Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica y la biología estructural de las proteínas secretadas, como la determinación de la estructura de las proteínas mediante cristalografía y crio-EM. La principal ventaja de esta técnica es que produce una gran cantidad de proteínas secretadas recombinantes con un costo relativamente bajo para la determinación de la estructura de la proteína. Primero, sintetizar un fragmento de ADN que contenga un sitio de corte de BglII de cinco primos, la secuencia de señal de secreción de interés en un sitio de clonación múltiple como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, digiere cuatro microgramos de ADN con BglII y X1, y cuatro microgramos de un vector de expresión de ADN con BamH1 y X1. Mezcle 10 unidades de cada enzima de restricción con el ADN en un tampón de reacción de concentración 1X. Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Agregue 10 microlitros de una mezcla de reacción de ligadura que contenga 1X tampón de reacción de ADN ligasa T4 y cinco unidades de ADN ligasa T4 a un tubo Eppendorf nuevo de 1,5 mililitros.

A continuación, añade 100 nanogramos del ADN vectorial linealizado y 400 nanogramos del fragmento de ADN digerido. Incubar a 16 grados centígrados durante 16 horas. Transforme cinco microlitros de la mezcla de ligadura en 100 microlitros de células alfa DH5 competentes y seleccione las colonias resultantes en una placa de agar ampicilina LB como se describe en el protocolo de texto.

Elija entre cinco y 10 colonias, transfiriendo cada una a dos mililitros de medio LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Cultive estas colonias en una incubadora agitadora a 220 rpm a 37 grados centígrados durante 16 horas. Después de esto, use un kit de minipreparación de ADN para extraer cada ADN plasmídico.

Confirme los clones por secuenciación de ADN con un cebador de secuenciación directa como se describe en el protocolo de texto. Usando 100 nanogramos del plásmido de construcción, transforme 40 microlitros de células competentes DH10Bac como se describe en el protocolo de texto. Incubar las placas de transformación a 37 grados centígrados durante 48 horas.

Recoja dos colonias blancas de cada placa de transformación e inocule cada colonia en dos mililitros de medio LB que contenga kanamicina, gentamicina y tetraciclina. Extraiga y verifique el ADN bacmid como se describe en el protocolo de texto. Alícuota cada ADN en dos tubos con 20 microlitros que se transfieren a cada tubo.

Luego guarde los tubos a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para continuar. Todos los pasos posteriores deben realizarse de forma aséptica. En una placa de seis pocillos, cultive una monocapa de células Sf9 en el medio de cultivo con 10% de suero bovino fetal y 100 microgramos por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina a 27 grados Celsius a 80% de confluencia.

Para cada transfección, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular Sf9 no suplementado sin antibióticos a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Diluya 20 microlitros de ADN de bacmid en cada tubo y agite suavemente para mezclar. A continuación, agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular Sf9 no suplementado sin antibióticos a un tubo de 1,5 mililitros para cada transfección.

Diluya ocho microlitros de reactivo de transfección de lípidos en cada tubo y mezcle pipeteando minuciosamente hacia arriba y hacia abajo seis veces. Combine estas dos soluciones y mézclelas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces. Incubar durante 20 a 40 minutos a temperatura ambiente.

Lave cada pocillo de la placa de cultivo dos veces con tres mililitros de medio de cultivo Sf9 sin suplementos sin antibióticos para cada lavado. A continuación, añada 0,8 mililitros de medio de cultivo celular Sf9 no suplementado sin antibióticos a cada tubo que contenga la mezcla de ADN lipídico. Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar.

Aspire los medios de lavado de las placas y superponga las muestras con la mezcla de transfección. Incubar la placa transfectada durante cinco horas a 27 grados centígrados. Después de esto, reemplace el medio de transfección con el medio de cultivo celular Sf9 completo que contiene 10% de FBS y 100 microgramos por mililitro de antibióticos penicilina-estreptomicina.

Incubar a 27 grados centígrados durante cuatro días. A continuación, recoja el sobrenadante en un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Girar a 1.010 veces g durante cinco minutos para eliminar los restos de la celda.

Deseche el pellet y decante el sobrenadante en un tubo limpio. Almacene a cuatro grados centígrados hasta por un año o hasta que esté listo para usar. Para amplificar cada virus recombinante, primero cultive una monocapa de células Sf9 en una placa de 150 milímetros hasta un 80% de confluencia.

A continuación, aspire el medio y añada dos mililitros del virus P0 a cada pocillo. Incubar durante una hora en una incubadora a 27 grados centígrados, meciendo la placa cada 15 minutos para mezclar el medio con las células. A continuación, agregue 25 mililitros de Grace's Media completo que contenga 10% de FBS y 100 microgramos por mililitro de antibióticos Penicilina-Estreptomicina.

Incubar la placa durante tres días en una incubadora a 27 grados centígrados para obtener el virus de paso P1. Después de esto, recoja el sobrenadante en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Girar a 1.010 veces g durante cinco minutos para eliminar los restos de la celda.

Decantar el sobrenadante en un tubo limpio y almacenarlo a cuatro grados centígrados hasta por un año o hasta que esté listo para usar. Para amplificar el virus del paso de P1 a P2, primero cultive una monocapa de células Sf9 en una placa de 150 milímetros hasta un 90% de confluencia. Una vez alcanzada la confluencia deseada, aspirar el medio.

Agregue dos mililitros del virus P1 e incube durante una hora en una incubadora a 27 grados centígrados. Repita los pasos de amplificación para obtener los pasajes P2 y P3 del virus. En este estudio, se utilizan dos vectores de expresión de baculovirus pFastBac1 modificados para expresar las proteínas secretadas con la secuencia de señal gp67 o hemolina reemplazando la secuencia de señal intrínseca del gen diana.

El PBEC gp67 se utiliza con éxito para expresar los dominios extracelulares del receptor a-thal-leano TDR. Mientras que la hemolina PBEC1 se utiliza con éxito para expresar el dominio extracelular PRK3. A continuación, las proteínas purificadas se concentran a cinco miligramos por mililitro y se someten a un cribado de cristalización.

Las condiciones que produjeron cristales preliminares para cada proteína se optimizan hasta que se observan cristales de proteína mayores de 20 micrómetros. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que examinan la calidad de las proteínas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión de luz multiángulo y otros ensayos para el estado de no agregación de la proteína recombinante. No olvide, comprobar la pureza de la proteína también mediante tinción de plata.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la cristalografía de rayos X y la crio-EM para responder a preguntas adicionales, como las estructuras tridimensionales de la proteína producida. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran las propiedades estructurales, funcionales y bioquímicas de las proteínas secretadas por plantas y mamíferos. No olvide que trabajar con luz ultravioleta para visualizar las bandas de ADN en el gel de agarosa puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de protecciones UV, protector facial, gafas protectoras y bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.

Además, al hacer tampones, tenga cuidado al manipular ácidos y bases fuertes.