células a 1 L de medio de cultivo con 100 μg/mL (o 100 I.U./mL) antibióticos de penicilina-estreptomicina, cultura de las células a 100 rpm en una coctelera de la incubadora de 27 ° C por 72 h. vuelta hacia abajo de las células a 1.010 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante.</li>
	<li>Tiras indicadoras de pH de uso para ajustar el pH del sobrenadante a 8.0 mediante la adición de 0.1 M HCl o 0,1 M NaOH y añadir el tampón de unión a una concentración final, conteniendo 20 mM de tampón Tris pH 8.0, 100 mM NaCl y el imidazol de 5 mM. Añadir una cierta cantidad de resina NiNTA (10-40 mL) basada en el rendimiento estimado de la proteína recombinante expresada su etiquetado.<ol>
<li>Mezcle la solución en una agitación magnética con velocidad baja a 4 ° C por 1 h. lavar la resina y eluir la proteína encuadernada siguiendo el estándar de protocolo de purificación de NiNTA18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conforme la proteína purificada a intercambio iónico y cromatografía de filtración, así como otros métodos de purificación de proteínas, para obtener una muestra homogénea del gel. Nota: Para el ectodominio TDR, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl fueron utilizados como búfer de filtración de gel. Para PRK3 ectodominio, bis-20 mM de Tris, pH 6, 100 mM NaCl fueron utilizados como el búfer de filtración recomendado: gel.</li>
</ol>

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<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor%2C+DORN1%2C+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+BIology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Dada la diversidad de tamaño y estabilidad de los miles de proteínas presentes en los sistemas biológicos, a menudo es empírica para la investigación de un laboratorio para decidir qué sistema de expresión heteróloga debe elegirse para la expresión de una proteína específica. El sistema de expresión de e. coli es a menudo la primera opción para la expresión de la proteína debido al corto ciclo de vida de las bacterias, bajo costos de los medios de cultivo y la relativa facilidad para escalar19<...

Es imprescindible para un laboratorio de investigación ser capaces de producir grandes cantidades de proteínas recombinantes homogéneas para caracterizaciones bioquímicas y biofísicas, especialmente para estudios cristalográficos de rayos x. Existen muchos sistemas de expresión heteróloga bien establecido como Escherichia coli, levaduras, células de los insectos, células de mamíferos, células de la planta, etc. entre ellos, el sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los más usan técnicas para producir grandes cantidades de proteínas eucarióticas recombinantes gran tamaño estructural plegadas para la cristalización de proteínas1.
Los vectores de expresión del sistema de expresión de baculovirus se han diseñado para contener una fuerte polyhedrin o promotor de P10 para producir un alto rendimiento de proteínas recombinantes intracelular2,3. Para hacer un baculovirus recombinante, se clona el gen de interés en un insecto vector que contiene el locus polyhedrin (polh) del genoma de nucleopolyhedroviral múltiple de Autographa californica . La construcción resultante luego se ordena y se verifica su marco correcto de lectura abierta (ORF). La construcción correcta es entonces introducida en la célula de insecto huésped a través del proceso de transfección. El gen de interés se inserta en el genoma viral por recombinación homóloga. Este evento resulta en la producción del genoma viral recombinante, que luego se replica en producir recombinantes reverdeció de partículas de virus1.
Las células de los insectos que comúnmente se utilizan en el sistema de expresión son Sf9 y cinco celdas (Hi5). Las células SF9 son un aislamiento clonal de Sf21, derivado de las células ováricas pupas de Spodoptera frugiperda, y células de Hi5 un aislamiento clonal derivado de la parental Trichoplusia ni ovárico de la célula línea TN-3684,5. Transfecciones Co, amplificación virus y ensayos de placa se llevan a cabo en las células Sf9, mientras que las células Hi5 típicamente se seleccionan para producir mayores cantidades de proteínas recombinantes6. Cabe destacar que las células de Hi5 no son adecuadas para la generación y amplificación de progenie del virus debido a su tendencia a producir virus mutantes. Tradicionalmente, un rango de temperatura de 25-30 ° C se considera buena para el cultivo de células de los insectos. Sin embargo, se ha reportado que 27-28 ° C es la temperatura óptima para el insecto célula crecimiento e infección7,8.
La introducción de una secuencia de señal fuerte precede el gene es necesario para la alta expresión de las proteínas secretadas. La secuencia de la señal guía eficientemente la proteína recombinante traducida en el retículo endoplásmico para la secreción de proteínas y modificaciones postraduccionales necesarias para el plegamiento correcto y estabilización3. Secuencias de péptidos de señal, tales como el baculovirus envuelven proteína GP64/67, abeja melitina y otros, han sido elegidas para facilitar la expresión de proteínas recombinantes secretores en los sistemas de expresión de baculovirus-mediada3. La introducción del péptido señal de GP67 ha demostrado para mejorar el rendimiento de la expresión de una proteína recombinante secretada, en comparación con usando el péptido señal intrínseca del objetivo gen9. Hemolin es una proteína de la hemolinfa de la polilla de seda gigante Hyalophora cecropia, inducida por bacterias infección10. Debido al relativamente alto nivel de expresión inducida, puede utilizarse la secuencia del péptido de señal del gen para mediar en la expresión de la secreción de proteínas recombinantes en el sistema de células de insecto baculovirus.
La a. thaliana Tracheary elementos diferenciación inhibidor Factor Receptor (TDR) y el polen del Receptor quinasa 3 (PRK3), ambos pertenecen a la Leucine-rich Repeat Receptor-como Kinase (LRR-RLK) familia de proteínas11,12 . Para estudiar la estructura y la función de esta familia de receptores proteínas vegetales, así como para facilitar la caracterización bioquímica y estructural de otras proteínas vegetales secretada, se ha modificado el sistema de expresión de baculovirus-insecto célula a mejorar el rendimiento de producción y calidad de proteína. Los dominios extracelulares de TDR y PRK3 se han expresado con éxito mediante dos vectores de expresión modificada en el sistema de expresión de células de insecto baculovirus. Tanto los dominios extracelulares de proteínas TDR y PRK3 han se ha cristalizado. Este artículo divulga la expresión y purificación de grandes cantidades de proteínas recombinantes secretadas planta con vectores de expresión de baculovirus modificados dos incorporando un GP67 o una secuencia de señal hemolin entre el promotor y múltiples sitios.

<table><tbody><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>VWR</td><td>Modelo Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>Modelo 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>BECKMAN</td><td>Modelo J-6</td><td>con rotor de cangilón oscilante</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>para la amplificación por PCR del ADN</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BIO-RAD</td><td>Modelo C1000 Touch</td><td>Para la amplificación por PCR del ADN</td></tr><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model I 24</td><td>Para el cultivo de baceria</td></tr><tr><td>Síntesis de ADN del cliente</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Endonucleasa de restricción</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Endonucleasa de restricción</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Restricción Endonucleasa</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Restricción Endonucleasa</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td> New <td>England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Ligadura de ADN</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Kit de extracción</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Purificación de ADN a partir de gel Agorase</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen</td><td></td><td>27104</td><td>Purificación de ADN plasmídico a partir de cultivo de bacterias</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Para electroferosis en gel de ADN</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH5&alpha; célula competente</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Para la transformación de la mezcla de ligadura de ADN</td></tr><tr><td>Lennox L LB Caldo</td><td>Producto de investigación International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Para el cultivo de bacterias</td></tr><tr><td>Ampicilina sódica Sal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Sulfato de Kanamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>MAX Efficiency Células competentes DH10Bac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Para la fabricación de bacmid DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Para la transformación del ADN</td></tr><tr><td>Reactivo CellFECTIN II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Reactivo de transfección de células de insectos</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Expression System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016 Kit de</td><td>expresión de células de insectos Baculovirus</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Para el aislamiento de células de Bacmid DNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Para el aislamiento de células Bacmid DNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Vector de expresión de Baculorirus</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Células monocapa Sf9</td></tr><tr><td>Células Hi5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five células de insectos</td></tr><tr><td>Grace' s medio de insecto, sin suplementar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 transfección de células medio mínimo</td></tr><tr><td>Grace' s medio para insectos, suplementado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 medio completo de cultivo celular monocapa</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 medio de cultivo celular en suspensión sin FBS</td></tr><tr><td>Express Five SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10.000 U.I./ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Certificado FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Placas de fondo plano</td></tr> de <tr><td>150 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/caja</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 tubos/bolsa</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos cónicos con tapón de rosca de 15 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 tubos/bolsa</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos con tapón de rosca cónico de 50 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 tubos/bolsa</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Tiras indicadoras de pH de</td> resina NiNTA <td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

modificación de vectores de expresión de baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Ha sido un reto para los científicos expresar proteínas recombinantes de eucariotas secretores para estudios estructurales y bioquímicos. El sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los sistemas utilizados para expresar proteínas secretoras eucarióticas recombinantes con algunas modificaciones poste-de translación. Las proteínas secretoras que deba canalizarse a través de las vías secretoras de glycosylation de la proteína, formación de enlaces disulfuro y otras modificaciones poste-de translación. Para mejorar la expresión de células de insectos existentes de proteínas secretoras de vegetales, un vector de expresión de baculovirus se modifica por la adición de un GP67 o una secuencia de péptido señal hemolin entre el promotor y la clonación de múltiples sitios. Este sistema de nuevo diseño vector modificado había producido con éxito un alto rendimiento de proteínas de receptor soluble recombinante planta secretada de Arabidopsis thaliana. Dos de las proteínas de la planta expresada, los dominios extracelulares de los receptores de membrana plasmática de Arabidopsis TDR y PRK3, se cristalizaron para estudios cristalográficos de rayos x. El sistema vector modificado es una herramienta mejorada que potencialmente puede ser utilizada para la expresión de proteínas recombinantes secretores en el reino animal también.

Como se muestra en la figura 1, se utilizaron dos vectores de expresión de baculovirus modificados pFastBac1 para expresar las proteínas secretadas con la GP67 o la secuencia de señal hemolin para reemplazar la secuencia de la señal intrínseca de la gene de la blanco. GP67 viral y los genes de insectos hemolin han demostrado tener niveles de expresión de alta secreción en las células. Se espera que las proteínas de fusión con cualquiera de estas dos secuencia...

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica y la biología estructural de las proteínas secretadas, como la determinación de la estructura de las proteínas mediante cristalografía y crio-EM. La principal ventaja de esta técnica es que produce una gran cantidad de proteínas secretadas recombinantes con un costo relativamente bajo para la determinación de la estructura de la proteína. Primero, sintetizar un fragmento de ADN que contenga un sitio de corte de BglII de cinco primos, la secuencia de señal de secreción de interés en un sitio de clonación múltiple como se describe en el protocolo de texto.A continuación, digiere cuatro microgramos de ADN con BglII y X1, y cuatro microgramos de un vector de expresión de ADN con BamH1 y X1. Mezcle 10 unidades de cada enzima de restricción con el ADN en un tampón de reacción de concentración 1X. Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Agregue 10 microlitros de una mezcla de reacción de ligadura que contenga 1X tampón de reacción de ADN ligasa T4 y cinco unidades de ADN ligasa T4 a un tubo Eppendorf nuevo de 1,5 mililitros.A continuación, añade 100 nanogramos del ADN vectorial linealizado y 400 nanogramos del fragmento de ADN digerido. Incubar a 16 grados centígrados durante 16 horas. Transforme cinco microlitros de la mezcla de ligadura en 100 microlitros de células alfa DH5 competentes y seleccione las colonias resultantes en una placa de agar ampicilina LB como se describe en el protocolo de texto.Elija entre cinco y 10 colonias, transfiriendo cada una a dos mililitros de medio LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Cultive estas colonias en una incubadora agitadora a 220 rpm a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de esto, use un kit de minipreparación de ADN para extraer cada ADN plasmídico.Confirme los clones por secuenciación de ADN con un cebador de secuenciación directa como se describe en el protocolo de texto. Usando 100 nanogramos del plásmido de construcción, transforme 40 microlitros de células competentes DH10Bac como se describe en el protocolo de texto. Incubar las placas de transformación a 37 grados centígrados durante 48 horas.Recoja dos colonias blancas de cada placa de transformación e inocule cada colonia en dos mililitros de medio LB que contenga kanamicina, gentamicina y tetraciclina. Extraiga y verifique el ADN bacmid como se describe en el protocolo de texto. Alícuota cada ADN en dos tubos con 20 microlitros que se transfieren a cada tubo.Luego guarde los tubos a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para continuar. Todos los pasos posteriores deben realizarse de forma aséptica. En una placa de seis pocillos, cultive una monocapa de células Sf9 en el medio de cultivo con 10% de suero bovino fetal y 100 microgramos por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina a 27 grados Celsius a 80% de confluencia.Para cada transfección, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular Sf9 no suplementado sin antibióticos a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Diluya 20 microlitros de ADN de bacmid en cada tubo y agite suavemente para mezclar. A continuación, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular Sf9 no suplementado sin antibióticos a un tubo de 1,5 mililitros para cada transfección.Diluya ocho microlitros de reactivo de transfección de lípidos en cada tubo y mezcle pipeteando minuciosamente hacia arriba y hacia abajo seis veces. Combine estas dos soluciones y mézclelas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces. Incubar durante 20 a 40 minutos a temperatura ambiente.Lave cada pocillo de la placa de cultivo dos veces con tres mililitros de medio de cultivo Sf9 sin suplementos sin antibióticos para cada lavado. A continuación, añada 0,8 mililitros de medio de cultivo celular Sf9 no suplementado sin antibióticos a cada tubo que contenga la mezcla de ADN lipídico. Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar.Aspire los medios de lavado de las placas y superponga las muestras con la mezcla de transfección. Incubar la placa transfectada durante cinco horas a 27 grados centígrados. Después de esto, reemplace el medio de transfección con el medio de cultivo celular Sf9 completo que contiene 10% de FBS y 100 microgramos por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina.Incubar a 27 grados centígrados durante cuatro días. A continuación, recoja el sobrenadante en un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Girar a 1.010 veces g durante cinco minutos para eliminar los restos de la celda.Deseche el pellet y decante el sobrenadante en un tubo limpio. Almacene a cuatro grados centígrados hasta por un año o hasta que esté listo para usar. Para amplificar cada virus recombinante, primero cultive una monocapa de células Sf9 en una placa de 150 milímetros hasta un 80% de confluencia.A continuación, aspire el medio y añada dos mililitros del virus P0 a cada pocillo. Incubar durante una hora en una incubadora a 27 grados centígrados, meciendo la placa cada 15 minutos para mezclar el medio con las células. A continuación, agregue 25 mililitros de Grace's Media completo que contenga 10% de FBS y 100 microgramos por mililitro de antibióticos Penicilina-Estreptomicina.Incubar la placa durante tres días en una incubadora a 27 grados centígrados para obtener el virus de paso P1. Después de esto, recoja el sobrenadante en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Girar a 1.010 veces g durante cinco minutos para eliminar los restos de la celda.Decantar el sobrenadante en un tubo limpio y almacenarlo a cuatro grados centígrados hasta por un año o hasta que esté listo para usar. Para amplificar el virus del paso de P1 a P2, primero cultive una monocapa de células Sf9 en una placa de 150 milímetros hasta un 90% de confluencia. Una vez alcanzada la confluencia deseada, aspirar el medio.Agregue dos mililitros del virus P1 e incube durante una hora en una incubadora a 27 grados centígrados. Repita los pasos de amplificación para obtener los pasajes P2 y P3 del virus. En este estudio, se utilizan dos vectores de expresión de baculovirus pFastBac1 modificados para expresar las proteínas secretadas con la secuencia de señal gp67 o hemolina reemplazando la secuencia de señal intrínseca del gen diana.El PBEC gp67 se utiliza con éxito para expresar los dominios extracelulares del receptor a-thal-leano TDR. Mientras que la hemolina PBEC1 se utiliza con éxito para expresar el dominio extracelular PRK3. A continuación, las proteínas purificadas se concentran a cinco miligramos por mililitro y se someten a un cribado de cristalización.Las condiciones que produjeron cristales preliminares para cada proteína se optimizan hasta que se observan cristales de proteína mayores de 20 micrómetros. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que examinan la calidad de las proteínas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz multiángulo y otros ensayos para el estado de no agregación de la proteína recombinante. No olvide, comprobar la pureza de la proteína también mediante tinción de plata.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cristalografía de rayos X y la crio-EM para responder a preguntas adicionales, como las estructuras tridimensionales de la proteína producida. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran las propiedades estructurales, funcionales y bioquímicas de las proteínas secretadas por plantas y mamíferos. No olvide que trabajar con luz ultravioleta para visualizar las bandas de ADN en el gel de agarosa puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de protecciones UV, protector facial, gafas protectoras y bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.Además, al hacer tampones, tenga cuidado al manipular ácidos y bases fuertes.

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Research

Investigación

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Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

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